Este estudo foi financiado por doações do Conselho Sueco de Pesquisa (90293501, A0290401, A0290402), Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia ao abrigo do contrato de concessão n ° 602699 (DIREKT), a Fundação NovoNordisk, a Fundação Gurli e Edward Brunnberg, Caule Therapy, Vleugel Fundação e Åke Fundação Wiberg.

NOTA: O sangue foi coletado de indivíduos saudáveis ​​por punção venosa sistema aberto em aprovação junto do Conselho de Revisão de Ética em Uppsala (Alvará nº 2008/264). 1. Semeadura Células <ol><li> Culturas primárias de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) a 37 ° C em 5% de CO 2 em frascos T75 revestidos com gelatina a 1% em PBS pH 7,4. </li><li> Remover o meio de cultura a partir de um frasco T75 contendo HUVEC (ou outro tipo de células endoteliais humanas primárias) e lavar as células com EDTA 2,1 mM em PBS, pH 7,4. Separar as células por adição de 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubando durante 2-3 min em 37 ° C. </li><li> Recolher as células por lavagem do frasco com 9 ml de 10% de FBS em PBS pH 7,4 e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml. Girar as células a 735 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento de células em meio de crescimento celular endotelial microvascular (CE GMMV) e contar as células numa câmara de Burker. Semente 21.000 cells / cm 2 em 1 poços lâminas de cultura de células e incubar a 37 ° C. As HUVEC confluentes depois vai ser 1-2 dias de cultura. Monitorar a morfologia celular e confluência diariamente sob um microscópio de luz. </li></ol> 2. Preparação de Sangue Total <ol><li> Preparar todas as superfícies artificiais que estarão em contacto com o sangue com uma dupla camada de heparina imobilizada (CHS) de acordo com as instruções do fabricante. CHS materiais revestidos protegidos do pó pode ser armazenado a temperatura ambiente até 6 meses, sem perda de função. </li><li> Use punção venosa sistema aberto para extrair o sangue de um dador saudável pouco (&lt;30 min) antes de iniciar o experimento câmara endotelial arterial. Pares de uma agulha hipodérmica (18 G x 50 mm) com a HSC tubo flexível de silicone revestido (diâmetro interno: 2 mm), antes de recolher o sangue cuidadosamente num tubo de 50 ml revestido a CHS. Suplemento de sangue com heparina não fraccionada para alcançar uma concentração final de 0,75 UI / ml. Misture delicadamente o sangue por inverting o tubo 2-3 vezes. </li></ol> 3. Sangue endotelial Câmara Modelo <ol><li> Fabricar câmaras de sangue (Figura 1A; vista superior) em polimetilmetacrilato acrílico (PMMA), que consiste de dois cilindros (oito milímetros de altura e raio 9 mm) que são coladas a uma lâmina de PMMA (25 x 75 mm). Montar as bordas dos cilindros virados para cima com borracha O-rings para vedar a câmara sanguínea contra as lâminas de vidro com as células endoteliais em cultura (Figura 1B). Rodar as câmaras sanguíneas ligados ao slide de cultura com células endoteliais em seguida numa posição vertical (Figura 1C). </li><li> Use uma ponteira CHS revestido de transferir 1,5 ml de sangue para cada CHS revestidos câmara com cuidado para não ativar o sangue. </li><li> Transferir 1 ml de sangue em tubos de microcentrífuga contendo 30 ul de EDTA 0,34 MK 3 para atingir uma concentração final de 10 mM de K 3 EDTA para determinação das concentrações plasmáticas de proteína inicial usandoum ensaio imunoenzimático (ELISA). Misturar cuidadosamente o sangue e manter os tubos em gelo. </li><li> Retirar as paredes de plástico das lâminas de vidro de cultura de células de acordo com as instruções do fabricante e lava-se cuidadosamente as células em PBS pH 7,4. Certifique-se de remover posteriormente o máximo de líquido possível dos slides. Não deixe que as células secar. </li><li> Colocar a lâmina no topo das câmaras sanguíneas, com células de frente para o sangue. Prenda o slide, colocando uma braçadeira ao redor da câmara de células endoteliais do sangue. Use uma lâmina de plástico para suporte adicional para evitar a ruptura da cultura de células de vidro deslizante ao colocar a braçadeira. </li><li> Fixar a câmara de células endoteliais do sangue em uma roda giratória (40 cm de diâmetro) coloque em um banho de água a 37 ° C. Rodar cada câmara na roda a 0,5 xg durante 30 min. </li><li> Após a incubação, desmontar a câmara da célula endotelial arterial. Lavar as lâminas de cultura de células em PBS pH 7,4 e consertar as células em gelo frio 1% de paraformaldeído (PFA) fou 10 min. Transferir 1 ml de sangue de cada câmara para tubos de microcentrífuga contendo 30 ul de EDTA 0,34 MK 3 para atingir uma concentração final de 10 mM de K 3 EDTA e misturar os tubos suavemente. Manter os tubos em gelo. </li><li> Centrifugar os tubos a 4560 xg durante 10 min em 4 ° C. Transfira o plasma sanguíneo para novos tubos de microcentrifuga e armazenamento em -70 ° C até análise posterior. </li></ol> 4. Análise de Sangue endotelial Interações <ol><li> Realize coloração de imunofluorescência com o mouse anti-CD16 humano seguido de cabra secundário anti-rato Alexa 488 e phalloidin-TexasRed. Executar cada etapa de coloração durante 1 hora à temperatura ambiente e lava-se as lâminas em PBS pH 7,4 entre cada passo. Contracoloração os núcleos com DAPI durante 10 min a temperatura ambiente. Analise componentes sanguíneos ligados às células endoteliais por microscopia de fluorescência, em combinação com análise de imagem utilizando software de análise de imagem adequado, tal como CellProfiler. </li><li> Quantify as reacções no compartimento de sangue com trombina-antitrombina (TAT) como ELISA acordo com as instruções do fabricante das amostras de plasma. </li><li> Use ferramentas estatísticas adequadas, por exemplo., Um teste t não pareado, para analisar os dados. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Várias interacções entre a parede do vaso sanguíneo e são normalmente mantidos num estado de repouso, devido à natureza não-adesiva e anti-trombótica do endotélio. 7 Durante condições patológicas que envolvem inflamação, o endotélio é activado com um consequente aumento na expressão de receptor de adesão e 8 uma capacidade reduzida de inibir a hemostasia. 9 A activação dos sistemas de cascata no sangue por sua vez, amplia a trombogenicidade do endotélio causando ainda mais recrutamento de leucócitos e trombose. 10 Para obter uma melhor compreensão das interacções entre esta delicadas células endoteliais e sangue total, temos desenvolveram um novo método in vitro onde as células endoteliais em cultura são colocadas em contacto com o sangue total. Para o nosso conhecimento, a nossa configuração é o primeiro a mostrar as células endoteliais incubadas com sangue humano inteiro com nenhum ou muito pouco anticoagulante por períodos de tempo mais longos. nt &quot;&gt; A sensibilidade deste sistema é activado por punção venosa sistema aberto em combinação com uma camada protectora de heparina imobilizada em todas as superfícies colocadas em contacto com o sangue. A utilização de um sistema aberto durante a recolha de sangue reduz a activação dos sistemas de cascata durante a punção venosa embora permita o uso de uma quantidade de auto-determinada de anticoagulante. tubos de sangue evacuados comercialmente disponíveis podem, no entanto, ser utilizadas, dependendo dos pontos finais pretendidos do estudo. A concentração final de anticoagulante adicionados a tubos de sistema fechado mais disponíveis comercialmente podem inibir sensível e, caso contrário difícil de estudar, interacções na configuração. 6 Uma superfície protectora heparina elimina adicionalmente a activação de sangue através de contacto de superfície por quaisquer outras do que as células endoteliais superfícies. 5 De fato, a incubação de sangue completo suplementado com uma pequena quantidade de heparina não fraccionada em câmara, sem a protecção de CHS resultou na formação do coágulo. <pclasse = &quot;jove_content&quot;&gt; A bolha de ar no interior da câmara permite que a mistura do sangue durante a incubação com as células endoteliais. A fim de avaliar o efeito do tamanho da bolha de ar, foram usados ​​dois volumes de sangue diferentes. Neste modelo, medimos os níveis de TAT semelhantes independentemente do tamanho da bolha de ar nas câmaras de incubação com HUVEC. TAT foi, no entanto, aumentada com um tamanho de bolha de ar menor nos totalmente CHS tratada câmaras. Isto, em conformidade com o descrito anteriormente as propriedades das células endoteliais 11, indica um efeito regulador sobre o aumento da activação da coagulação fornecida pelas células endoteliais que estão ausentes na câmara de CHS inerte. A bolha de ar no sistema cria um fluxo mediante a rotação da câmara. O tamanho da bolha irá afectar as forças dentro deste sistema rotativo. Isto é mostrado pelos nossos resultados na Figura 2D eram uma bolha menor cria TAT valores mais elevados representam uma diminuição da força sobre o sangue ou seja, o movimento de sangueno interior da câmara é menor e, assim, a activação do sistema de cascata ocorre a uma maior extensão. Deve mencionar-se que neste sistema que estão a criar um fluxo rotativo que irá ser diferente da velocidade através da câmara, com a maior velocidade ao longo das paredes e com o menor no centro. Isso obviamente não é um ambiente ideal no que diz respeito ao fluxo e tensão de cisalhamento para as células endoteliais, mas ainda temos um sistema de produção de resultados estáveis ​​e repetíveis. Mais condições óptimas incluiria fluxo laminar que circula na ausência de turbulência. Esta é, no entanto, não é possível no modelo representado aqui e para o nosso conhecimento de um tal sistema não está disponível até à data. Embora, existem vários sistemas de microfluido comercialmente disponíveis, que não são possíveis de se combinar com o sangue total sem ou com baixos níveis de anticoagulante adicionado ao sistema, assim, deixar de permitir a avaliação sensível adequada das interacções entre todos os componentes presentes no sangue e células endoteliais. Além disso, houve um aumento de 2 vezes no recrutamento de células sanguíneas para TNFa HUVEC activadas em combinação com a formação de TAT duplicou independentemente do volume de sangue. Isto verifica a estabilidade do sistema de modelo e mostra também a possibilidade de usar um endotélio activado em combinação com sangue total. Futuro em diante, a câmara da célula endotelial sangue pode ser usado para investigar o recrutamento de células do sangue para as células endoteliais activadas por uma variedade de marcadores expressos em células em várias condições e fases de activação. Além disso, o modelo pode ser usado em combinação com agentes farmacológicos, a fim de avaliar os efeitos sobre as condições inflamatórias. Em resumo, mostramos o grande benefício da combinação de um modelo de câmara com as células do sangue e vasculares humanos para criar um ser humano completo em sistema in vitro para realizar investigações relevantes da doença vascular.

Métodos de análise de interações vascular de sangue na doença cardiovascular geralmente envolvem experimentos de pesquisa animal. Resultados criados em modelos animais experimentais de pesquisa pode, no entanto, têm pouca ou nenhuma incidência da doença humana 1,2 Como tal., Existe uma necessidade de uma boa e fiável em modelos in vitro para investigar interacções celulares entre o compartimento do sangue e as células endoteliais vasculares em um sistema semelhante à humana. Temos, portanto, estabeleceu um modelo de câmara de células endoteliais do sangue. Este baseia-se num modelo descrito anteriormente utilizados para investigar interacções entre os biomateriais e sangue humano inteiro. 3 Contrariamente a outras configurações onde in vitro geralmente limitado número de componentes purificados, isto é, trombócitos, leucócitos ou células endoteliais estão disponíveis, o presente modelo incorpora todos os componentes presentes em um vaso sanguíneo. A configuração do endotelial sangue cmodelo de câmara ell é projetado para permitir o uso de sangue humano recém-colhida com pouco ou nenhum anticoagulante adicionada. Sangue armazenado durante períodos de tempo mais longos adquirir chamada lesões de armazenamento, onde quebra de eritrócitos podem interferir com delicadas interacções entre o sangue e as células endoteliais 4. Para evitar a formação de coágulos durante o manuseio de sangue total ex vivo requer ou altas doses de anticoagulante ou que todo o material em contato com o sangue tem que ser não-activação. Como superfícies não-activação são raros no ambiente de laboratório, os materiais podem, alternativamente, ser equipado com uma camada protectora de heparina imobilizada. Uma camada protectora de heparina imobilizada (daqui em diante referida como superfície Corline heparina (CHS)) que pode ser aplicado à maioria dos materiais que criam uma superfície de contacto com o sangue, onde pode ocorrer sem causar uma activação da cascata de coagulação. 5 Assim, por fornecer as câmaras com CHS, a ce endotelial sanguell modelo de câmara permite a utilização de concentrações muito baixas de anticoagulante no sangue. Evitando a adição de elevadas concentrações de anticoagulante no modelo de câmara endotelial sangue faz com que seja possível estudar interacções sensíveis no interior de um vaso sanguíneo que de outro modo poderiam ser mascarados 6. O modelo de câmara da célula endotelial arterial consiste de duas câmaras formadas anexando cilindros de plástico (altura: 8 mm; Radio: 9 mm) para uma lâmina de microscópio de plástico. Os bordos virados para cima sobre os cilindros estão equipados com ranhuras que são equipados com anéis de vedação de borracha usados ​​para vedar as câmaras de encontro à corrediça de cultura de células. As câmaras são só parcialmente cheios com o sangue como o ar deixado na câmara mantém o sangue em circulação, quando as câmaras são posteriormente rodado na posição vertical (Figura 1). A fim de avaliar a funcionalidade do modelo, foi realizada experimentos com qualquer uma CHS completamente revestidocâmara ou Umbilical Humano Veia células endoteliais (HUVEC). Dois volumes separados de sangue foram ensaiadas e a formação de trombina antitrombina (TAT), complexos de (um marcador indirecto de coagulação) foi medida com o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Em seguida, avaliaram o efeito de volumes de sangue e fator de necrose tumoral (TNF) estimulou as células endoteliais sobre o recrutamento de leucócitos por análise de imagem. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Figura 1. Configuração do modelo de câmara de células endoteliais do sangue. (A) Vista superior de desenho esquemático da câmara de sangue feitos em PMMA. (B), as células endoteliais humanas primárias são cultivadas em lâminas de câmaras 1 poços. De sangue total humano fresco é adicionado para duas câmaras numa lâmina de microscópio. As câmaras e todos os materiais utilizados para o manuseamento de sangue são tratadas com um revestimento protector HS. Depois de retirar as paredes do cell corrediça cultura, as células são colocadas de frente para o sangue e o sistema é fechado com grampos. câmaras de célula (C) O endotelial sangue são então incubadas em condições de rotação em 37 ° C. Posteriormente, as reacções no compartimento do sangue pode ser analisada por ELISA e as células endoteliais podem ser analisadas por microscopia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

A maioria de todas as doenças conhecidas são acompanhadas por perturbações do sistema cardiovascular. Os estudos sobre a complexidade das vias que interagem activados durante a patologias cardiovasculares são, no entanto, limitada pela falta de métodos robustos e fisiologicamente relevantes. De forma a modelar eventos patológicos vasculares temos desenvolvido um ensaio in vitro para estudar a interacção entre o endotélio e sangue total. O ensaio consiste em células endoteliais humanas primárias, que são colocados em contacto com o sangue total humano. O método utiliza sangue nativo com muito pouco ou nenhum anticoagulante, permitindo estudo das interacções entre os componentes delicados moleculares e celulares presentes em um vaso sanguíneo. Foi investigada a funcionalidade do ensaio, comparando a activação da coagulação por diferentes volumes de sangue incubadas com ou sem células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Considerando um volume de sangue maior contribuído paraum aumento na formação de trombina antitrombina (TAT) complexos, presença de HUVEC resultou na activação da coagulação reduzida. Além disso, foi aplicada a análise de imagens de fixação de leucócitos para HUVEC estimulado com fator de necrose tumoral (TNF) e encontrou a presença de células CD16 + para ser significativamente maior em TNFa estimulou as células, em comparação com células não estimuladas após o contato do sangue. Em conclusão, o ensaio pode ser aplicado para estudar as patologias vasculares, em que as interacções entre o endotélio e o compartimento do sangue são perturbados.

A necessidade do CHS Coating A fim de medir as reacções específicas em sangue total para aqueles induzido pelas células endoteliais, todos os materiais utilizados para a câmara da célula endotelial arterial deve ser fornecida com um revestimento CHS antes da utilização. A Figura 2A (à esquerda) mostra uma câmara não revestidos após 30 min de contato do sangue com um presente coágulo claramente visível. Tratar com a câmara de CHS (Figura 2A, à direita), por outro lado protege o sangue a partir da activação descontrolada, assegurando que os resultados são devido às interacções de células endoteliais-sangue. O efeito do volume de sangue na Câmara Ativação da coagulação é mais provável em sangue estagnado como a probabilidade de interação entre os fatores de coagulação ativados é aumentada. No modelo de câmara da célula endotelial de sangue, o sangue é mantido em movimento, devido à circulação de uma bolha de ar no interior da câmara. Em order para determinar o efeito das variações no volume de sangue, e portanto, também o tamanho da bolha de ar, uma câmara de CHS revestido foi ligado a uma lâmina de vidro revestida CHS que foi testada com 1,5 ml ou 1,75 ml de sangue total para 30 minutos. O volume de sangue sem qualquer movimento pela bolha de ar é 2,5 vezes maior quando 1,75 ml de sangue é adicionado à câmara quando comparado com 1,5 ml de sangue é usado (Figura 2B). Os valores medidos TAT sugeriu aumento TAT-formação com o aumento do volume de sangue (Figura 2D). Quando HUVEC (Figura 2C) foram incubadas ou com 1,5 ou 1,75 ml de sangue completo, nenhuma diferença foi observada entre os dois grupos, sugerindo que as células endoteliais podem modular a activação da coagulação (Figura 2D). O efeito do TNF no recrutamento de células do sangue e ativação da coagulação A fim de estudar o efeito do TNFa sobre o recrutamento de leucócitos, as HUVEC foram mimoed com 20 ng / ml TNF 4 horas antes do contato do sangue. O contato do sangue - quer com 1,5 ml ou 1,75 ml de sangue - foi continuada durante 30 min, após o que as lâminas de cultura foram coradas para CD16 (Figura 2F), representada por imagem e o número de células CD16 + foi quantificado. O recrutamento de células CD16 + aumentou significativamente com o tratamento com TNFa (Figura 2E) 100-256 células CD16 + / mm 2 (p &lt;0,0001), com 1,5 ml de sangue e 172-378 (P &lt;0,0001) com 1,75 ml de sangue. A formação de complexos de TAT foram medidos nas amostras de plasma correspondentes do sangue incubadas com células ou TNFa tratados ou não tratados (Figura 2G). Células de TNFa estimulada induzida uma duplicação aproximada dos complexos de TAT em comparação com células não tratadas. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Figoure 2: Funcionalidades do modelo de câmara de células endoteliais do sangue. (A), com ou sem câmaras CHS foram incubadas com sangue inteiro. Sem CHS, um coágulo foi formado após 30 min. Medição da trombina-antitrombina (TAT) complexos, um marcador indireto de coagulação, no sangue incubadas sem CHS foi&gt; 6000 mg / ml. (B) O volume de sangue não continuou se movendo pela bolha de ar em rotação varia de acordo com diferentes volumes de sangue. Com a adição de 1,5 ml de sangue, este volume será de 0,3 ml, ao passo que irá aumentar para 0,74 ml com a adição de 1,75 ml. (C) HUVEC com imagens de microscopia de contraste de fase típica mostram a morfologia das células endoteliais de uma monocamada confluente antes de contato do sangue. (D) os valores TAT para câmaras completamente CHS revestidos mostram uma ligeira diferença quando diferentes volumes de sangue são adicionados. A adição de 1,5 ml de sangue resultou em 35 ± 11 ug / ml (n = 7) em comparação com 1,75 ml, o que resultou em 8577; 70 ug / ml de TAT (n = 8). Esta diferença já não está presente quando as HUVEC foram incubadas com os mesmos volumes do sangue; 66 ± 55 ug / ml para 1,5 ml (n = 5) e 66 ± 29 ug / ml para 1,75 ml (n = 7). (E) Quantificação do número de células CD16 + presentes em ambos não estimuladas ou estimuladas TNFa HUVEC depois contato do sangue. O número de células CD16 + é significativamente aumentada com TNFa estimulado células incubadas quer com 1,5 ml (basais: 100 ± 40 células / mm; TNFa: 256 ± 121 células / mm) ou 1,75 ml (basais: 172 ± 67 células / mm; TNF: 378 ± 185 células / mm) de sangue total (F) Imagens representativas de não estimulada e TNF estimulada HUVEC coradas para phalloidin (vermelho), CD16 (verde) e DAPI (azul).. Barra de escala = 250 um (L) A formação de complexos TAT é aproximadamente o dobro TNFa estimulada por células, em comparação com células não tratadas foram incubadas com sangue (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 vezes mais TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 vezes mais TAT, n = 4). Todos os valores são apresentados como média ± desvio padrão; os valores de p foram calculados por meio de testes t não pareado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K visualizações.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Vídeo: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Imunologia e Infecção

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Ceratite herpética recorrente Estroma em camundongos, um modelo para estudar HSK Humanos

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Desenvolvimento e Identificação de uma subpopulação Novel dos fagócitos Human Giant neutrófilos derivado<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-imunoprecipitação ensaio para estudar interações funcionais entre receptores e enzimas

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...