وأيد هذا العمل من قبل فون للحصول على Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) VLAANDEREN G0466.10، 11I0113N. &quot;إدي ميركس منحة بحثية&quot; و &quot;Sporta البحوث غرانت&quot; لأمراض القلب للأطفال، UZ لوفين، بلجيكا (JC)؛ ويدعم مركز الجزيئية والأوعية الدموية الأحياء التي Programmafinanciering KU لوفين (PF / 10/014)، من قبل &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (غوا 2009/13) من جامعة لوفين و منحة بحثية من بورنغير إنغلهايم،.

وتمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة الأخلاقية لوفين KU. 1. البكتيريا التحضير لفي المختبر Perfusions والتجارب في فيفو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كنا S. الذهبية سلالة نيومان لجميع التجارب وصفها في هذه المخطوطة. S. تم تخزينها الذهبية نيومان في الدماغ القلب تسريب (BHI) مع 10٪ الجلسرين في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حلقة معقمة لتتخلص من البكتيريا المجمدة وإيقاف تطعيم في 5 مل زيتية الصويا مرق (TSB) O / N عند 37 درجة مئوية (OD 600&gt; 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل البكتيريا عن طريق الطرد المركزي (2600 غرام، RT، 5 دقائق) و resuspend بيليه الجرثومي في 5 مل PBS (الفوسفات مخزنة المالحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل 1 ملغ / مل من 5 (6) -carboxy-فلوريسئين استر N-hydroxysuccinimidyl (كربوكسي فلوريسئين) في الإيثانول. تمييع 1 ملغ / حل كربوكسي فلوريسئين مل إلى 150 ميكروغرام / مل في الماء مختبر الصف (على سبيل المثال، الماء MilliQ). حماية الأنابيب من الضوءمع رقائق الألومنيوم وتخزينها في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي البكتيريا (2600 x ج، RT، 5 دقائق). resuspend الكرية الجرثومي في 800 ميكرولتر PBS وإضافة 200 ميكرولتر (تركيز النهائي من 30 ميكروغرام / مل لإجراء التجارب التروية) أو 400 ميكرولتر (تركيز النهائي 50 ميكروغرام / مل لإجراء التجارب في الجسم الحي) من 150 ميكروغرام / مل من محلول كربوكسي-فلوريسئين. حماية الأنابيب من الضوء بورق الألمنيوم واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع العلامات، وكتلة مع 6٪ ألبومين المصل البقري (BSA) حل في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع البكتيريا باستخدام كثافة البصرية (OD)، وهو OD 600 0.65 لإجراء التجارب في المختبر (المقابل لحوالي 3 × 10 8 مستعمرة (كفو) / مل للبكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) وOD 600 من 1.8 لفي التجارب المجراة ( المقابل لحوالي 1 × 10 9 CFU / مل للبكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) في برنامج تلفزيوني. حماية الأنابيب من الضوء بورق الألومنيوم ويترك على الجليد. </li></ol> 2. تجارب في المختبر الإرواء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء الزجاج coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع عامل فون ويلبراند (VWF) (Haemate P، تركيز الأسهم 2400 ميكروغرام / مل) في الماء مختبر الصف (منزوع الأيونات المقطر) إلى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الكولاجين في محلول متساوي التوتر الجلوكوز (حل SKF، ودرجة الحموضة 2،7-2،9، كما تم توفيره من قبل الشركة المصنعة) إلى التركيز النهائي من 160 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips الزجاج معطف (24 × 50 ملم) مع VWF أو الكولاجين من خلال إسقاط 200 ميكرولتر من الطلاء على parafilm ووضع ساترة على رأس الحبرية. سوف تنتشر الحبرية على طول سطح ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ساترة في وعاء مرطب لمدة 4 ساعة على RT. رفع بعناية لل coverslips من parafilm مع إبرة حادة. جبل ساترة في الجزء السفلي من الغرفة التدفق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء من البلاستيك ينزلق مع الخلايا البطانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زلات معطف البلاستيك(1 جيدا غرفة زراعة الخلايا PCA، SARSTEDT، ألمانيا) مع 1 مل من محلول الجيلاتين 1٪ في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. بذور الخلايا البشرية الوريد السري البطانية (HUVECs) على الجيلاتين المغلفة زلات البلاستيك وتنمو لهم 70-80٪ confluency. جبل زلة البلاستيك في الجزء السفلي من الغرفة التدفق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح التجربة ملاحظة: لمحة التخطيطي للفي المختبر نموذج نضح تتمثل في الشكل 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء في الدراسات المختبرية التصاق البكتيريا في غرفة تدفق لوحة مواز الصغيرة في الضغط الصفحي القص بين 2.5 داين / سم 2 و 20 داين / سم 2 لمحاكاة مختلف ظروف تدفق الفسيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و(تصميم داخلي) غرفة تدفق يتكون من إطار معدني وغرفة نضح مصنوعة من الزجاج (بولي (ميثيل) ميتاكريليت (PMMA)). من خلال توصيله إلى مضخة التسريب عالية الدقة (PHD 2000 التسريب، جهاز هارفارد، الولايات المتحدة الأمريكية)، ونحن يمكن أن تولد را تدفققسم التدريب والامتحانات بين 0.0001 ميكرولتر / دقيقة و220.82 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب إلى الجزء العلوي من غرفة التدفق وضخ المتوسطة في الأنبوب. وضع بلطف الجزء العلوي من غرفة التدفق على الجزء العلوي من الجزء السفلي وغرفة تجميع التدفق. كن حذرا لتجنب فقاعات الهواء. حقن 1 مل من المتوسط ​​من خلال غرفة للتأكد من أن الغرفة وعدم حدوث أي تسرب، وإزالة حل طلاء الزائد. تجنب فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على وسادة التدفئة التي تسيطر عليها الحرارية عند 37 درجة مئوية على صينية المجهر. وبما أن هذا هو الإجراء المحطة، ليست هناك حاجة لإجراءات صارمة asceptic. إجراء شق بالقرب من حبل الوريد، وإزالة بلطف الجانب الأيمن من عضلة عنق الرحم وعزل الوريد الوداجي من الأنسجة المحيطة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مضخة التسريب ومضان المجهر. تعتمد إعدادات مضخة التسريب على قطر حقنة ومعدل التدفق المطلوب (انظر القسم 2.4). من الآن فصاعدا، والعمل في غرفة مظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VWF طلاء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة ملء مع البكتيريا fluorescently المسمى وذلك لربط أنبوب مدخل. تجنب فقاعات الهواء. بدء تشغيل مضخة التسريب لمدة 10 دقيقة. الوقت التسريب يعتمد على معدل القص وطلاء، والبكتيريا والوسيلة المستخدمة ويجب أن تمثل حالة مستقرة من الالتصاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة، يغسل البكتيريا غير منضم من خلال ربط المحاقن مع برنامج تلفزيوني للأنبوب مدخل والبدء في مضخة التسريب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق 15 على الأقل الصور أو الأفلام في مواقع مختلفة بعد عملية الغسيل. بكتيريا صغيرة ويمكن أن تكون صعبة للتركيز عليها. قبل التجربة تدفق في المختبر، وطائرة الوصل المناسبة يمكن استرجاعها عن طريق وضع قطرة من البكتيريا fluorescently المسمى على ساترة، ووضع ساترة في غرفة التدفق. ثم، ابحث عن البؤري المناسبة وحفظ الإعدادات. ملاحظة: خلال التجربة تدفق في المختبر، واستولت على الصور أثناء الخطوة الغسيل (± 5 دقائق بعد بداية) يضمن فقطيتم التقاط إشارة للبكتيريا ملتصقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكولاجين طلاء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 60 ميكروغرام / مل VWF للبكتيريا fluorescently المسمى فقط قبل بدء الارواء. حقنة ملء مع البكتيريا fluorescently المسمى أو البكتيريا fluorescently المسمى تستكمل مع 60 ميكروغرام / مل VWF وذلك لربط أنبوب مدخل. تجنب فقاعات الهواء. كرر الخطوات من 2.3.5.2 إلى 2.3.5.3 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا البطانية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط الخلايا البطانية التي نضح مع حل 0.1 ملم من الكالسيوم 2+ -ionophore A23187 (محلول المخزون 10 ملي الذائبة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO)) في DMEM في نفس معدل القص كما نضح البكتيري لمدة 10 دقيقة قبل نضح مع 0.1 ملم. كرر الخطوات من 2.3.5.2 إلى 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب معدل القص وإجهاد القص على النحو التالي. معدل القص = 6Q / ملحق 2 حيث: Q: معدل في مل / دقيقة، ث تتدفق: عرض في سم، ح: ارتفاع في سم إجهاد القص (τ) = الفئران القصاللزوجة EX (μ) حيث μ: متوسط: 0.01 dynes س ثانية / سم 2، والدم كله: 0.04 dynes س ثانية / سم 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور الحية باستخدام مجهر مضان مقلوب مع كاميرا سوداء وبيضاء وتطوير استخدام برامج التصوير. استخدام وقت التعرض لل 1.5 ثانية. أخذ لقطات متعددة (15 على الأقل) تنتشر بشكل عشوائي على سطح مصقول من غرفة التدفق وحفظها في تنسيق الملف المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل صورة مع يماغيج. طرح الخلفية لإزالة الخلفيات مستمرة على نحو سلس من الصورة (عملية - خلفية Substract) وتحديد عتبة لتعيين قيم العتبة الدنيا والعليا، بتجزئة حجم الصور الرمادي إلى الميزات المثيرة للاهتمام. قياس منطقة تقتصر على العتبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة التصاق البكتيريا، كما أعرب عن منطقة الفلورسنت، على سبيل المثال، وذلك باستخدام برامج التحليل الإحصائي. مقارنة بين جماعات تستخدم في اتجاه واحد أنوفا أو تيالتعليم الجامعي الذيل اختبار تي الطالب. الإبلاغ عن جميع القيم كما يعني الخطأ ± المعياري للمتوسط ​​(SEM). النظر في قيمة P-من &lt;0.05 كبير (* P &lt;0.05 **؛ P &lt;0.01؛ *** ف &lt;0.001). </li></ol></li></ol> 3. في فيفو مساريقي الإرواء نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد / جراحة الماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صيام الماوس في الليلة التي سبقت التجربة من أجل الحد من حركة الأمعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعطاء الماوس القديم 6-8 الأسبوع (C57BL / 6) التسكين قبل العملية من قبل الحقن تحت الجلد البوبرينورفين (0.1 ملغم / كغم من وزن الجسم (BW)) 20-30 دقيقة قبل الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين (125 ملغ / كغ BW) وزيلازين (12.5 ملغ / كغ BW). تحقق بواسطة دواسة المنعكس. تطبيق مرهم الطبيب البيطري لمنع جفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على وسادة التدفئة التي تسيطر عليها الحرارية عند 37 درجة مئوية على صينية المجهر. وبما أن هذا هو الإجراء المحطة، ليست هناك حاجة لascepti صارمةإجراءات ج. إجراء شق بالقرب من حبل الوريد، وإزالة بلطف الجانب الأيمن من عضلة عنق الرحم وعزل الوريد الوداجي من الأنسجة المحيطة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج 2 القسطرة الوريدية الفرنسية في الوريد الوداجي الأيمن للتسريب من البكتيريا fluorescently المسمى أو غيرها من الحلول. فتح التجويف البريتوني عن طريق شق البطن خط الوسط واستخدام قطعة قطن لنشر mesenterium وتصور تصلب المساريقي وتداول venular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على الجانب الأيمن على لوحة شفافة وتأمين قنية مع الشريط. استخدام حزمة الساخنة لمنع انخفاض حرارة الجسم. لمنع جفاف الأنسجة، وإسقاط 500 ميكرولتر 0.9٪ كلوريد الصوديوم في الأمعاء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضان المجهر من التصاق البكتيريا إلى الدورة الدموية المساريقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل في غرفة مظلمة. استخدام مسحات القطن لشل حركة السفن وتصور لهم تحت مجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق موضعيا 5 ميكرولتر من 10 ملي حل سو كا 2+ -ionophore A23187 الذائبة في DMSO. بعد 10 ثانية، وضخ 100 ميكرولتر المسمى البكتيريا (راجع الخطوة 1) عن طريق القسطرة الوداجي. التقاط صور مرور الزمن. بعد الانتهاء من التجربة، الموت ببطء الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المعتمدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل صورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور الحية باستخدام مجهر مضان مقلوب، استولت باستخدام كاميرا أبيض وأسود وتطويرها باستخدام أي برنامج التصوير. تطبيق الآلي وقت التعرض وعلى النقيض الأمثل محددة إلى المعدات المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الوقت الفاصل بين الصور باستخدام أداة &quot;اكتساب&quot; في شريط الأدوات (الاستحواذ متعددة الأبعاد - الوقت) باستخدام 40 دورات 1000 صور / ثانية. حفظ الصور في شكل ملف الصورة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صور العملية باستخدام برامج التحليل يماغيج لقياس مجال إشارة الفلورسنت في الصورة. تحديد عتبة لتعيين قيم العتبة الدنيا والعليا، بتجزئة حجم الصور الرمادي إلى وeatures من الفائدة. تحديد المنطقة ذات الاهتمام (الأوعية الدموية) وقياس مساحة محدودة للعتبة والمنطقة من الفائدة. مقارنة التصاق البكتيريا، كما أعرب عن منطقة الفلورسنت استخدام أي من البرامج الإحصائية أو الرسوم البيانية. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid/endothelial+cell+interaction+under+shear+stress.">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li><li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Willebrand+factor-binding+protein+(vWbp)+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase.">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li><li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation.">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation.">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections.">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li><li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

إجهاد القص هو عامل حاسم لالتصاق البكتيريا في وقت مبكر لجدار الوعاء الدموي وللجيل اللاحق من اللف أو تنبتات شغافية والتهابات النقيلي 4،5. وصفنا التكميلية في التجارب المختبرية والنماذج الحية لدراسة التسبب في العدوى داخل الأوعية الدموية تحت إجهاد القص الفسيولوجية. وقد سمحت هذه النماذج لنا التعرف فون ويلبراند ملزم عامل البروتين (vWbp) مثل S. الرئيسي البروتين الذهبية للتفاعل في إطار تدفق مع جدار الأوعية الدموية المصاب تعريض VWF 4. التهابات داخل الأوعية الدموية، والتهاب الشغاف على وجه الخصوص، مصدرا للقلق ليس فقط بسبب فشل الجهاز الناجم عن الإنتان والموت، ولكن أيضا بسبب (&#39;المتنقل&#39;) مضاعفات المحلية والبعيدة. أن تسبب التهاب الشغاف والتهابات المتنقل، والبكتيريا يجب أن تلتزم جدار الوعاء الدموي، وبالتالي مقاومة إجهاد القص المتدفقة الدم. معظمدراسات على البكتيريا الفوعة أجريت العوامل في ظروف ثابتة. ومع ذلك، قد أنشأت هذه التفاعلات لا تصمد أمام قوى القص والدراسات في ظل ظروف تدفق يمكن أن تكشف عن عوامل جديدة، غير المعترف بها سابقا في تفاعل البكتيريا المضيف. باستخدام غرفة تدفق الصغرى بالتوازي مع ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أهمية VWF للالتصاق الأوعية الدموية. تحت إجهاد القص، VWF تدريجيا يتفتح من هيكلها كروي يستريح، ويعرض المجال A1 التي تتفاعل مع الصفائح الدموية عن طريق مستقبلات GPIB 6 منه. تم غرف تدفق تستخدم على نطاق واسع لدراسة وظيفة الصفائح الدموية 7. ومن اللافت للنظر أيضا S. الذهبية التصاق تحت تدفق يتطلب VWF، وعلى وجه الخصوص في المجال A1 التي يتعرض لها على القص. حددنا vWbp للتوسط VWF ملزمة. vWbp هو المخثرة التي تساهم في S. الذهبية الفيزيولوجيا المرضية من خلال تفعيل البروثرومبين المضيف. Staphylothrombin، والدقةulting المجمع من المخثرة البكتيرية والبروثرومبين، يحول الفيبرينوجين إلى الليفين غير قابلة للذوبان 8،9. وقد أظهرت دراساتنا أن vWbp لا يتم تنشيط البروثرومبين فحسب، بل يؤدي تشكيل المجاميع البكتيريا الليفين، الصفائح الدموية، التي تعزز التصاق الأوعية الدموية تحت تدفق 4،10،11. في المختبر تدفق نموذج غرفة يسمح لدراسة مختلف اللاعبين في التصاق البكتيريا إلى المكونات الخلوية أو المصفوفة. عوامل الفوعة البكتيرية يمكن دراستها باستخدام المسوخ أو البكتيريا غير ضارة معربا عن البروتينات السطحية النوعية. بدلا من ذلك، مثبطات دوائية أو الأجسام المضادة حجب يمكن أن تضاف إلى المتوسطة في غرفة التدفق. دور العوامل المضيفة مثل مختلف مكونات المصفوفة خارج الخلية يمكن دراستها باستخدام coverslips مع الطلاء المختلفة. كما يمكن تغطيتها لل coverslips مع الخلايا البطانية، والتي من حالة التنشيط يمكن عن طريق التضمين مضيفا التحفيز والتشجيع محددة. APAغ من جدار الأوعية الدموية، ومساهمة من خلايا الدم المضيفة وبروتينات البلازما يمكن دراستها عن طريق إضافة هذه العوامل إلى المتوسطة المتدفقة. وبالتالي، يمكن دراسة ظروف مختلفة من التعقيد المتزايد في ظل ظروف موحدة للتدفق الصفحي لكشف التفاعلات التي تسمح للبكتيريا على الانضمام إلى جدار الوعاء الدموي في الجسم الحي. يتم دراسة التفاعلات التي تم تحديدها في نموذج في المختبر في وقت لاحق في نموذج حيواني لاختبار أهميتها في كائن معقد. البعض في النماذج الحية لدراسة التفاعلات الحيوية في ظل تدفق تم وصفها، مثل الهامستر ظهري طبقات الجلد الغرفة 12 ونموذج المشمرة 13. وبالمقارنة، فإن النموذج التروية المساريقي الموصوفة هنا يوفر العديد من المزايا بسبب سهولة استخدامه وإمكانية تختلف استضافة الخلفية الوراثية للفئران وتقييم التدخلات الدوائية. في الختام، ونماذج وصفهاتوفر إمكانية لدراسة البروتينات السطحية ليس فقط من S. الذهبية، ولكن العديد من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى في الخلفيات المضيف مختلفة، من أجل فهم أفضل التسبب في التهابات الأوعية الدموية.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

من أجل تسبب التهابات اللف والتهاب الشغاف، تحتاج البكتيريا لتكون قادرة على الانضمام إلى جدار الوعاء الدموي بينما التعرض للإجهاد القص المتدفقة الدم. تحديد العوامل البكتيرية والمضيفة التي تساهم في التصاق الأوعية الدموية من الكائنات الحية الدقيقة، وهناك حاجة إلى نماذج مناسبة دراسة هذه التفاعلات في ظل ظروف القص الفسيولوجية. هنا، نحن تصف في المختبر تدفق نموذج الغرفة التي تسمح للتحقيق التصاق البكتيريا لمختلف مكونات المصفوفة خارج الخلية أو الخلايا البطانية، ونموذج intravital المجهري التي وضعت لتصور مباشرة التصاق الأولي من البكتيريا إلى الدورة الدموية في الجسم الحي حشوي . ويمكن استخدام هذه الأساليب لتحديد العوامل البكتيرية والمضيفة اللازمة لالتصاق البكتيريا تحت التدفق. نحن لتوضيح أهمية إجهاد القص ودور عامل فون ويلبراند للالتصاق Staphylococcus الذهبية باستخدام كل من في المختبر، ونموذج الجسم الحي.

S. الذهبية الانضمام إلى VWF، مصفوفة تحت البطانة والخلايا البطانية هي ظاهرة تعتمد إجهاد القص التأكيد على دور إجهاد القص في التفاعل بين S. الذهبية وVWF، أجرينا perfusions على VWF يعطى coverslips المغلفة بأسعار القص المختلفة (لمحة التخطيطي للفي المختبر نموذج نضح في الشكل 1. التصاق S. الذهبية لVWF زيادة مع زيادة معدلات القص من 250 ثانية -1 إلى 2000 ثانية -1 (الشكل 2)، مشيرا إلى أن قوى القص عالية لا تمنع إلا أن يؤكد التصاق البكتيريا إلى VWF. من أجل تحقيق مساهمة VWF لالتصاق البكتيريا إلى الكولاجين، والمكون الرئيسي للمصفوفة تحت البطانة، ونحن perfused لfluorescently المسمى S. الذهبية على الكولاجين في وجود أو عدم وجود VWF. في غياب VWF، التصاق S. لانخفضت ureus الكولاجين مع زيادة معدلات القص. ومع ذلك، عندما كان VWF الحالي على المدى المتوسط، والتصاق S. زيادة الذهبية مع تزايد معدلات القص (الشكل 3). في المختبر نموذج تدفق يسمح لنا أيضا لدراسة التصاق البكتيريا إلى الخلايا البطانية تحت التدفق. نحن perfused لHUVECs مع fluorescently المسمى S. الذهبية في معدلات القص من 500 إلى 2000 ثانية -1. حيث أشار، وتنشيط HUVECs مع الكالسيوم 2+ -ionophore، أو التسبب في الإفراج عن VWF. تنشيط الخلايا البطانية وإطلاق سراح VWF لاحق، وزيادة التصاق S. الذهبية (الشكل 4A)، والتي شكلت أنماط نموذجية &quot;مثل سلسلة&quot; المسمى من fluorescently المجموعات البكتيرية الانحياز في اتجاه قوة القص (الشكل 4B)، مما يشير إلى الربط من البكتيريا على طول امتدت خطية VWF الجزيء. الأولي في الجسم الحيوتتوسط التصاق البكتيريا في الأوردة حشوي التي كتبها VWF منذ S. العنقودية الذهبية هي قادرة على التمسك VWF، استخدمنا الفئران wildtype (VWF + / +) وVWF التي تعاني من نقص الفئران (VWF - / -) لتحقيق التصاق البكتيريا لجدار الوعاء الدموي تفعيلها في الجسم الحي. في الوقت الحقيقي videomicroscopy الأوردة حشوي يسمح التصور في الجسم الحي تعميم fluorescently المسمى S. الذهبية (نظرة عامة تخطيطي لفي الجسم الحي نموذج نضح تتمثل في الشكل 5). بعد تفعيل الدوائية من البطانة التي كتبها كا 2+ -ionophore، لاحظنا تراكم المحلي السريع للبكتيريا الفردية ومجاميع من البكتيريا لجدار الوعاء الدموي من WT الفئران (فيديو التكميلي 1 و 2). وقد لوحظ أي ما يقرب من التصاق البكتيريا على جدار الوعاء الدموي تفعيلها من VWF -deficieالإقليم الشمالي الفئران (التكميلي فيديو 3) مقارنة مع التصاق في الفئران WT (الشكل 6). غياب VWF يقلل من قدرة S. الذهبية التمسك جدار الوعاء الدموي تفعيلها. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> الشكل 1. تمثيل تخطيطي للفي المختبر نموذج التدفق. في المختبر نموذج تدفق هو نموذج متعدد الوظائف، والذي يسمح بدراسة مختلف الآليات التي تعتمد القص مثل التصاق البكتيريا إلى مصفوفة تحت البطانة ولكن أيضا الجلطة التشكيل. يتم وضع غرفة تدفق مواز الصغيرة على ساترة (البلاستيك أو الزجاج) مع طبقات مختلفة من البروتينات والخلايا البطانية. التصاق البكتيريا المختلفة (البرتقال والنقاط الرمادية) يمكن تحليلها، وتأثير وجود بروتينات البلازما، الصفائح الدموية والدم كله يمكن تقييمها. علامات الفلورسنت لالصفائح الدموية (بيضاوية اللون الأزرق) أو fibrinogEN (سلاسل الزرقاء) يمكن أن تستخدم في تركيبة مع مثبطات مختلفة (البيضاوية السوداء) للتمييز العوامل البكتيرية والمضيفة. صور تمثيلية من التصاق البكتيريا من S. وتظهر الذهبية لطلاء الكولاجين في وجود (القاع) أو غياب (أعلى) من VWF (شريط المقياس هو 100 ميكرون). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> الشكل 2. التصاق S. الذهبية للزيادات VWF مع زيادة معدلات القص. مايكرو مواز نضح غرفة تدفق أكثر المغلفة VWF (50 ميكروغرام / مل) مع fluorescently المسمى S. الذهبية نيومان في معدلات القص من 250 إلى 2000 ثانية -1 (ثانية -1) في المتوسط ​​(ن&gt; 5). يتم التعبير عن جميع النتائج كما يعني ± SEM. * P &lt;0.05، ** p &lt;0.01. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> الشكل 3. التصاق S. الذهبية لتحت البطانة غير القص وVWF يتوقف. مايكرو مواز نضح غرفة تدفق أكثر من الكولاجين المغلفة (160 ميكروغرام / مل) مع fluorescently المسمى S. الذهبية نيومان في معدلات القص من 250 إلى 2000 ثانية -1 في المتوسط ​​(ن&gt; 5). كان VWF (60 ميكروغرام / مل) الحالي على المدى المتوسط ​​حيث المشار إليها. يتم التعبير عن جميع النتائج كما يعني ± SEM. ** p &lt;0.01. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> الرقم 4. التصاق S. الذهبية لتنشيط الخلايا البطانية هو القص تعتمد. غرفة تدفق نضح مايكرو مواز على الخلايا البطانية. تم تفعيلها (A) الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان مع الكالسيوم 2+ -ionophore A23187 (0.1 ملم) يليه نضح 10 دقيقة وصفت من fluorescently S. الذهبية نيومان في معدلات القص من 500 إلى 2000 ثانية -1 في المتوسط ​​(ن&gt; 5). يتم التعبير عن جميع النتائج كما يعني ± SEM. * P &lt;0.05. (B) صورة الصغرى مواز غرفة تدفق نضح على HUVECs تفعيلها مع S. الذهبية بمعدل القص من 1000 ثانية -2. S. الذهبية تشكل سلاسل ± 200 ميكرون طول، مما يشير إلى الانضمام إلى multimers VWF (شريط المقياس هو 100 ميكرون). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> يتم إدخال الرقم 5. لمحة التخطيطي للفي الجسم الحي نموذج التروية المساريقي. حق الوريد الوداجي القسطرة (الخط الأصفر) لإدارة فلورالبكتيريا المسماة escently (نقطة البرتقالي)، ومواد التخدير إضافية أو المكونات الأخرى مثل مثبطات الدوائية والأجسام المضادة. فتح التجويف البريتوني وينتشر mesenterium لتصور الأوعية الدموية (الأوردة والشرايين) تحت المجهر مضان. بعد تفعيل الدوائية من البطانة من قبل -ionophore الكالسيوم 2+، الذي يدفع الافراج عن VWF، يمكن حقن البكتيريا عن طريق الوريد الوداجي القسطرة. الفيديو في الوقت الحقيقي داخل الأوعية المجهر يسمح التصور في الجسم الحي تعميم البكتيريا fluorescently المسمى ونتج ذلك عن تكوين البكتيريا الصفائح الدموية الجلطة الدموية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> الرقم 6. التصاق الأولي من S. الذهبية<html> ليتم بوساطة البطانة تفعيلها في الحي بواسطة VWF في الجسم الحي وريدي المساريقي نموذج نضح مع C57BL / 6- VWF + / + وC57BL / 6- VWF - / - الفئران. التصاق المسمى من fluorescently S. الذهبية لجدار الوعاء الدموي تفعيلها محليا هو أقل من ذلك بكثير في VWF - / - الفئران. يتم التعبير عن جميع النتائج كما يعني ± SEM. *** P &lt;0.001، ن&gt; 7. <img alt="فيديو الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> الفيديو 1: في الوقت الحقيقي التصاق S. الذهبية لتنشيط جدار الوعاء الدموي في VWF + / + الفئران. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.</a> FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="فيديو الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV2.jpg" /> فيديو 2: في الوقت الحقيقي تشكيل الكلي والانصمام من S. الذهبية في VWF + / + الفئران. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.</a> <img alt="فيديو الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> الفيديو 3: في الوقت الحقيقي التصاق S. الذهبية لتنشيط جدار الوعاء الدموي في VWF - / - الفئران في الجسم الحي المساريقي نموذج نضح مع VWF + / + وVWF - / - الفئران. وكان خمسة ميكرولتر من الكالسيوم 2+ -ionophore (10 ملم) APPLIإد إلى المنطقة من السرير الوعائي تصور. A تعليق المسمى كربوكسي فلوريسئين-S. تم حقن الذهبية عن طريق القسطرة الوداجي. وتصور تداول المساريقي تحت مجهر مقلوب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.5K Views.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

Video: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

على<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة عدم تجانس التمايز بلعم الإنسان والاستقطاب

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

أنسنة نموذج الفأر لدراسة الالتهابات البكتيرية استهداف الأوعية الدموية الدقيقة

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

فحوصات لدراسة دور فيترونيكتين في التصاق البكتيريا ومقاومة المصل

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...