يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول عدم التغاير والخصائص الوظيفية للخلايا الظهارية السلوية البشرية المعزولة عن الغشاء السلوي. في حين أن البروتوكولات السابقة عزلت الخلايا من الغشاء الأمينوي المشترك دون تمييز بين المناطق ، فإن بروتوكولنا يسمح بثقافة مجموعات الخلايا المعزولة عن ثلاث مناطق تشريحية متميزة. لفصل الغشاء السلوي حسب المنطقة ، في خزانة السلامة الحيوية في ظروف معقمة ، حدد amnion السري الذي يغلف الحبل السري ، والأفعانة المشيمة التي تغطي الباسيليس المتلّك ، والمنطقة المنعقة ، والتي تعتبر بقية الأمنيون غير المرتبط بالمشيمة.
لتشريح منطقة الأمصال السرية، استخدم ملقطًا مشطًا للاحتفاظ بجزء غشاء الأمنيون الذي يغطي تقاطع المشيمة والحبل السري، واستخدم مشرطًا لتشريح المنطقة المحيطة بالحبل، بينما تمتد لفصل المنطقة عن المشيمون. ثم، إيداع الأنسجة المنفصلة في منقار المسمى مع 100 ملليلتر من محلول ملحي. لتشريح منطقة أمان المشيمة، استخدم شاشًا قطنيًا معقمة لإزالة جلطات الدم من سطح المشيم/الأمنيون الذي يغطي المشيمة.
واستخدام ملقط تشريح لفهم الغشاء على الحدود بين المشيمة والمنطقة المنعكة. استخدم مشرطًا لقطع محيط المشيمة وفصل أمان المشيمة عن المشيمة ، مع الحرص على عدم قطع أي أوعية من المشيمة. ضع النسيج المنفصل في نوع آخر من القارص يسمى بـ 300 ملليلتر من محلول ملحي.
وفصل باقي الغشاء الأمنيوسي الذي لا يتم توصيله بالمشيمة عن المشيمية. ثم، ضع المنطقة المنعكوسة في نوع آخر من البيكر المسمى مع 300 ملليلتر من محلول ملحي. لغسل الأغشية، استخدم ملاقط لوضعها على سطح معقمة لتكون قادرة على التخلص من محلول ملحي من كل حاوية من الأنسجة.
ضع الأغشية مرة أخرى في الحاوية وأضف 100 ملليلتر من محلول ملحي جديد إلى منطقة السرة و300 ملليلتر من محلول ملحي جديد إلى المناطق المشيمة والم ينعكس. استخدام ملقط تشريح لتحريك الأغشية لإزالة أي بقايا الدم ووضع الأغشية على سطح معقم لتكون قادرة على التخلص من المحاليل المالحة. ثم، غسل الأغشية مرتين على الأقل أكثر، كما أظهرت للتو، حتى الأنسجة شفافة.
للهضم الأنزيمي لمختلف مناطق الغشاء الأمنيوسي، قطع المناطق المنعكة والمشيمة إلى شظيتين أو ثلاث. ووضع الشظايا والمنطقة السرية في أنابيب فردية للطرد المركزي 50 ملليلتر. إضافة 20 ملليلتر من 0.5٪ التربسين-EDTA إلى كل أنبوب من شظايا الأنسجة تنعكس والمشيمة في المنطقة وخمسة ملليلتر من 0.5٪ تريبسين-EDTA إلى الأنبوب الذي يحتوي على أنسجة المنطقة السرّية.
هز الأنابيب بلطف لمدة 30 ثانية. ثم ضع الأغشية على سطح معقم، والتخلص من محلول التربسين-EDTA واستبداله بـ 30 ملليلتر من 0.5٪ تريبسين-EDTA الطازجة لشظايا الأنسجة المنعكة والمشيمة في المنطقة و15 ملليلتر من 0.5٪ لتربسين-EDTA الطازجة للأنسجة المنطقة السرية. ثم ضع الأنابيب في دوار داخل حاضنة لدوران لمدة 40 دقيقة بمعدل 20 دوران في الدقيقة الواحدة عند 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، نقل كامل حجم محلول الخلية إلى أنابيب مخروطية جديدة. وإضافة مرتين حجم 37 درجة مئوية الإنسان AE الخلايا المتوسطة لكل أنبوب على الجليد. اجسّد أي بقايا شظايا الأنسجة في الأنابيب الأصلية مع 0.5٪ من التربسين-EDTA، كما هو موضح للتو.
في نهاية عملية الهضم الثانية، استخدم زوجًا من ملقط التشريح لعقد نهاية واحدة من جزء الأمن وزوج ثانٍ من ملقطات التشريح للضغط على الأنسجة المتبقية لإزالة أي صفوف من الخلايا الظهارية التي لم تقشر تمامًا خلال فترات الحضانة السابقة. ثم، إزالة الأغشية لتكون قادرة على نقل حل الهضم الثاني إلى مجموعة ثانية من أنابيب الطرد المركزي. وactivate الانزيمات الهضم مع ضعف حجم الطازجة 37 درجة مئوية الإنسان خلية AE المتوسطة على الجليد.
بالنسبة لعزل الخلايا AE البشرية، تترسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي. و resuspend بيليه في كل أنبوب مع 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية جديدة الإنسان خلية AE المتوسطة. سحب كل زوج من الهضم في أنبوب واحد وتصفية التعليقات من خلال 100 ميكرومتر مصافي لإزالة أي حطام مصفوفة خارج الخلية.
بعد العد، بذور الخلايا AE الإنسان من كل من المناطق الثلاث في لوحات فردية 100 ملليمتر في ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر تركيز مربع في 37 درجة مئوية الإنسان خلية AE المتوسطة، تستكمل مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل نمو البشرة البشرية. ثم، احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية في ظل ظروف نورموكسيك في حاضنة مرطبة حتى تحليل المصب من الفائدة. بعد 48 ساعة من الثقافة، تلتزم خلايا AE البشرية ذات النمط الظاهري الظهاري بسطح اللوحة، في حين يحتوي الماجن على حطام الخلايا والخلايا العائمة التي يمكن إزالتها بمجرد تغيير الوسط.
فمن المستحسن التخلص من الثقافات ومعالجة غشاء آخر عند تحديد وجود التلوث البكتيري، الكريات الحمراء المفرطة بسبب عدم كفاية غسل الأغشية، ناقص أو خلايا غير مُلَهَضة، أو خلايا ذات مورفولوجيا الخلايا الليفية. يعتمد مورفولوجيا الخلايا AE البشري على أصل الخلايا ، حيث تظهر الخلايا من المنطقة المنعكة مورفولوجيا الكُبُل وتنمو في طبقة أحادية مرصوفة بالحصى ، والخلايا من المناطق المشيمية والعُرّية هي تملق و حرشفية. يكشف الفلور المناعية ضد E-cadherin أن الثقافات الأساسية والثقافات الفرعية تحافظ على نمطها الظاهري الظهاري ، مما يشير إلى أنه لا يوجد تلوث لنوع خلية آخر.
وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا قابلة للحياة، كما يتضح من تعبيرها عن مؤشر انتشار كي-67. على الرغم من أن السكان الفرعية من الواهن تختلف في مورفولوجيا ووظيفتها، فإن التعبير عن وجود جوهر عوامل تعدد القدرات لا يتغير في الخلايا البشرية AE المستمدة من المشيمة والمناطق المنعكة. وبما أن الخلايا الظهارية السلوية البشرية هي مصدر محتمل للخلايا الجذعية متعددة القدرات، يمكننا تحديها من خلال خط من بروتوكولات التعريف المحددة لتوضيح ما إذا كانت هذه الخلايا من كل منطقة لديها إمكانات مختلفة.
قبل بروتوكول بدأ، مراجعة التاريخ الطبي للمريض للتأكد من أن الأنسجة لا يعرض الخصائص الميكروبيولوجية للعدوى.
