The authors acknowledge financial support from the Victorian Government&#8217;s Operational Infrastructure Support Program.

ملاحظة: المشيمة ينبغي جمع من الحمل صحية مفردة، مع تفضيل أقسام المدى القيصرية الاختيارية. مكتوبة، ينبغي إيلاء الموافقة المسبقة لجمع المشيمة عند هؤلاء النساء. ينبغي للجنة أخلاقيات البحث الإنسان الخاص ذات الصلة موافقة جميع عمليات جمع واستخدام الأنسجة البشرية. 1. عزل الخلايا الظهارية السلى <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المشيمة على سطح معقمة داخل خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام هانكس معقمة محلول ملحي متوازن (HBSS)، وغسل الكثير من الدم ممكن من سطح المشيمة والأغشية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع المشيمة وضعت مع الحبل السري تواجه تصل، فصل ميكانيكيا الحافة الخارجية للالسلى والمشيمه الأغشية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة فصل، تجريد يدويا غشاء السلى من غشاء المشيمه من المشيمة، والعمل حول حافة الغشاء، نحو الحبل السري. ملاحظة: كن carefالمجاهدين لإزالة أي قطعة من تلوث غشاء المشيمه من السلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص العقيمة، وقطع غشاء السلى يقرب من 2 سم من قاعدة الحبل السري ومكان في 500 مل مختومة حاوية تحتوي على 250 مل HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل جيدا عن طريق هز زجاجة مغلقة تحتوي على غشاء السلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غشاء السلى من حاويات خاصة لجمع باستخدام ملقط معقم، والمكان إلى 15 سم طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع غشاء السلى إلى قطع ما يقرب من 5 سم طويلة (عندما عقدت رأسيا مع ملقط)، ونبذ قطع الدموية أو تمزقها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في 500 مل مختومة الحاويات ويغسل مع 250 مل HBSS حوالي 3-5 مرات أو حتى يصبح غشاء السلى شفافة مع عدم وجود الدم الملوثة. ملاحظة: أي الحاضر الدم قد يقلل من كفاءة الهضم الأنزيمي الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل قطعة من غشاء السلى في وعاء يحتوي على 50 مل من الأنزيمية الهضم حل، مع الحرص علىتقليل المرحل من HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان القطع السلى في الأنزيمية الهضم حل في حمام مائي أو غرفة دافئة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف لإزالة أي الدم المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قطع غشاء السلى من الأنزيمية الهضم حل وضعها في وعاء معقم جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من الأنزيمية جديدة هضم حل للغشاء السلى واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حمام مائي أو غرفة دافئة مع طيف والهز (الهضم الأول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السلى قطع الغشاء ووضع في جديدة الرعاية أخذ حاوية للسماح للهضم الأنزيمية حل لاستنزاف من كل قطعة من الغشاء. ملاحظة: ويمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب القطع السلى على طول الحافة الداخلية للحاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 مل من الأنزيمية جديدة هضم حل للالسلى قطع الغشاء واحتضان 60 دقيقة في حمام مائي أو غرفة دافئة عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف (الهضم الثاني). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير suspensi خليةعلى من الخطوة 1.14 من خلال مرشح 70 ميكرون والطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتجاهل طاف، و resuspend بيليه خلية في 4 مل HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع ماصة 1 مل للحصول على تعليق خلية واحدة. ملاحظة: في هذه المرحلة الخلايا يمكن أن تترك على الجليد حتى الخلايا من هضم الثاني هي في نفس المرحلة من المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السلى قطع الغشاء ووضع في جديدة الرعاية أخذ حاوية للسماح للهضم الأنزيمية حل لاستنزاف من كل قطعة من الغشاء. ملاحظة: ويمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب القطع السلى على طول الحافة الداخلية للحاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير تعليق الخلية من الخطوة 1.18 من خلال مرشح 70 ميكرون والطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وتجاهل طاف، و resuspend بيليه خلية في 4 مل HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع 1 مل صipette للحصول على تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا تجمع من اثنين من هضم أو بدلا من ذلك الحفاظ على هضم خلية فصل حتى بعد عدد الخلايا. ملاحظة: هذا يمنع الاختلاط الخلايا الجدوى يحتمل أن تكون منخفضة مع الخلايا قابلية عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة HBSS إلى الحجم النهائي من 10-20 مل وتنفيذ عدد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق لقياس قدرتها على البقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد النمط الظاهري الخلايا الظهارية بواسطة التدفق الخلوي. تشكل الكوكتيلات الأجسام المضادة المناسبة استخدام الألغام المضادة للEpCAM-PE (1: 2 التخفيف) لمكافحة CD90-PeCy5 (1: 250) ومكافحة CD105-APC (1: 100) في HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend مجموعة فرعية من الخلايا من واحد أو كلا هضم في كوكتيل الأجسام المضادة بتركيز 25 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالتدفق الخلوي، وصمة عار 1 × 10 6 خلايا مع الكوكتيلات الأجسام المضادة التي تحتوي على الضوابط نمط إسوي (على سبيل المثال. ضبط PE مفتش 1 + نمط إسوي مكافحة CD90-PeCy5 + مكافحة CD105-APC). إبقاء ~ 1 × 10 6 خلايا غير ملوثين لتدفق عداد الكريات انشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في الجسم المضادالكوكتيلات في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3X في HBSS و resuspend كل 5 إلى 10 مليون خلية لكل مليلتر عن التدفق الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التدفق الخلوي والنتائج المذكرة. ومن المتوقع أن يكون 90-95٪ و&lt;1٪ على التوالي نقاء عزل الخلية (نسبة EpCAM إيجابي وCD90 / CD105 خلايا السلبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخصيص عدد مناسب من الخلايا لاختبار المعايير المناسبة لمراقبة الجودة أو الإفراج على النحو الذي يحدده التطبيق النهائي. ملاحظة: يمكن أن يتضمن هذا المرض / الفحص الفيروسي، أو السلامة الأخرى أو المعايير البيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على الخلايا المتبقية، متابعة بروتوكول الحفظ بالتبريد، أو بدلا من وضع مباشرة في ثقافة (المباشرة للثقافة الخطوة 3.6). </li></ol> 2. الحفظ بالتبريد من hAECs <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام التدفق الخلوي البيانات أو العد والفرز اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلية في resuspendالصورة بين 1-10٬000٬000 خلايا لكل مل في الحيوانات خالية من المنتج الإعلامي الحفظ بالتبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة حجم مناسب من الخلايا في قارورة الحفظ بالتبريد-الحلقية O والمكان الى جهاز معدل تجميد تسيطر عليها حيث يحدث التبريد في حوالي 1 ° C / دقيقة حتى -80 درجة يتحقق C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل قوارير في النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل. </li></ol> 3. ذوبان وثقافة Cyropreserved hAECs <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قارورة الحفظ بالتبريد من النيتروجين السائل ووضع على الجليد. ملاحظة: بالنسبة للنقل فقط - المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قارورة الحفظ بالتبريد بسرعة عند 37 درجة مئوية حتى فقط قطعة صغيرة (~ 5 مم × 5 مم) من يبقى الجليد. ملاحظة: من المهم أن الحل الخلية لا الحارة للحد من الآثار السامة للDMSO في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد 10 أضعاف مع الباردة (~ 4 ° C) خالية من المصل وسائل الإعلام، وأضاف الإفلات من الحكمة في حجم مناسبد أنبوب أو حاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في المصل خالية المتوسطة، إلى تركيز تقريبي من 1 مليون خلية لكل مليلتر. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام الفرز الآلي أو اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق. ويتوقع بقاء بعد ذوبان الجليد يكون 5-10٪ أقل من الجدوى قبل الحفظ بالتبريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا على القياسية خلية المعالجة الثقافة البلاستيك وير، أو بدلا من ذلك استخدام النوع الأول الكولاجين على الأسطح الثقافة معطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمن النوع الأول الكولاجين طلاء اتباع البروتوكول التالي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير حامض للذوبان النوع الأول الكولاجين من المشيمة البشرية (15 ملغ الكولاجين مع 25 مل من الماء منزوع الأيونات و 50 ميكرولتر حمض الخليك الجليدي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الكأس مع بارافيلم ويقلب باعتدال عند 37 درجة مئوية حتى تذوب خيوط الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معقم حل مرشح الكولاجين باستخدام فلتر 0.22 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تصفيتها الكولاجين 1:10 الأسهم مع الماء منزوع الأيونات. هذا المخزون المخفف هو العمل بغية دراسته واقرارهحل ntration للأسطح طلاء من البلاستيك والغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكولاجين البلاستيك معطف، والزجاج، وغشاء الأسطح لمدة 2 ساعة على RT عند 37 درجة مئوية، أو O / N في 2-8 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السوائل الزائدة من السطح المطلي، واتركه حتى يجف O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع زراعة الأنسجة المياه الصف معقمة أو HBSS قبل إدخال الخلايا والمتوسطة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hAECs لوحة في مناطق ذات كثافة من 25،000 خلية / سم 2 في المصل خالية المتوسطة، والسماح التعلق تحدث عن 72-96 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد التعلق، وتغيير وسائل الإعلام بواسطة الشفط بعناية واستبدالها مع حجم مناسب من المصل خالية المتوسطة كل 2-3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا مرور باستخدام بروتوكول أدناه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام ثقافة الخلية وتغسل مع حجم 1X من معقم HBSS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم 1X من الأنزيمية الهضم الحل واحتضان لمدة 5-15 دقيقة، أو حتى خلايا لوحظ فصل من سطح ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأنزيمية الهضم محلول يحتوي على الخلايا، وضمان مLLS يتم فصل من سطح ثقافة الخلية بواسطة pipetting مرارا الأنزيمية الهضم حل ضد سطح خلية ثقافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه الخلية في حجم مناسب من HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع ماصة 1ML للحصول على تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المصل خالية المتوسطة إلى تركيز تقريبي من 1 مليون خلية / مل. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام الفرز الآلي أو اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hAECs لوحة في مناطق ذات كثافة من 25،000 خلية / سم 2 في المصل خالية المتوسطة، والاستمرار في طرق زراعة القياسية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).</li><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+fluid+and+placental+membranes:+unexpected+sources+of+highly+multipotent+cells.">Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells.</a> Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).</li><li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta:+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells.">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preterm+human+amnion+epithelial+cells+have+limited+reparative+potential.">Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential.</a> Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).</li><li>Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+pluripotent+stem+cell+line+derived+from+human+amniotic+membranes+and+initiation+of+germ+layers+in+vitro.">Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro.</a> Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).</li><li>Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+amniotic+epithelial+stem+cells.">Isolation of amniotic epithelial stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cell+isolation+and+characterization+for+clinical+use.">Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).</li><li>Ilancheran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+derived+from+human+fetal+membranes+display+multilineage+differentiation+potential.">Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential.</a> Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).</li><li>Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+amnion+epithelium+into+skin+and+hair+follicles.">Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles.</a> Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).</li><li>Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+characteristics+of+amniotic+epithelial+cells.">Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells.</a> Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).</li><li>Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+ocular+surface+with+heterologous+limbal+epithelium+and+amniotic+membrane+in+a+rabbit+model.">Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model.</a> Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).</li><li>Sankar, V., Muthusamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+in+spinal+cord+injury+repair+research.">Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research.</a> Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).</li><li>Yuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+amniotic+epithelial+cells+express+connexin+26+and+Na-K-adenosine+triphosphatase+in+the+inner+ear.">Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear.</a> Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppressive+factors+secreted+by+human+amniotic+epithelial+cells.">Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cells+ameliorate+behavioral+dysfunction+and+reduce+infarct+size+in+the+rat+middle+cerebral+artery+occlusion+model.">Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model.</a> Shock. 29 (5), 603-611 (2008).</li><li>Venkatachalam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+neurotrophic+factor+secreted+by+amniotic+epithelial+cells.">Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells.</a> Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).</li><li>Manuelpillai, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amniotic+epithelial+cell+transplantation+induces+markers+of+alternative+macrophage+activation+and+reduces+established+hepatic+fibrosis.">Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis.</a> PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).</li><li>Wei, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion-isolated+cells+normalize+blood+glucose+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).</li><li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+prevent+bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function.">Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).</li><li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+induced+to+express+functional+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).</li><li>Murphy, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function.">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li><li>Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amnion+epithelial+cells+as+a+candidate+therapy+for+acute+and+chronic+lung+injury.">Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury.</a> Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).</li><li>Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+mediate+lung+repair+by+directly+modulating+macrophage+recruitment+and+polarization.">Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization.</a> , (2013).</li><li>Litvinov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+adhesion+molecule+(Ep-CAM)+modulates+cell-cell+interactions+mediated+by+classic+cadherins.">Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).</li><li>Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epithelial+cell+adhesion+molecule+(Ep-CAM)+as+a+morphoregulatory+molecule+is+a+tool+in+surgical+pathology.">The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology.</a> The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).</li><li>Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+obtained+from+different+human+tissues.">Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues.</a> Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).</li><li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هناك العديد من المعلمات الحرجة التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير في نجاح هذه المنهجية. تخزين المشيمة أو السلى لمدة تصل إلى 3 ساعات قبل عزل hAECs قد يكون من المرغوب فيه لأغراض لوجستية أو جدولة، ومع ذلك فمن المستحسن أن تتم معالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن. إذا الأنسجة ليتم تخ?...

وقد اجتذبت الخلايا المشتقة من مصادر فترة ما حول الولادة، مثل المشيمة والأغشية المشيمية، الحبل السري والسائل الذي يحيط بالجنين الاهتمام من الباحثين والأطباء كمصدر محتمل للخلايا الطب التجديدي 1،2. والسبب في هذا الاهتمام هو أن هذه الأنواع من الخلايا كل تمتلك قدرا من المرونة والقدرة المناعية 3، الخصائص التي تعتبر أساسية لتطبيقات العلاجية المحتملة. hAECs هي السكان الظهارية غير المتجانسة التي يمكن استخلاصها من مصطلح أو قبل الأجل السلى غشاء 4، وتوفير مصدر محتمل وفيرة من المواد الخلوية التجدد. الخصائص التي تجعل hAECs جذابة كعلاج الخلوي تتضمن multipotency بهم، وانخفاض المناعية، وخصائص مضادة للالتهابات. تم العثور على hAECs أن يكون متعدد القدرات العالية على حد سواء في التجارب المختبرية والحية، وقادرة على التفريق في الأنساب أرومية متوسطة (cardiomyocytes، myocytes، osteocytes، الخلايا الشحمية)، الأنساب الأديم الباطن (خلايا البنكرياس وخلايا الكبد وخلايا الرئة) والأنساب الأدمة (الشعر، والجلد، والخلايا العصبية والخلايا النجمية) 5-10. مطمئن، على الرغم من hAECs multipotency بهم لا تظهر إلى أي شكل أو أورام تعزيز التنمية الورم في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، hAECs هي أيضا في مأمن حظا، معربا عن انخفاض مستويات مستضدات الكريات البيض الدرجة الثانية البشرية (HLAs) 8. هذا العقار على الأرجح راء قدرتهم على التهرب من الرفض المناعي بعد زرع خيفي وxenogenic، كما هو موضح في الدراسات التي تستخدم القرود المناعة المختصة والأرانب وخنازير غينيا والجرذان والخنازير 11-13. عرض hAECs المناعية قوية وخصائص المثبطة للمناعة وبالتالي توفر مزايا عملية كبيرة لالتطبيقات السريرية المحتملة في علاج أمراض المناعة الذاتية. ويعتقد hAECs لممارسة مهام المناعية على كل من أنظمة المناعة الفطرية والتكيفية. في(ه) من الآليات المقترحة، هو من خلال إفراز المناعية عوامل 14. وتشمل التطبيقات الحالية للhAECs في نماذج الأمراض الحيوانية ما قبل السريرية لعلاج السكتة الدماغية، والتصلب المتعدد، وأمراض الكبد والسكري وأمراض الرئة المزمنة والحادة. وقد أظهرت الباحثون اهتماما باستخدام hAECs لعلاج ما بعد السكتة الدماغية والتهاب الدماغ بسبب خصائصها الفريدة. هناك أدلة على أن hAECs يمكن عبور حاجز الدم في الدماغ حيث يمكنهم تدبر، البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 60 يوما، وتفرق في الخلايا العصبية، وتقليل الالتهاب وتعزيز تجديد الأنسجة التالفة الجهاز العصبي المركزي في النماذج الحيوانية من الأمراض العصبية 15. hAECs توفر القدرة على استهداف وعكس مسارات متعددة المرضية التي تساهم في تطور وتقدم مرض التصلب المتعدد. على سبيل المثال، ينتج من الدراسات على الحيوانات ما قبل السريرية تشير إلى أن hAECs هي مناعة بقوة ويمكن أن يحتمل لحث على التسامح المناعي الطرفية وعكس الاستجابات الالتهابية الجارية. كما تبين hAECs لديها القدرة على التمايز إلى خلايا العصبية في الجسم الحي وتعزيز neuroregeneration الذاتية من خلال إفراز مجموعة واسعة من التغذية العصبية عوامل 16. وقد أظهرت الخلايا الظهارية الإنسان والقوارض السلى بالفعل فعاليتها العلاجية لعلاج أمراض الكبد في النماذج الحيوانية. في رابع كلوريد الكربون نموذج الضرر تحريض أمراض الكبد، وhAEC زرع تؤدي إلى engraftment من hAECs قابلة للحياة في الكبد، وترافق مع انخفاض الخلايا الكبدية، وانخفاض التهاب الكبدي وتليف 17. hAECs يمكن حفز لعوامل البنكرياس أعرب بما في ذلك الأنسولين والجلوكوز النقل. حققت العديد من الدراسات إمكانية hAECs لاستعادة مستويات السكر في الدم في الفئران السكري 18. في الفئران تلقيhAECs، انخفضت كل من الوزن والسكر في الدم جسم الحيوان المستويات لمستوياتها الطبيعية بعد حقن الخلايا. هذه الدراسات تمثل حجة قوية لاستخدام hAECs لعلاج داء السكري. hAECs يكون لها دور ثبت في منع وإصلاح التجريبية الحادة والمزمنة إصابة الرئة في كل من الكبار ونماذج حديثي الولادة 19. وجدت هذه الدراسات أن hAECs التفريق في المختبر في الرئة وظيفية الخلايا الظهارية معربا متعددة البروتينات المرتبطة الرئة، بما في ذلك التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR)، والقناة الايونية التي تحور في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي 20. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم تسليم hAECs إلى الكبار المصابين والرئة لحديثي الولادة، وأنها تمارس تأثيراتها تعويضية عن طريق تعديل الخلايا المناعية، والحد من التوظيف الكرية البيضاء الرئوي، بما في ذلك العدلات، الضامة والخلايا اللمفية 21-23. ونظرا فرة بهم،سجل السلامة، والتطبيقات السريرية مؤكدة لأمراض متعددة، والتجارب السريرية باستخدام hAECs أمر لا مفر منه. وذلك بهدف الإسراع في ترجمة العلاجات hAEC في التجارب السريرية، قمنا بتطوير طرق لعزل وcryopreserve وhAECs الثقافة بطريقة مناسبة للتجارب السريرية، وذلك باستخدام الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية وفقا للممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب) المبادئ التوجيهية . نحن مقرها هذا البروتوكول بروتوكول نشرت سابقا التي كنا نستخدمها بنجاح لعزل hAECs باستخدام الكواشف المشتقة من الحيوانات 6. نحن تغيير البروتوكول الأصلي ليحل محل المنتجات المشتقة من الحيوانات مع الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية، وأجريت الأمثل لاحق لتحسين العائد الخلية، وسلامة ونقاء. كان هدفنا لوضع بروتوكول من شأنه أن تمتثل للمعايير التنظيمية لتصنيع الخلايا للتجارب السريرية الإنسان.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="641">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:184px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Collection Kit</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Stripping tray</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-361B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:220px;">Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S17329&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Scissors - Sharp/Blunt Straight</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC0562592&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile latex gloves&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>19-014-643&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Protective Apparel (Gown)</td>
			<td style="width:119px;">U-line</td>
			<td style="width:119px;">S-15374-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protective Apparel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isolation gowns</td>
			<td style="width:119px;">U-line</td>
			<td style="width:119px;">S-15374-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile latex gloves&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>19-014-643&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">General purpose face mask</td>
			<td style="width:119px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:119px;">AT7511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bonnets</td>
			<td style="width:119px;">Medline</td>
			<td style="width:119px;">CRI1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shoe covers</td>
			<td style="width:119px;">U-line</td>
			<td style="width:119px;">S-7873W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Media and Reagents</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14175095</td>
			<td>without calcium or magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypZean(animal product&#8211;free recombinant trypsin)</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor&#160; 1g/50mL</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostor CS5</td>
			<td style="width:119px;">BioLife Solutions</td>
			<td align="right" style="width:119px;">205102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Trypan blue reagent</td>
			<td style="width:119px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-EpCam-PE</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130 - 091-253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-isotype control</td>
			<td style="width:119px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-098-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD90-PeCy5</td>
			<td style="width:119px;">BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PeCy5-isotype control</td>
			<td style="width:119px;">BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">557224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD105-APC</td>
			<td style="width:119px;">BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">562408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC-isotype control</td>
			<td style="width:119px;">BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen Type VI</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL graduated pipette</td>
			<td style="width:119px;">BD/Falcon</td>
			<td>356550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10mL graduated pipette</td>
			<td style="width:119px;">BD/Falcon</td>
			<td>356551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5mL graduated pipette</td>
			<td style="width:119px;">BD/Falcon</td>
			<td>356543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL falcon tubes</td>
			<td style="width:119px;">BD/Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL falcon tubes</td>
			<td style="width:119px;">BD/Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm petri dishes</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#956;m filters</td>
			<td style="width:119px;">BD/Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22-&#956;m filters</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">1ml Pipette tips</td>
			<td style="width:119px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">02-707-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">200ul Pipette tips</td>
			<td style="width:119px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">02-707-409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">20ml Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD/Medical</td>
			<td align="right" style="width:119px;">309661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Plastic spatula</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>14-245-97&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Plastic weighing boat</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>02-202-102&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Cryo vials</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>377267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Equipment</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Mr Frosty</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>A451-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Biohazard Cabinet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, cryopreservation and culture of human amnion epithelial cells for clinical applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

عندما يتبع هذا الإجراء بشكل صحيح، ينبغي أن يتوقع متوسط ​​العائد من 120 مليون hAECs، مع مجموعة نموذجية من 80-160٬000٬000 الخلايا. من هذه المحاصيل، ويمكن توقع متوسط ​​بقاء 83 ± 4٪. قد يكون زيادة متوسط ​​العائد وانخفاض طفيف جدوى في طريقة السريري بسبب ارتفاع النشاط التربسين من ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications at JoVE.com

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

العزلة، والحفظ بالتبريد والثقافة من الخلايا الظهارية البشرية السلى للتطبيقات السريرية

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

isolation-cryopreservation-culture-human-amnion-epithelial-cells-for

Research

JoVE Journal

Medicine

13.8K Views.  Wake Forest University Health Sciences. We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines. 

Video: Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup&gt; +</sup&gt; خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

العزلة والثقافة، والتصوير من الجنين البنكرياس الإنسان الكتل الخليوي

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

التكيف من Semiautomated اعارة ورم الخلية (CTC) فحوصات للتطبيقات السريرية وقبل السريرية البحوث

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

العزلة وثقافة توسيع ورم محددة الخلايا البطانية

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية الأولية من الشرايين والأوردة الكلاب

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and transplantation. Perivascular Stromal Cells (PSCs) share characteristics with bone marrow MSCs (bmMSCs). However, they also possess, most likely due to local imprinting, tissue-specific properties and play a role in local tissue homeostasis. This tissue specificity may result in tissue specific repair, also within the human kidney. We previously showed that human kidney PSCs (kPSCs) have enhanced kidney epithelial wound healing whereas bmMSCs did not have this potential. Moreover, kPSCs can ameliorate kidney injury in vivo. Therefore, kPSCs constitute an interesting source for cell therapy, particularly for kidney diseases and renal transplantation. Here we show the detailed isolation and culture method for kPSCs from transplant-grade human kidneys based on whole-organ perfusion of digestive enzymes via the renal artery and enrichment for the perivascular marker NG2. In this way, large cell quantities can be obtained that are suitable for cellular therapy.

Here we present a novel clinical grade isolation and culture method for kidney Perivascular Stromal Cells (kPSCs) based on whole organ perfusion with digestive enzymes and NG2-cell enrichment. With this method, it is possible to acquire sufficient cell numbers for cellular therapy.

طريقة عزل رواية الصف سريرية للكلى البشرية ارتشاح الخلايا اللحمية

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

زراعة وتصوير المواد العضوية الظهارية الأنفية البشرية

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission due to the introduction of animal-derived products during in vitro manipulation. The xenogeneic components, such as collagenase or fetal bovine serum, commonly used during the cell isolation and expansion steps could be associated with the potential risks of immune reactivity or viral, bacterial, and prion infection in the receiving patients. Following good manufacturing practice guidelines, chemical tissue dissociation should be avoided, while fetal bovine serum (FBS) can be substituted with xenogeneic-free supplements. Moreover, to ensure the safety of cell products, the definition of more reliable and reproducible methods is important. We have developed an innovative, completely xenogeneic-free method for the isolation and in vitro expansion of human adipose-derived stem cells without altering their properties compared to collagenase FBS-cultured standard protocols. Here, human adipose-derived stem cells (hASCs) were isolated from abdominal adipose tissue. The sample was mechanically minced with scissors/a scalpel, micro-dissected and mechanically dispersed in a 10 cm Petri dish, and prepared with scalpel incisions to facilitate the attachment of the tissue fragments and the migration of hASCs. Following the washing steps, hASCs were selected due to their plastic adherence without enzymatic digestion. The isolated hASCs were cultured with medium supplemented with 5% heparin-free human platelet lysate and detached with an animal-free trypsin substitute. Following good manufacturing practice (GMP) directions on the production of cell products intended for human therapy, no antibiotics were used in any culture media.

Xenogeneic (chemical or animal-derived) products introduced in the cell therapy preparation/manipulation steps are associated with an increased risk of immune reactivity and pathogenic transmission in host patients. Here, a complete xenogeneic-free method for the isolation and in vitro expansion of human adipose-derived stem cells is described.

عزل وزراعة الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون بطريقة مبتكرة خالية من الجينات الخارجية للعلاج البشري

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...