Это исследование было поддержано грантами Шведского исследовательского совета (90293501, A0290401, A0290402), Седьмой рамочной программы Европейского сообщества по договору безвозмездной N ° 602699 (директ), НовоНордиск Фонд, Gurli и Эдвард Brunnberg Фонд, стволовых терапия, Vleugel Фонд и Оке Виберг Фонд.

ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь брали из здоровых лиц по открытой системы вены в утверждении с этике Совета в Упсале (Разрешение № 2008/264). 1. Посев Клетки <ol><li> Культура первичные эндотелия пупочной вены человека (HUVEC-клетки) при 37 ° С в 5% СО 2 в колбах Т75 с покрытием с 1% желатина в PBS, рН 7,4. </li><li> Удаление питательной среды от T75 колбу, содержащую HUVEC (или другого типа первичных эндотелиальных клеток человека) и промыть клетки с 2,1 мМ ЭДТА в PBS, рН 7,4. Отделить клетки путем добавления 1 мл 0,25% трипсин-ЭДТА и инкубации в течение 2 - 3 мин в 37 ° С. </li><li> Сбор клеток путем промывки колбу с 9 мл 10% FBS в PBS, рН 7,4, и передачи клеточной суспензии в 15 мл пробирку. Спин вниз клетки при 735 х г в течение 5 мин. </li><li> Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют осадок клеток эндотелия в среде роста клеток микрососудистой (ЕС GMMV) и подсчет клеток в камере Бюркера. Семенной 21000 Cлоктей / см 2 в 1-луночных слайдов культуры клеток и инкубируют при 37 ° С. HUVEC будет конфлюэнтны после 1 - 2 дней культивирования. Контролировать морфологию клеток и слияния ежедневно под световым микроскопом. </li></ol> 2. Подготовка цельной крови <ol><li> Подготовьте все искусственные поверхности, которые будут в контакте с кровью с двойным слоем фиксированного гепарина (СГГ) в соответствии с инструкциями изготовителя. Материалы с покрытием CHS защищено от пыли можно хранить при комнатной температуре в течение 6 месяцев без потери функции. </li><li> Используйте открытые системы венепункции до крови от здорового донора вскоре (&lt;30 мин) до начала эксперимента эндотелия камеры кровь. Пара Игла (18 г х 50 мм), чтобы CHS кремния с покрытием трубки (внутренний диаметр: 2 мм), прежде чем тщательно сбора крови в 50 мл CHS покрытием трубки. Дополнение крови с НФГ достичь конечной концентрации 0,75 МЕ / мл. Смешайте кровь осторожно INVErting трубы 2 - 3 раза. </li></ol> 3. Кровь эндотелия палата Модель <ol><li> Изготовление камер крови (рис 1А; вид сверху) в акриловой полиметилметакрилата (ПММА), состоящей из двух цилиндров (высота 8 мм и радиус 9 мм), склеенных к слайду ПММА (25 х 75 мм). Установите края цилиндров, стоящих перед вверх с резиновыми уплотнительными кольцами для уплотнения камеры крови против стеклах с культивируемых эндотелиальных клеток (рис 1b). Поворот камеры в крови, подключенные к культуральной слайда с эндотелиальными клетками после этого в вертикальном положении (рис 1С). </li><li> Используйте CHS покрытую пипетки для переноса 1,5 мл крови в каждый CHS покрытием камеры уход принимая не активировать кровь. </li><li> Передача 1 мл крови в микроцентрифужных пробирках, содержащих 30 мкл 0,34 MK 3 ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ K 3 ЭДТА для определения концентрации белка в плазме с использованием начальноетвердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Тщательно перемешать и хранить кровь пробирки на лед. </li><li> Снять пластиковые стенки клеточных культур стеклах в соответствии с инструкциями изготовителя и тщательно промыть клетки в PBS рН 7,4. Убедитесь, что впоследствии удалить столько жидкости, сколько возможно из слайдов. Не позволяйте клетки высыхают. </li><li> Поместите слайд в верхней части камер крови, с клетками, с которыми сталкивается кровь. Закрепите слайд, поставив зажим вокруг эндотелиальных клеток в крови камеры. Используйте пластиковый слайд для дополнительной поддержки, чтобы избежать поломки предметное стекло для культивирования клеток при размещении зажим. </li><li> Закрепите камеру эндотелия в крови клеток на вращающемся колесе (40 см в диаметре) место в водяной бане при 37 ° C. Поворот каждую камеру на колесе при 0,5 мкг в течение 30 мин. </li><li> После инкубации демонтировать эндотелиальных клеток в крови камеру. Вымойте культуры клеток слайдов в PBS рН 7,4 и фиксации клеток в лед холодной 1% параформальдегиде (PFA) еили 10 мин. Передача 1 мл крови из каждой камеры к микроцентрифужных пробирках, содержащих 30 мкл 0,34 МК 3 ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ K 3 ЭДТА и смешать пробирки осторожно. Держите пробирки на лед. </li><li> Центрифуга трубки при 4560 х г в течение 10 мин в 4 ° С. Перенесите плазму крови к новым микропробирок и магазин в -70 ° C до дальнейшего анализа. </li></ol> 4. Анализ крови эндотелиальных взаимодействий <ol><li> Выполнение иммунофлуоресцентного окрашивания с мышиного антитела против человеческого CD16 с последующим вторичным козьим антителом против мышиного Alexa 488 и фаллоидином-TexasRed. Выполнение каждого этапа окрашивания в течение 1 ч при комнатной температуре и мыть слайды в PBS, рН 7,4 между каждым шагом. Контрастное ядер с DAPI в течение 10 мин при комнатной температуре. Анализ компонентов крови, связанные с эндотелиальных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии в сочетании с анализа изображений с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений, таких как CellProfiler. </li><li> QuantiFY реакции в отсеке крови с тромбином антитромбина (ТАТ) ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя образцов плазмы. </li><li> Используйте соответствующие статистические инструменты, например., Непарный т тест, чтобы проанализировать данные. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Множественные взаимодействия между кровью и стенкой сосуда, как правило, поддерживают в состоянии покоя в связи с неклейкой и анти-тромботической природы эндотелия. 7 Во патологических состояний, связанных с воспалением, эндотелий активирован с результирующим увеличением адгезии рецепторов выражения 8 и снижается способность ингибировать гемостаз. 9 Активация каскада систем в крови в свою очередь усиливает тромбогенности эндотелия приводит к дальнейшему тромбоз и лейкоцитов вербовки. 10 Для лучшего понимания этого деликатных взаимодействия между эндотелиальных клеток и цельной крови, у нас есть разработаны роман в методе экстракорпорального где культивированные эндотелиальные клетки в контакт с цельной крови. Насколько нам известно, наши установки является первым, чтобы показать эндотелиальные клетки инкубировали с целой человеческой крови с отсутствием или очень мало антикоагулянта для более длительных периодов времени. нт &quot;&gt; Чувствительность этой системы включен по открытой системы венепункции в сочетании с защитным слоем иммобилизованного гепарина на всех поверхностях, расположенных в контакте с кровью. Использование открытой системы закупок в течение крови уменьшает активацию каскадных систем во венепункции в то время позволяя использовать само-определяется количеством антикоагулянта. Коммерчески доступные эвакуированные пробирки крови, однако, может быть использован в зависимости от предполагаемого конечного точек исследования. Конечная концентрация антикоагулянта добавлен к наиболее коммерчески доступных замкнутой системе труб может ингибировать чувствительны , а в противном случае трудно изучить, взаимодействие в установке. 6 защитную поверхность гепарина дополнительно устраняет активацию крови через поверхностный контакт любыми другими, чем эндотелиальных клеток поверхностей. 5 Действительно, инкубации цельной крови с добавлением небольшого количества нефракционированного гепарина в Камера без защиты CHS привело к образованию сгустка. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; пузырь воздуха внутри камеры обеспечивает смешивание крови во время инкубации с эндотелиальными клетками. Для того чтобы оценить влияние размера пузырьков воздуха, мы использовали два разных объемов крови. В этой модели, мы измерили аналогичные уровни ТАТ, независимо от размера воздушного пузыря в камерах инкубированными с ЭКПВЧ. ТАТ был, однако, увеличивается с меньшим размером пузырьков воздуха в полностью CHS лечить камеры. Это, в соответствии с ранее описанными эндотелиальных клеток свойствами 11, указывает, регулирующий воздействие на повышенной активации свертывания, представленной на эндотелиальных клетках, что отсутствует в инертной CHS камере. Пузырь воздуха в системе создает поток при вращении камеры. Размер пузырьков будет влиять на силы внутри этой вращающейся системе. Это показано с помощью наших результатов на фиг.2d были меньше пузырь создает более высокие значения, представляющие ТАТ уменьшенную силу по IE крови, движение кровиВнутри камеры ниже, и, таким образом, активацию каскада системы происходит в большей степени. Следует отметить, что в этой системе мы создаем вращающийся поток, который будет отличаться в скорости по камере с высокой скоростью вдоль стен и самый низкий в центре. Это, очевидно, не является оптимальным среда с учета потоков и напряжения сдвига для эндотелиальных клеток, но все же у нас есть система получения устойчивых и воспроизводимых результатов. Более оптимальные условия включают ламинарный поток циркулирующего в отсутствие турбулентности. Это, однако, не представляется возможным в модели, представленной здесь, и, насколько нам известно, такие системы не доступна на сегодняшний день. Хотя существует несколько микрофлюидальные системы доступны коммерчески, которые не можно комбинировать с цельной крови без каких-либо или низких уровней антикоагулянта добавлен к этому система не обеспечит правильную чувствительную оценку взаимодействий между всеми компонентами, присутствующими в крови и эндотелиальных клеток, Кроме того, было увеличение в 2 раза в наборе клеток крови в сторону ФНО активирована HUVEC в комбинации с удвоенной формирования ТАТ независимо от объема крови. Это подтверждает стабильность модельной системе, а также показывает возможность использовать активированный эндотелий в сочетании с цельной крови. Будущие на, камера эндотелиальных клеток крови может быть использован для изучения набора клеток крови в сторону активированных эндотелиальных клеток с помощью различных маркеров на клетках, выраженных в различных условиях и этапах активации. Кроме того, модель может быть использована в сочетании с фармакологическими агентами, чтобы оценить воздействие на воспалительные состояния. Таким образом, мы показываем большую пользу объединения камерный модель человеческой кровью и сосудистых клеток, чтобы создать полную человека в системе экстракорпорального выполнять соответствующие исследования сосудистых заболеваний.

Методы анализа крови-сосудистой взаимодействия в сердечно-сосудистых заболеваний обычно включают научно-исследовательские эксперименты на животных. Результаты, созданные в экспериментальных моделях на животных исследования могут, однако, практически не имеют последствий для заболевания человека. 1,2 Таким образом, существует потребность в хорошим и надежным в пробирке моделей для исследования клеточных взаимодействий между отсеке крови и сосудистых эндотелиальных клеток в человек-как. Поэтому мы создали клетки камерный модель эндотелия в крови. Это основано на ранее описанной модели, используемой для исследования взаимодействия между биоматериалов и цельной крови человека. 3 В отличие от других установок в пробирке, где, как правило, ограниченное количество очищенных компонентов, то есть, тромбоциты, лейкоциты или эндотелиальные клетки доступны, присутствует модель включает все компонентов, присутствующих в кровеносный сосуд. Настройка эндотелиальной крови сELL камера модель предназначена для использования других свеженарисованного крови человека с небольшим или без добавления антикоагулянта. Кровь хранится в течение более длительных периодов времени приобретают так называемые очаги хранения, где разбивка эритроцитов могут помешать деликатных взаимодействия между кровью и эндотелиальных клеток. 4 Чтобы избежать образование тромбов во время обработки цельной крови экс естественных требует либо высокие дозы антикоагулянта или, что все материалы в контакте с кровью должны быть не активирующий. Как не-активирующие поверхности редки в лабораторных условиях, в качестве альтернативы материалы могут быть снабжены защитным слоем иммобилизованного гепарина. Защитный слой иммобилизованного гепарина (далее именуемые как гепарин Corline поверхности (CHS)), которые могут быть применены к большинству материалов создания поверхности контакта, где кровь может происходить, не вызывая активацию каскада свертывания. 5 Таким образом, путем предоставления камер с CHS, эндотелия крови сеLL камера модель позволяет использовать очень низких концентрациях антикоагулянта в крови. Как избежать добавление высоких концентраций антикоагулянта в камере модели эндотелиальной крови делает возможным изучать чувствительные взаимодействия внутри кровеносного сосуда, что в противном случае может быть замаскирован. 6 Клетка камера модель эндотелия крови состоит из двух палат, образованных путем присоединения пластиковые цилиндры (высота: 8 мм; радиус: 9 мм) до пластиковой микроскопа. Края, стоящие вверх на цилиндрах оснащены пазами, которые оснащены резиновыми уплотнительными кольцами, используемых для герметизации камер против культивирования клеток горкой. Камеры лишь частично заполнены кровью, как воздух остается в камере удерживает кровь в движение, когда камеры впоследствии поворачивается в вертикальное положение (рис 1). Для того чтобы оценить функциональность модели, были проведены эксперименты с либо полностью CHS покрытиемкамерные или пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC). Две отдельные объемы крови анализировали и образование тромбина антитромбин (ТАТ) комплексов (непрямого маркера коагуляции) было измерено с твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Мы тогда оценивали влияние объемов крови и фактора некроза опухоли (ФНО) стимулировали эндотелиальные клетки на вербовке лейкоцитов анализом изображений. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Рисунок 1. Установка в ячейки камеры модели эндотелия в крови. (А) Вид сверху схематическое изображение камеры крови, достигнутый в ПММА. (B) Первичные эндотелиальные клетки человека культивируют на слайдах камеры 1-а. Свежий цельной крови человека добавляется в двух камерах на предметное стекло микроскопа. Камеры и все материалы, используемые для обработки крови, рассматриваются с защитным HS покрытия. После удаления стены сеLL культура слайд, клетки помещают перед кровь и система зажимается на замке. (С) эндотелиальных клеток крови камеры затем инкубируют при вращении в 37 ° С. После этого реакции в отсеке крови могут быть проанализированы с помощью ELISA и эндотелиальные клетки могут быть проанализированы с помощью микроскопии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

Большинство из известных болезней, которые сопровождаются расстройствами сердечно-сосудистой системы. Исследования в сложности взаимодействующих путей, активированных в течение сердечно-сосудистых патологий, однако, ограничен из-за отсутствия надежных и физиологически соответствующих методов. Для моделирования патологических событий сосудистых мы разработали анализ в пробирке для изучения взаимодействия эндотелия и цельной крови. Анализ состоит из первичных человеческих эндотелиальных клеток, которые размещены в контакте с цельной крови человека. Способ использует встроенную кровь без каких-либо очень мало или антикоагулянтом, что позволяет изучение тонких взаимодействий между молекулярных и клеточных компонентов, присутствующих в кровеносном сосуде. Мы исследовали функциональные возможности анализа путем сравнения активации свертывания по различных объемов крови инкубировали с или без пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC). В то время как больший объем крови способствовалиувеличение в образовании тромбина антитромбин (ТАТ) комплексы, наличие HUVEC привело к снижению активации свертывания. Кроме того, мы применили анализ изображения прикрепления лейкоцитов к HUVEC, стимулированных фактора некроза опухоли (ФНО) и обнаружили присутствие CD16 + клеток, что значительно выше, на ФНО стимулированных клеток по сравнению с стимулированных клеток после контакта с кровью. В заключение, анализ может быть применен для изучения сосудистых патологий, где взаимодействие между эндотелием и отсек крови возмущенные.

Необходимость ЦОН покрытия Для того чтобы измерить реакции в цельной крови, специфичные для тех, вызванное эндотелиальных клеток, все материалы, используемые для эндотелиальных клеток крови камере должен быть снабжен покрытием, CHS перед использованием. 2А (слева) показывает без покрытия камеру после 30 минут контакт крови с четко видимой сгустка настоящее. Лечение в камеру с CHS (рис 2А, справа), с другой стороны защищает кровь от неконтролируемого активации, гарантируя, что результаты обусловлены эндотелиальных взаимодействий клеток крови. Влияние объема крови в палате Активация коагуляции, скорее всего, в застойной крови, как вероятность взаимодействия активированных факторов свертывания увеличивается. В ячейки камеры модели эндотелия в крови, в крови поддерживается в движении из-за циркуляции воздушного пузыря внутри камеры. В Order чтобы определить влияние изменения объема крови, а следовательно, и размер пузырьков воздуха, камера CHS покрытием был подключен к ЦОН покрытием стекло, что был испытан с 1,5 мл или 1,75 мл цельной крови в течение 30 мин. Объем крови без какого-либо движения по пузырька воздуха в 2,5 раза больше, когда 1,75 мл крови добавляют в камере по сравнению с тем, когда 1,5 мл крови используется (Фигура 2В). Измеренные TAT-значения предложил увеличилось ТАТ-образование с увеличением объема крови (рис 2D). Когда HUVEC (фиг.2С) инкубировали с 1,5 или 1,75, или мл цельной крови, никаких различий не было отмечено между двумя группами, предполагая, что эндотелиальные клетки могут модулировать активацию коагуляции (рис 2D). Влияние ФНО на крови Cell вербовкой и Активация коагуляции Для того, чтобы изучить влияние ФНО по вербовке лейкоцитов, ЭКПВЧ были удовольствиемред с 20 нг / мл TNF-alpha 4 ч до контакта с кровью. Кровь контакт - либо с 1,5 мл или 1,75 мл крови - продолжали в течение 30 мин, после чего культуры препараты окрашивали для CD16 (рис 2F), отображаемого а количество CD16 + клеток количественно. Вербовка CD16 + клеток значительно увеличивается при лечении ФНО (рис 2Е) от 100 до 256 CD16 + клеток / мм 2 (р &lt;0,0001) с 1,5 мл крови и от 172 до 378 (P &lt;0,0001) с 1,75 мл крови. Образование комплексов TAT была измерена в соответствующих образцах плазмы крови инкубируют с ФНО либо обработанных или необработанных клеток (рис 2G). TNF-alpha стимулированных клеток индуцируется приблизительное удвоение TAT комплексов, по сравнению с необработанными клетками. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> ФигаЮр 2: Функциональные возможности клеток камерной модели эндотелия в крови. (A) Камеры с или без CHS инкубировали с цельной крови. Без CHS, сгусток образовался после 30 мин. Измерение тромбин-антитромбин (ТАТ) комплексов, непрямого маркера коагуляции крови, в инкубируемых без CHS было&gt; 6000 мкг / мл. (Б) объем крови, не двигалась вращающимся воздушным пузырем будет меняться в зависимости от различных объемов крови. С добавлением 1,5 мл крови, этот объем будет 0,3 мл, в то время как она вырастет до 0,74 мл с добавлением 1,75 мл. (С), полученную с использованием HUVEC фазово-контрастной микроскопии показывают типичные эндотелиальных клеток морфологии сливной монослоя до контакт с кровью. (D) значения TAT для камер полностью CHS покрытием показать небольшую разницу, когда различные объемы крови добавляются. Добавление 1,5 мл крови в результате 35 ± 11 мкг / мл (п = 7) по сравнению с 1,75 мл, в результате чего 8577; 70 мкг / мл ТАТ (N = 8). Это различие не больше не присутствует, когда HUVEC инкубировали с одних и тех же объемов крови; 66 ± 55 мкг / мл в течение 1,5 мл (N = 5) и 66 ± 29 мкг / мл в течение 1,75 мл (N = 7). (Е) Количественное определение количества CD16 + клеток присутствуют на или без стимуляции или TNF, стимулировали HUVECs после контакт с кровью. Количество CD16 + клеток значительно возрастает с ФНО стимулировали клетки инкубировали либо с 1,5 мл (базальных: 100 ± 40 клеток / мм; ФНО: 256 ± 121 клеток / мм) или 1,75 мл (базальных: 172 ± 67 клеток / мм; ФНО: 378 ± 185 клеток / мм) из цельной крови (F) Типичные изображения без стимуляции и ФНО стимулировало ЭКПВЧ окрашенные для фаллоидином (красный), CD16 (зеленый) и DAPI (синий).. Шкала бар = 250 мкм (G) Образование TAT комплексов примерно в два раза путем ФНО стимулированных клеток по сравнению с необработанными клетками, инкубированных с крови (1,5 мл:. 2.1 ± 0,1 раза больше, ТАТ, п = 3; 1,75 мл: 1,7 ± 1,0 раза больше, ТАТ, N = 4). Все значения представлены как среднее ± стандартное отклонение; р значения были рассчитаны по непарных т тестов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium at JoVE.com

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Роман<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K Views.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Video: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Рецидивирующей герпетической Стромальные Кератит у мышей, модель для изучения человека HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Изучение микробных сообществ<em&gt; В Vivo</em&gt;: Модель узла опосредованного взаимодействия между<em&gt; Candida Albicans</em&gt; И<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Разработка и идентификация романа субпопуляции человеческого нейтрофилами производного Giant фагоцитов<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человеческие клетки первичной

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Роман фидер бесплатная система для массового производства мышиных естественных клеток-киллеров в пробирке

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Характеристика человека Моноцит подмножеств по цельной крови Cytometry анализ потока

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...