البروتوكول مهم لأنه يظهر عزلة واختزال الخلايا الظهارية الصباغية من خمسة ثدييات كنظام مثالي لدراسة العلاج الجيني البصري في مختلف الاجهزة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي مرونتها وقابليتها للنقل وارتفاع غلة الخلية وقابليتها للحياة ومعدل العدوى بسبب الأنواع الخمسة ونظام الإرسال والاستقبال SB100X غير الفيروسي المستخدم. وقد تم تطوير هذه التقنيات لدراسة نهج العلاج الجيني التي تستهدف الشبكية والقزحية الصباغ الظهاري، والتي هي معزولة ومصابة في البروتوكول الحالي، ولكن قابلة للاستخدام لأي أبحاث العين.
إثبات الإجراء سيكون جريج سيلي، فني من المختبر. بعد القتل الرحيم للحيوان، استخدم مقص منحني وملقط Colibri لتعميم العينين، ثم تنظيف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد من العينين. جمع العينين في أنبوب 50 ملليلتر مليئة برنامج تلفزيوني غير معقم ونقل الأنبوب إلى غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
تطهيرها عن طريق الغمر في محلول اليود القائم لمدة دقيقتين، ثم نقل العينين إلى أنبوب 50 ملليلتر مليئة برنامج تلفزيوني معقمة. ضع عين واحدة على ضغط شاش معقم واحمل العين بقوة بالقرب من العصب البصري. ثم قطع بالقرب من الحد الأقصى للقزحية مع عدد 11 مشرط.
باستخدام مقص، وقطع حول القزحية وإزالة الجزء الأمامي ووضعها في طبق بيتري، وترك لمبة مع الزجاجي حتى يتم عزل الظهارية صبغة الشبكية، أو خلايا RPE. لعزل الظهارية صبغة القزحية، أو خلايا IPE، وإزالة العدسة مع ملقط غرامة وسحب بدقة القزحية التي تحتوي على خلايا IPE. ضع القزحية في طبق بيتري واغسلها مع برنامج تلفزيوني معقم.
إضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. إزالة التريبسين، إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة كاملة، وكشط IPE بدقة مع شقة، مصقول النار باستور ماصة. جمع تعليق الخلية ووضعها في أنبوب 1.5 ملليلتر.
عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور، والبذور 0.2 مليون خلية لكل بئر في لوحة بئر 24 مع ملليلتر واحد من المتوسطة كاملة. ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لعزل خلايا RPE، قم بإزالة الفكاهة الزجاجية وشبكية العين من الجزء الخلفي مع ملقط رقيق.
وضع المصابيح في لوحة بئر 24 وإضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين لكل عين واحتضان لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية. إزالة التريبسين، إضافة 500 ميكرولتر من المتوسطة كاملة في العالم وكشط خلايا RPE بدقة مع ماصة باستور منحنية، مصقول النار. جمع تعليق الخلية ووضعها في أنبوب 1.5 ملليلتر.
عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور وبذور الخلايا كما هو موضح سابقا. ضع الصحن في الحاضنة. تنظيف الأنسجة العضلية المتبقية والجلد من العينين وتطهير العينين في محلول اليود القائم وشطفها مع برنامج تلفزيوني.
لعزل خلايا IPE، قم بإزالة العدسة وسحب القزحية كما هو موضح سابقا. بعد إعداد اثنين من القزحيات، إضافة ملليلتر واحد من المتوسطة كاملة وعزل الخلايا عن طريق الخدش مع شقة، ماصة باستور مصقول النار، ثم عد والبذور الخلايا. ضع الصحن في الحاضنة.
لعزل خلايا RPE، قم بإزالة الزجاجية والشبكية من الجزء الخلفي ووضع المصباح في طبق بيتري. ملء المصباح مع وسيطة كاملة ملليلتر واحد. باستخدام ماصة باستور منحنية ومصقولة بالنار ، قم بإزالة خلايا RPE.
جمع تعليق الخلية داخل لمبة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، ونقله إلى أنبوب 1.5 ملليلتر لإعادة الإنفاق. ثم عد الخلايا وبذور واحتضان لوحة كما هو موضح سابقا. بعد التنظيف، افتح العين وقطع حول القزحية لإزالة الجزء الأمامي، ثم وضع في طبق بيتري.
اترك المصباح مع الزجاجي حتى يتم عزل خلايا RPE. لعزل خلايا IPE ، إذا كانت العدسة تأتي مع الجزء الأمامي ، قم بإزالة العدسة واستخدم ملقط ناعم لسحب القزحية التي تحتوي على خلايا IPE بدقة. ضع القزحية في طبق بيتري واغسلها مع برنامج تلفزيوني معقم.
قطع الجسم السيلاري مع مشرط رقم 10. بعد إعداد القزحية، واحتضانها مع اثنين من ملليلتر من 0.25٪ تريبسين في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة التريبسين وإضافة اثنين من ملليلتر من المتوسطة كاملة، ثم عزل الخلايا عن طريق الخدش مع شقة، ماصة باستور مصقول النار.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب ملليلتر اثنين والطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 120 مرة G.Discard الناطقة وإعادة إنفاق الخلايا في اثنين من ملليلتر من المتوسطة كاملة. البذور 0.32 مليون خلية لكل بئر في لوحة بئر ستة في ثلاثة ملليلتر من المتوسطة كاملة. ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لعزل خلايا RPE، قم بإزالة الفكاهة الزجاجية وشبكية العين من الجزء الخلفي باستخدام ملقط. تجنب إتلاف ظهارة صبغة الشبكية. غسل المصباح مع برنامج تلفزيوني.
بعد إعداد كلتا العينين، وملء لمبة حوالي ثلاثة أرباع كامل مع تريبسين، واحتضان لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية مع غطاء طبق بيتري على رأس العين لمبة. إزالة التريبسين وإضافة ملليلتر واحد من المتوسطة كاملة. باستخدام ماصة باستور منحنية ومصقولة بالنار ، قم بإزالة خلايا RPE.
جمع تعليق الخلية داخل لمبة ونقله إلى أنبوب 1.5 ملليلتر لإعادة الإنفاق. الطرد المركزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 120 مرة G.Seed 0.32 مليون خلية لكل بئر في لوحة بئر ستة في ثلاثة ملليلتر من المتوسطة كاملة. ضع اللوحة في حاضنة وثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة رطبة. بعد ثلاثة إلى أربعة أيام، ماصة صعودا وهبوطا لجمع الخلايا غير المضاد ووضع نصف حجم في بئر آخر. ملء البئر إلى ملليلتر واحد مع وسيطة كاملة.
بعد ثلاثة إلى أربعة أيام أخرى، كرر مجموعة الخلايا، وهذه المرة تجميع الخلايا غير المضاد من بئرين في واحد. إضافة متوسطة إلى جميع الآبار. مراقبة الخلايا وتغيير المتوسط مرتين في الأسبوع.
عندما تصل الخلايا إلى التقاء، قم بالتبديل إلى وسيط كامل مع 1٪FBS. وباستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه، تم بنجاح عزل خلايا IPE وRPE واستزراعها من خمسة أنواع مختلفة. تم تأكيد نمط التعبير RPE في خلايا IPE البقرية الأولية عن طريق الفلورة المناعية ل RPE65.
تمت دراسة صلاحية الخلية لاستبعاد سمية محتملة لحاجز الكهربوهات باستخدام مجموعة فحص السمية الخلوية المتاحة تجاريا والتحكم بالكهرباء بعقدة. ولم يلاحظ أي أثر على صلاحية الخلية. تم تحويل الخلايا الظهارية الصباغية المستبقة من أنواع مختلفة مع بروتين الزهرة الفلوري الأصفر.
تم استخدام خلايا RPE19 المصابة كعنصر تحكم إيجابي. يظهر هنا التحديد الكمي لكفاءة العدوى في RPE الخنزير المستثناة مسبقا. تم تحويل الخلايا الظهارية الصباغية المعزولة حديثا بالبروتين الفلوري الأصفر فينوس وتم رصدها عن طريق المجهر.
تم تحويل الخلايا الظهارية الصباغية مع عامل مشتق من الظهارة الصباغية وتم رصد إفراز البروتين بواسطة لطخة غربية. وكانت الإشارة للخلايا المصابة أعلى مقارنة بالخلايا غير المصابة لجميع الأنواع والأيام التي تمت دراستها، ولم يلاحظ أي انخفاض في إفراز البروتين في غضون هذا الوقت. من المهم تجنب كشط الخلايا بأدوات حادة.
هنا، وتستخدم ماصة باستور مصقول النار، إلا في عيون الماوس الصغيرة، حيث يجب استخدام مشرط جولة. يمكن استخدام الخلايا الظهارية الصباغية لتطوير نهج العلاج الجيني ومحاكاة الحالات المرضية ، على سبيل المثال ، تلف الإجهاد التأكسدي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه النماذج لاختبار الأدوية العلاجية.
