وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من المجلس السويدي للبحوث (90293501، A0290401، A0290402)، البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية بموجب اتفاقية المنحة رقم 602699 (DIREKT)، ومؤسسة NovoNordisk، ومؤسسة Gurli وإدوارد Brunnberg، الجذعية العلاج، Vleugel مؤسسة ومؤسسة آك WIBERG.

ولفت الدم من الأفراد الأصحاء من قبل بزل الوريد في نظام مفتوح مع موافقة مجلس المراجعة الأخلاقية في أوبسالا (رخصة رقم 2008/264): ملاحظة. 1. خلايا البذر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا الأولية البشرية البطانية الوريد السري (HUVEC) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في قوارير T75 المغلفة مع الجيلاتين 1٪ في برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مستنبت من قارورة T75 يحتوي HUVEC (أو أي نوع آخر من الخلايا البطانية الإنسان الأساسية) وغسل الخلايا مع 2.1 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.4. فصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان لمن 2 - 3 دقيقة في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا وذلك بدهن قارورة مع 9 مل 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل. تدور أسفل الخلايا في 735 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend بيليه خلية بعناية في نمو الخلايا البطانية المتوسطة الاوعية الدموية الدقيقة (EC GMMV) وعدد الخلايا في غرفة Bürker. البذور 21000 جells / سم 2 في 1 جيدا الشرائح زراعة الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية. سيتم متموجة في HUVEC بعد 1 - 2 أيام الثقافة. مراقبة مورفولوجيا الخلايا وconfluency يوميا تحت المجهر الضوئي. </li></ol> 2. إعداد الدم الكامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير جميع الأسطح الاصطناعية التي من شأنها أن تكون على اتصال مع الدم مع طبقة مزدوجة من الهيبارين يجمد (كلية العلوم الصحية) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. CHS المواد المغلفة محمية من الغبار ويمكن تخزين في درجة حرارة الغرفة ما يصل إلى 6 أشهر دون فقدان وظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نظام مفتوح بزل الوريد لسحب الدم من المتبرع بصحة جيدة قريبا (&lt;30 دقيقة) قبل البدء في تجربة غرفة البطانية الدم. زوجان إبرة تحت الجلد (G 18 × 50 ملم) لكلية العلوم الصحية الأنابيب المغلفة السيليكون (القطر الداخلي: 2 مم) قبل جمع بعناية الدم في أنبوب مل CHS المغلفة 50. ملحق الدم مع الهيبارين غير المجزأ للوصول إلى تركيز النهائي من 0.75 وحدة دولية / مل. خلط الدم بلطف بواسطة INVErting أنبوب من 2 - 3 مرات. </li></ol> 3. الدم غرفة غشائي نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتعال غرف الدم (الشكل 1A؛ عرض أعلى) في الاكريليك ميتاكريلات (PMMA)، ويتألف من اثنين من اسطوانات (الطول 8 ملم وقطرها 9 مم) التي يتم لصقها على شريحة PMMA (25 × 75 مم). تناسب حواف اسطوانات تواجه صعودا مع المطاط O-خواتم لاغلاق الغرفة الدم على الشرائح الزجاجية مع الخلايا البطانية مثقف (الشكل 1B). تدوير الدم غرف متصلة الشريحة الثقافة مع الخلايا البطانية بعد ذلك في وضع عمودي (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض ماصة كلية العلوم الصحية المغلفة لنقل 1.5 مل دم في كل كلية العلوم الصحية المغلفة الغرفة مع الحرص على عدم لتنشيط الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 مل من الدم في أنابيب microcentrifuge تحتوي على 30 ميكرولتر 0.34 MK 3 EDTA للوصول إلى تركيز النهائي من 10 ملي K 3 EDTA لتحديد تركيزات بروتين البلازما الأولي باستخدامانزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA). مزيج بعناية الدم والحفاظ على أنابيب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجدران البلاستيكية من الشرائح الزجاجية زراعة الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بعناية وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.4. تأكد من إزالة لاحقا الكثير من السوائل ممكن من الشرائح. لا تدع خلايا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة على رأس الدوائر الدم، مع الخلايا التي تواجه الدم. تأمين الشريحة من خلال وضع المشبك في جميع أنحاء الغرفة الخلايا البطانية في الدم. استخدام شريحة بلاستيكية للحصول على دعم إضافي لتفادي الكسر من الزجاج زراعة الخلايا الشريحة عند وضع المشبك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا البطانية غرفة الدم على عجلة دوارة (40 سم في القطر) مكان في حمام مائي 37 ° C. وتناوب كل من المجلسين على عجلة القيادة عند 0.5 x ج لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وتفكيك الخلايا البطانية غرفة الدم. تغسل شرائح زراعة الخلايا في برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.4 وإصلاح الخلايا في الجليد الباردة 1٪ بارافورمالدهيد (PFA) وأو 10 دقيقة. نقل 1 مل من الدم كل غرفة لأنابيب microcentrifuge تحتوي على 30 ميكرولتر 0.34 MK 3 EDTA للوصول إلى تركيز النهائي من 10 ملي K 3 EDTA وخلط أنابيب بلطف. إبقاء الأنابيب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 4560 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل بلازما الدم لأنابيب microcentrifuge جديدة وتخزينها في -70 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل. </li></ol> 4. تحليل الدم غشائي التفاعلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مناعي تلطيخ مع الماوس مكافحة CD16 الإنسان تليها الماعز الثانوية المضادة للماوس اليكسا 488 و phalloidin-TexasRed. تنفيذ كل خطوة تلطيخ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني ودرجة الحموضة 7.4 بين كل خطوة. مباين نوى مع دابي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تحليل مكونات الدم منضمة إلى الخلايا البطانية التي كتبها مضان المجهري في تركيبة مع تحليل الصور باستخدام برمجيات تحليل الصور مناسبة مثل CellProfiler. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quantiردود الفعل المالي في المقصورة الدم مع الثرومبين، مضاد الثرومبين (TAT) ELISA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للعينات البلازما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأدوات الإحصائية المناسبة، على سبيل المثال، لاختبار ر أونبايريد، لتحليل البيانات. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> يتم الاحتفاظ التفاعلات المتعددة بين الدم وجدار الوعاء الدموي عادة في حالة هادئة نظرا لطبيعتها غير لاصقة ومكافحة الجلطات من البطانة. 7 خلال الحالات المرضية التي تشمل التهاب، يتم تنشيط البطانة مع الزيادة الناتجة في التصاق مستقبلات التعبير 8 و القدرة على خفض تمنع الارقاء. 9 تفعيل أنظمة شلال في الدم بدوره تضخيم thrombogenicity من البطانة التسبب في مزيد من تجلط الدم والكريات البيض التوظيف. 10 للحصول على فهم أفضل لهذه التفاعلات الحساسة بين الخلايا البطانية والدم كله، لدينا وضعت الرواية في طريقة المختبر حيث يتم وضع الخلايا البطانية مثقف في اتصال مع دم بأكمله. على حد علمنا، والإعداد لدينا هو الأول لإظهار الخلايا البطانية المحتضنة مع الدم البشري كله مع عدم وجود تخثر أو القليل جدا لفترات زمنية أطول. يتم تمكين NT &quot;&gt; إن حساسية هذا النظام عن طريق بزل الوريد نظام مفتوح في تركيبة مع طبقة واقية من الهيبارين ثبتوا على جميع الأسطح وضعت في اتصال مع الدم. إن استخدام نظام مفتوح خلال شراء الدم يقلل من تفعيل أنظمة شلال خلال بزل الوريد في حين السماح باستخدام كمية تحددها الذات من تخثر. ومع ذلك، قد تكون استخدمت المتاحة تجاريا أنابيب الدم اجلاء اعتمادا على نقطة نهاية المقصود من هذه الدراسة، وتركيز النهائي من تخثر تضاف إلى أنابيب مغلقة نظام أكثر المتاحة تجاريا قد تمنع الحساسية وخلاف ذلك من الصعب للدراسة، التفاعلات في الإعداد. 6 يقضي على سطح الهيبارين واقية مزيد تفعيل الدم عن طريق الاتصال من قبل أي سطح السطوح الأخرى من الخلايا البطانية. 5 وفي الواقع، حضانة الدم الكامل تستكمل مع كمية صغيرة من الهيبارين غير المجزأ في أسفرت الغرفة دون حماية من كلية العلوم الصحية في تكوين الجلطة. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; فقاعة الهواء داخل الغرفة يمكن خلط الدم أثناء الحضانة مع الخلايا البطانية. من أجل تقييم تأثير حجم فقاعة الهواء، وكنا مجلدين الدم المختلفة. في هذا النموذج، قمنا بقياس مستويات TAT مماثلة بغض النظر عن حجم فقاعة الهواء في غرف المحتضنة مع HUVEC. كان TAT، ولكن، مع زيادة حجم أصغر فقاعة الهواء في كلية العلوم الصحية بالكامل تعامل الدوائر. هذا، وفقا لسبق وصفها خصائص الخلايا البطانية 11، يشير إلى وجود تأثير تنظيمي على تفعيل زيادة التخثر التي تقدمها الخلايا البطانية التي تفتقر في قاعة كلية العلوم الصحية الخاملة. فقاعة الهواء في نظام يخلق تدفق على دوران الغرفة. فإن حجم فقاعة تؤثر على القوى داخل هذا النظام بالتناوب. ويظهر ذلك من خلال نتائجنا في الشكل 2D كانت فقاعة صغيرة تخلق TAT القيم الأعلى تمثل قوة انخفضت على سبيل المثال الدم، وحركة الدمداخل غرفة أقل وبالتالي تفعيل نظام شلال يحدث إلى حد أعلى. وتجدر الإشارة إلى أنه في هذا النظام ونحن على خلق تدفق الدورية التي سوف تكون مختلفة في سرعة عبر الغرفة مع أعلى سرعة على طول الجدران وأدناها في المركز. ومن الواضح أن هذا لا يشكل بيئة مثلى فيما يتعلق بالتدفق وإجهاد القص للحصول على الخلايا البطانية، ولكن لا يزال لدينا نظام تحقيق نتائج مستقرة وقابلة للتكرار. ستشمل ظروف أكثر المثلى تعميم تدفق الصفحي في غياب الاضطرابات. هذا هو، ومع ذلك، لا يمكن في النموذج الممثلة هنا وعلى حد علمنا هذا النظام غير متوفر حتى الآن. على الرغم من ذلك، هناك العديد من النظم المتاحة تجاريا ميكروفلويديك التي لا يمكن أن تتحد مع الدم كله مع عدم وجود أو انخفاض مستويات تخثر إضافتها إلى النظام وبالتالي تفشل في تمكين تقييم حساسية السليم للتفاعلات بين جميع المكونات موجودة في الدم والخلايا البطانية. وعلاوة على ذلك، كانت هناك زيادة بنسبة 2 أضعاف في تجنيد خلايا الدم نحو TNFα تنشيط HUVEC في توليفة مع تشكيل تضاعف من TAT بشكل مستقل من حجم الدم. هذا يتحقق استقرار النظام النموذج ويظهر أيضا إمكانية استخدام البطانة تفعيلها بالاشتراك مع الدم الكامل. على المستقبل، غرفة الخلية البطانية الدم يمكن استخدامها لتحقيق تجنيد خلايا الدم نحو الخلايا البطانية تفعيلها من خلال مجموعة متنوعة من العلامات أعرب عن الخلايا تحت مختلف الظروف والمراحل التنشيط. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج يمكن أن تستخدم في تركيبة مع وكلاء الدوائية من أجل تقييم الآثار المترتبة على حالات الالتهابات. باختصار، نقدم لك مجموعة من فائدة عظيمة للجمع بين نموذج الغرفة مع خلايا الدم والأوعية الدموية البشرية لخلق إنسان كامل في نظام المختبر لإجراء تحقيقات ذات الصلة من أمراض الأوعية الدموية.

طرق لتحليل التفاعلات الدم في الأوعية الدموية أمراض القلب والأوعية الدموية تشمل عموما تجارب البحوث الحيوانية. قد النتائج التي تم إنشاؤها في النماذج الحيوانية الأبحاث التجريبية، ومع ذلك، فقد ضمنا ضئيلة أو معدومة للأمراض البشرية. 1،2 على هذا النحو، هناك حاجة للخير وموثوق بها في النماذج المختبرية للتحقيق في التفاعلات الخلوية بين مقصورة الدم والخلايا البطانية الوعائية في نظام يشبه الإنسان. وبالتالي أنشأنا البطانية الدم نموذج غرفة الخلية. ويستند هذا على نموذج سبق وصفها تستخدم لتحقيق التفاعل بين المواد الحيوية والدم البشري كله. 3 خلافا لغيرها من الاجهزة في المختبر حيث عادة عدد من المكونات النقية، محدودة أي thrombocytes، هي الكريات البيضاء أو الخلايا البطانية المتاحة، والنموذج الحالي يتضمن جميع مكونات موجودة في الاوعية الدموية. الإعداد للالبطانية الدم جتم تصميم نموذج الذراع الغرفة لتمكين استخدام رسمها الدم البشري الطازج مع القليل أو لا تخثر المضافة. الدم المخزنة خلال فترات زمنية أطول يكتسب ما يسمى الآفات التخزين حيث انهيار الكريات الحمراء قد تتداخل مع التفاعلات الحساسة بين الدم والخلايا البطانية. 4 لتجنب تشكل جلطة أثناء التعامل مع الدم خارج الجسم كله يتطلب إما جرعات عالية من مضادات التخثر أو أن جميع المواد في اتصال مع الدم يجب أن تكون غير تفعيل. كما الأسطح غير تفعيل نادرة في بيئة معملية، قد تكون مجهزة بدلا من المواد مع طبقة واقية من الهيبارين يجمد. طبقة واقية من الهيبارين يجمد (المشار إليه فيما Corline الهيبارين السطحية (كلية العلوم الصحية)) والتي يمكن تطبيقها على معظم المواد خلق السطح حيث يمكن أن يحدث تلامس الدم دون التسبب في تفعيل شلال التخثر. 5 وهكذا، من خلال تأثيث غرف مع كلية العلوم الصحية، وم البطانية الدمليرة لبنانية نموذج غرفة يتيح استخدام تركيزات منخفضة جدا من تخثر في الدم. تجنب إضافة تركيزات عالية من تخثر في الدم طراز الغرفة البطانية يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات الحساسة داخل الأوعية الدموية التي قد تكون على خلاف ذلك ملثمين 6 يتكون الدم البطانية نموذج غرفة خلية من مجلسين شكلتها إرفاق اسطوانات البلاستيك (الطول: 8 مم؛ نصف قطرها: 9 مم) إلى المجهر الشريحة البلاستيكية. مجهزة الحواف التي تواجه صعودا على اسطوانات مع الأخاديد التي يتم تركيبها مع المطاط O-خواتم تستخدم لاغلاق الدوائر ضد الشريحة ثقافة الخلية. تمتلئ غرف جزئيا فقط مع الدم والهواء ترك في الغرفة وتبقي الدم في الحركة عندما يتم استدارة غرف لاحقا في وضع عمودي (الشكل 1). من أجل تقييم الأداء الوظيفي للنموذج، أجرينا تجارب إما مع كلية العلوم الصحية المغلفة تماماغرفة أو الوريد السري الإنسان خلايا غشائي (HUVEC). وقد يعاير مجلدين منفصلين الدم وقياس تشكيل الثرومبين مضاد الثرومبين (TAT) مجمعات (علامة غير مباشرة للتخثر) مع انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA). نحن بعد ذلك بتقييم تأثير حجم الدم وعامل نخر الورم (TNFα) حفز الخلايا البطانية على تجنيد الكريات البيض بواسطة تحليل الصور. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> الشكل 1. الإعداد للالبطانية الدم نموذج غرفة الخلية. (A) أعلى عرض الرسم التخطيطي للغرفة الدم المحرز في PMMA. (ب) الخلايا البطانية الإنسان الأولية هي تربيتها على 1-جيدا الشرائح غرفة. وأضاف العذبة الدم البشري كله إلى مجلسين على شريحة المجهر. يتم التعامل مع الدوائر وجميع المواد المستخدمة للتعامل مع الدم مع طلاء واقية HS. بعد إزالة جدران مليرة لبنانية ثقافة شريحة، يتم وضع الخلايا التي تواجه الدم وفرضت نظام الإغلاق. ثم يتم تحضين غرف الخلية (C) في الدم تحت البطانية في دوران 37 درجة مئوية. بعد ذلك، يمكن تحليل ردود الفعل في مقصورة الدم عن طريق ELISA ويمكن تحليل الخلايا البطانية بواسطة المجهر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

ويرافق غالبية من جميع الأمراض المعروفة من قبل اضطرابات في نظام القلب والأوعية الدموية. دراسات في تعقيد سبل تفعيلها خلال التفاعل أمراض القلب والأوعية الدموية و، ومع ذلك، محدودة بسبب عدم وجود طرق قوية وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. من أجل نمذجة الأحداث الأوعية الدموية المرضية قمنا بتطوير فحص في المختبر لدراسة التفاعل بين البطانة والدم كله. ويتكون الفحص من الخلايا البطانية الإنسان الأساسية، والتي يتم وضعها في اتصال مع الدم البشري كله. يستخدم أسلوب دم الأم مع أي أو القليل جدا من تخثر، مما يتيح دراسة التفاعلات الحساسة بين المكونات الجزيئية والخلوية الموجودة في الأوعية الدموية. نحن التحقيق ظيفة الفحص بمقارنة تفعيل تخثر الدم بواسطة أحجام مختلفة المحتضنة مع أو بدون خلايا بطانة الوريد السري الإنسان (HUVEC). في حين ساهم حجم الدم أكبر ل(TAT) المجمعات، أدى إلى زيادة في تكوين الثرومبين مضاد الثرومبين جود HUVEC في خفض تفعيل التخثر. وعلاوة على ذلك، طبقنا تحليل صورة مرفق الكريات البيض إلى HUVEC حفز مع عامل نخر الورم (TNFα) وجدت وجود CD16 + الخلايا لتكون أعلى بكثير على TNFα حفز الخلايا بالمقارنة مع الخلايا unstimulated بعد ملامسة الدم. في الختام، الفحص يمكن تطبيقها لدراسة أمراض الأوعية الدموية، حيث يتم مضطرب التفاعلات بين البطانة ومقصورة الدم.

ضرورة CHS طلاء من أجل قياس ردود الفعل في الدم الكامل محددة لتلك التي تسببها الخلايا البطانية، وجميع المواد المستخدمة في غرفة خلية البطانية الدم يجب مفروشة مع طلاء كلية العلوم الصحية قبل استخدامها. الشكل 2A (يسار) يدل على غرفة غير المصقول بعد 30 دقيقة من الاتصال مع تجلط الدم اضحة للعيان الحاضر. علاج الغرفة مع كلية العلوم الصحية (الشكل 2A، يمين) من جهة أخرى يحمي الدم من التنشيط غير المنضبط، وضمان أن النتائج هي نتيجة لتفاعلات الخلايا البطانية الدم. تأثير حجم الدم في الغرفة تنشيط تجلط الدم هو أكثر احتمالا في الدم الراكد حيث احتمال التفاعل بين عوامل التخثر تنشيط وزيادة. في البطانية الدم نموذج غرفة الخلية، ويتم الاحتفاظ بالدم في الحركة بسبب تداول فقاعة الهواء داخل الغرفة. في سrder لتحديد تأثير التغيرات في حجم الدم، وبالتالي أيضا حجم فقاعة الهواء، وتواصل الغرفة المغلفة كلية العلوم الصحية إلى كلية العلوم الصحية المغلفة شريحة زجاجية الذي تم اختباره مع 1.5 مل أو 1.75 مل الدم الكامل لمدة 30 دقيقة. حجم الدم دون أي حركة من قبل فقاعة الهواء هو 2.5 مرات أكبر عند 1.75 مل من الدم ويضاف إلى غرفة مقارنة عند استخدام 1.5 مل من الدم (الشكل 2B). واقترح القيم تات تات-تقاس زيادة تكوين مع زيادة حجم الدم (الشكل 2D). عندما حضنت HUVEC (الشكل 2C) مع إما 1.5 أو 1.75 مل من الدم الكامل، لوحظ أي فرق بين المجموعتين، مما يشير إلى أن الخلايا البطانية قد تعدل تفعيل التخثر (الشكل 2D). تأثير TNFα على التوظيف خلايا الدم وتنشيط التخثر من أجل دراسة تأثير TNFα على تجنيد الكريات البيض، وكانت معاملتهم HUVECإد مع 20 نانوغرام / مل TNFα 4 ساعة قبل الاتصال الدم. واستمر لمدة 30 دقيقة وبعد ذلك تم صبغ الشرائح الثقافة لCD16 (الشكل 2F)، تصوير وكميا في عدد من خلايا CD16 + - الاتصال الدم - سواء مع 1.5 مل أو 1.75 مل دم. تجنيد CD16 + الخلايا بشكل ملحوظ مع العلاج TNFα (الشكل 2E) 100-256 CD16 + خلية / ملم 2 (P &lt;0.0001) مع 1.5 مل دم و172-378 (P &lt;0.0001) مع 1.75 مل من الدم. وقد تم قياس تشكيل المجمعات TAT في عينات البلازما المماثلة من الدم المحتضنة مع الخلايا إما غير المعالجة أو المعالجة TNFα (الشكل 2G). حفز خلايا TNFα يسببها لمضاعفة التقريبية المجمعات TAT بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> تينلدى عودتهم 2: وظيفة من البطانية الدم نموذج غرفة الخلية. وحضنت (A) غرف مع أو بدون CHS مع الدم الكامل. دون كلية العلوم الصحية، تم تشكيل لتجلط بعد 30 دقيقة. كان قياس الثرومبين، مضاد الثرومبين (TAT) المجمعات، وهي علامة غير مباشرة للتخثر في الدم المحتضنة دون CHS&gt; 6000 ميكروغرام / مل. (ب) حجم الدم لا اصلت التحرك من قبل فقاعة الهواء الدورية سوف تختلف مع حجم الدم المختلفة. مع إضافة 1.5 مل من الدم، وهذا سوف يكون حجم 0.3 مل، في حين أنه سيرتفع إلى 0.74 مل مع إضافة 1.75 مل. (C) HUVEC تصوير مع مجهر تباين الطور عرض نموذجي مورفولوجيا الخلايا البطانية أحادي الطبقة متموجة من قبل الاتصال الدم. (D) القيم TAT للغرف تماما CHS المغلفة تظهر اختلاف طفيف عند إضافة كميات الدم المختلفة. أدت إضافة 1.5 مل من الدم في 35 ± 11 ميكروغرام / مل (ن = 7) بالمقارنة مع 1.75 مل، والتي أسفرت عن 8577. 70 ميكروغرام / مل TAT (ن = 8). هذا الاختلاف لم يعد موجودا عندما يتم تحضين HUVEC مع حجم الدم نفسه. 66 ± 55 ميكروغرام / مل 1.5 مل (ن = 5) و 66 ± 29 ميكروغرام / مل مقابل 1.75 مل (ن = 7). (E) الكمي لعدد من CD16 + الخلايا موجودة على أي unstimulated أو TNFα حفز HUVECs بعد الاتصال الدم. وارتفع عدد CD16 + الخلايا بشكل ملحوظ مع TNFα حفز الخلايا المحتضنة إما مع 1.5 مل (القاعدية: 100 ± 40 خلية / مم؛ TNFα: 256 ± 121 خلية / ملم) أو 1.75 مل (القاعدية: 172 ± 67 خلية / ملم. TNFα: 378 ± 185 خلية / ملم) من الدم الكامل (F) صور الممثل unstimulated وTNFα حفز HUVEC الملون لphalloidin (الحمراء)، CD16 (الخضراء) ودابي (الأزرق). شريط النطاق = 250 ميكرومتر (G) تتم مضاعفة تشكيل المجمعات TAT تقريبا بواسطة TNFα حفز الخلايا بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة المحتضنة مع الدم (1.5 مل: 2.1 ± 0.1 مرات أكثر TAT، ن = 3؛ 1.75 مل: 1.7 ± 1.0 مرات أكثر TAT، ن = 4). يتم عرض كافة القيم كما يعني ± الانحراف المعياري. تم حساب قيم ص التي كتبها t الاختبارات المفردة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium at JoVE.com

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

رواية<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K Views.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Video: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

التهاب القرنية العقبولي المتكررة اللحمية في الفئران، وهذا نموذج لدراسة الإنسان HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

دراسة المجتمعات الميكروبية<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج من التفاعل بوساطة بين المضيف<em&gt; المبيضات البيض</em&gt; و<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في الخطوط الجوية

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

التنمية وتحديد جزء من السكان رواية من المستمدة العدلات-الإنسان البالعات العملاق<em&gt; في المختبر</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

نظام تغذية خالية رواية للإنتاج الضخم للخلايا القاتلة الطبيعية مورين في المختبر

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...