الكتاب يعترف كثيرا بيير Bourdoncle، توماس غيلبير ولويز Rimbault مرفق كوشين التصوير. وأيد هذا العمل من قبل INSERM، CNRS والدوري الفرنسي الوطني مناهضة جنيه السرطان (إيكيب labellisée).

1. إعداد الخلايا اللمفاوية T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الماوس الأساسي أو خلايا T الإنسان كما هو موضح 10،11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا T الإنسان في كامل المتوسطة RPMI مع المصل البشري 10٪ AB في مناطق ذات كثافة من 2-3 × 10 6 خلية / مل. ملاحظة: استخدام مصل الجنين العجل (FCS) بدلا من المصل البشري يمكن أن تثير الاستقطاب عفوية لجزء كبير من الخلايا T الإنسان في الثقافة. تبقى هذه الخلايا في الثقافة لمدة 4 - 5 ايام وعملية أخرى لهم في أي وقت خلال هذه الفترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا فأر T في كامل المتوسطة RPMI تستكمل مع 10٪ FCS في مناطق ذات كثافة خلية مماثلة. استخدام على الفور أو في اليوم التالي، وبعد O / N الثقافة عند 37 درجة مئوية في ظل وجود 10 نانوغرام / مل IL7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة T خط الخلية CEM الإنسان في استكمال كامل RPMI مع 10٪ FCS. </li></ol> 2. تحفيز Chemokine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 5 × 10 5 خلايا لكل حالة تجريبية في المتوسط ​​الدافئة HBSS تستكمل مع 10 ملي Hepeالصورة. وبالنسبة لبعض التجارب، وشارك في بالنقل خلايا T الإنسان الأساسي في اليوم السابق مع 2 ميكروغرام pmaxGFP و 8 ميكروغرام pcDNA3.1 + (ناقلات الفارغة، والسيطرة)، PKCζ كيناز الميتة، أو البلازميدات Par6 N-الطرفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في المتوسط ​​الدافئة HBSS-HEPES (استخدام 0.3 مل × عدد الظروف التجريبية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع الخلايا في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. ملاحظة: ولذلك، فإن أنبوب واحد المقابلة لحالة تجريبية واحدة تحتوي على 5 × 10 5 الخلايا في 0.3 مل HBSS-HEPES المتوسطة. وبالنسبة لبعض التجارب، وإضافة 500 نانومتر Latrunculin A أو السيارة (DMSO)، واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة قبل التحفيز chemokine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10-500 نانوغرام / مل CCL19 أو CXCL12 chemokine في كل أنبوب. ملاحظة: نحن عادة استخدام 10-200 نانوغرام chemokine مل / للخلايا T الإنسان. خلايا CEM لا تعبر عن مستقبلات CCR7 التي تربط CCL19. ولذلك، فإن خلايا CEM تكون قادرة على الاستجابة لتحفيز CXCL12 فقط. وعلاوة على ذلك، استخدام تركيزات أعلى chemokine (300-500 نز / مل) إلى استقطاب خلايا فأر T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه الأنابيب عدة مرات، واحتضان لهم في 37 ° C حمام الماء لمدة 8 أو 10 دقيقة للخلايا T الابتدائية أو CEM، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف عملية الاستقطاب عن طريق إضافة إلى كل أنبوب 0.3 مل من محلول دافئ يحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) و10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. الوجه الأنابيب واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li></ol> 3. Stainings <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا من أنابيب microcentrifuge في التدفق الخلوي الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أنابيب تماما مع حل RT تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 460 x ج لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من حل RT تحتوي على 5٪ FCS في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من FITC المضادة للHLA-ABC في كل أنبوب، دوامة لهم، واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT، بعيدا عن الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ FCS، وهوND مرة واحدة مع PBS فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في RT: إضافة 500 ميكرولتر 1٪ PFA، واحتضان لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل الخلايا مع محلول يحتوي على 1٪ BSA، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف، وملء أنابيب تماما بمحلول PBS تحتوي على 0.2٪ BSA، 0.1٪ سابونين، 0.5 ملي EDTA و 10 ملي HEPES (العازلة permeabilization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين في هذه الوسيلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه الأنابيب لإزالة المتوسطة ودوامة لهم لفصل بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.25 ميكروغرام / مل TRITC-Phalloidin و / أو 1: 100 التخفيف من مكافحة P-ERM الأجسام المضادة لكل أنبوب، دوامة لهم واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع المخزن المؤقت permeabilization. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر PBS ونقلها إلى أنابيب microcentrifuge. ملاحظة: خلايا جاهزة للشراء. بدلا من ذلك، مع الحفاظ على حجم الحد الأقصى لمجموع 200 ميكرولتر في الأنبوب، إضافة المركزة PFA إلى النهائي 1٪تركيز من أجل الحفاظ على stainings إذا لم يتم استخدام خلايا في نفس اليوم لمزيد من المعالجة. </li></ol> 4. الصور اقتناء وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على جهاز (انظر الجدول من الكواشف محددة / المعدات) والسماح لها معايرة نفسه وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: تم استخدام البرنامج INSPIRE مع الهدف 40X (0.75 NA). تم استخدام IDEAS 3.0 برامج لجميع quantifications المبلغ عنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة من النوافذ الاستحواذ والتي يمكن حفظها في قالب للتجارب المستقبلية. رسم رسوم بيانية أن تحديد القيم التدرج RMS. من &quot;تحت المجهر&quot; السكان، واختيارهم على الرسم البياني RMS التدرج، delimitate &quot;خلية واحدة&quot; السكان على الرسم البياني للمنطقة. مرة واحدة وقد تم إدخال أنبوب microcentrifuge في الجهاز، وضبط قوة الليزر، بوابة على الخلايا الفردية واكتساب 5،000 اللمفاويات التائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الأفكار الناعمةوير، فتح ملف اقتناء وإنشاء الرسم البياني التي سوف تظهر قيمة قيمة RMS التدرج للصور المجال مشرق (القناة 1) التي تم الحصول عليها لكل خلية على حدة. رسم بوابة على الرسم البياني التدرج RMS التي تعتبر الخلايا العارضة RMS قيمة التدرج فوق 57. ملاحظة: التدرج RMS يسمح مع الأخذ بعين الاعتبار في التحليل فقط الخلايا الليمفاوية T التي هي في المستوى البؤري. لقد تحدد تجريبيا أن الخلايا الفردية واظهار قيمة التدرج RMS متفوقة على 57 هي في المستوى البؤري، ويمكن اعتبارها بشكل دقيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في / القائمة أقنعة تحليل، وخلق قناع جديد، ودعا تآكل (M01،2) من قناع التشكل على الصور brightfield M01، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة للمنطقة، وتحسب على تآكل (M01،2) قناع. من الخلايا المحددة في البوابة السابقة، فتح الرسم البياني يبين مجال الخلايا باستخدام هذا القناع تم إنشاؤه حديثا. أقنعة والتشكل التي تتوفر حسب: ملاحظةالافتراضية هي أكبر بكثير من الحجم الفعلي للخلية. وبالتالي، فمن أكثر دقة لتآكل ليصل إلى 2 بكسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم بوابة على خلايا T الفردية، باستثناء الخرز المعايرة والحطام (المنطقة الصغيرة) والحلل (المنطقة الكبيرة). ضبط هذه البوابة في كل الاستحواذ. ملاحظة: سوف الاختلافات في حجم الخلية يؤثر على موقف البوابة. كما خلايا فأر T هي أصغر من خلايا T الإنسان التي هي نفسها أصغر من خلايا CEM، فإن مساحة كل نوع من الخلايا تكون متناسبة مع حجمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النظر في واحدة، في تركيز الخلايا التي تم بوابات في الخطوات السابقة، فتح مؤامرة نقطة تتكون من الخام ماكس بكسل على تلطيخ HLA-ABC (القناة 2، محور س) بوصفها وظيفة من الخام ماكس بكسل على phalloidin تلطيخ (قناة 4، محور Y). إنشاء بوابة لاستبعاد الأحداث فلوري غير ملوثين أو المشبعة. فتح اثنين من رسوم بيانية تبين الخام ماكس بكسل لHLA-ABC (قناة 2) وphalloidin (قناة 4) stainings. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تحليل / القائمة أقنعة، يخلقعصام قناع جديد، ودعا تآكل (M02،2) من قناع مورفولوجيا الخلايا HLA-ABC الملون (قناة 2)، تآكلت من 2 بكسل. ثم، في تحليل / ملامح القائمة، وخلق ميزة جديدة تتألف من المعلمة الاستدارة، وتحسب على تآكل (M02،2). ملاحظة: يقيس هذا المعامل انحراف شكل خلية من دائرة. ولذلك، فإن خلية T مستديرة تماما يكون لها قيمة عالية دائرية في حين أن الخلايا الاستقطاب ممدود سوف يحمل الرقم القياسي دائرية منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي وقت لاحق، وخلق الرسم البياني آخر من شأنه أن يقدم تقريرا قيم ميزة الاستدارة من الخلايا المغلقة سابقا. استخدام هذا الرسم البياني لرسم مباشرة توزيع الفرد والسكان خلية في التركيز وفقا لقيمة الاستدارة لكل خلية على حدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعند النظر إلى شكل الرسم البياني للخلايا غير حفز، رسم بوابة للخلايا الاستقطاب، ابتداء من الساعة قيمة أدنى دائرية يصل إلى قيمة الحد دائرية، حيث ان معظم الخلايا غير حفزيتم رسم. نظرة على عرض إحصاءات عن النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب بين السكان بوابات (٪ بوابات). ملاحظة: لقد حددت هذه البوابة للقيم مؤشر الاستدارة أقل من 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل أن ننظر إلى الاستقطاب من تلطيخ الأكتين في الخلايا، رسم بياني لتفاصيل مشرق قيمة التشابه R3، مقارنة تلطيخ HLA-ABC (قناة 2) وتلطيخ phalloidin (قناة 4). ملاحظة: أكبر قيمة من هذه الميزة، وأكثر فرضه stainings هما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام استراتيجية النابضة نفسها كما كان من قبل، رسم بوابة على الخلايا غير حفز لتلطيخ فصل يبين النسبة المئوية للخلايا مع المستقطب الأكتين تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء، وتظهر النسبة المئوية للخلايا واظهار الفصل في توزيع الدرجة الأولى MHC وstainings phalloidin، النسبة المئوية للخلايا الاستقطاب جنبا إلى جنب مع القيم المتوسطة من الاستدارة والتشابه مؤشرات جميع خلايا ± SD في الموافقوحات إحصاءات onding. </li></ol>

<ol>
	<li>Rossi, D., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+chemokines+and+their+receptors.">The biology of chemokines and their receptors.</a> Annu Rev Immunol. 18, 217-242 (2000).</li><li>Thelen, M., Stein, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+chemokines+invite+leukocytes+to+dance.">How chemokines invite leukocytes to dance.</a> Nat Immunol. 9 (9), 953-959 (2008).</li><li>Rougerie, P., Rho Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+masters+of+T+lymphocyte+migration+and+activation.">GTPases: masters of T lymphocyte migration and activation.</a> Immunol Lett. 142 (1-2), 1-13 (2012).</li><li>Sanchez-Madrid, F., del Pozo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+polarization+in+cell+migration+and+immune+interactions.">Leukocyte polarization in cell migration and immune interactions.</a> Embo J. 18 (3), 501-511 (1999).</li><li>Adams, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor+and+macrophage+inflammatory+protein+1+beta:+structurally+distinct+cytokines+that+induce+rapid+cytoskeletal+changes+and+subset-preferential+migration+in+T+cells.">Hepatocyte growth factor and macrophage inflammatory protein 1 beta: structurally distinct cytokines that induce rapid cytoskeletal changes and subset-preferential migration in T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (15), 7144-7148 (1994).</li><li>Rougerie, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fam65b+is+a+new+transcriptional+target+of+FOXO1+that+regulates+RhoA+signaling+for+T+lymphocyte+migration.">Fam65b is a new transcriptional target of FOXO1 that regulates RhoA signaling for T lymphocyte migration.</a> J Immunol. 190 (2), 748-7455 (2013).</li><li>Real, E., Faure, S., Donnadieu, E., Delon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+Atypical+PKCs+regulate+T+lymphocyte+polarity+and+scanning+behavior.">Cutting edge: Atypical PKCs regulate T lymphocyte polarity and scanning behavior.</a> J Immunol. 179 (9), 5649-5652 (2007).</li><li>Negulescu, P. A., Krasieva, T. B., Khan, A., Kerschbaum, H. H., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+T+cell+shape,+motility,+and+sensitivity+to+antigen.">Polarity of T cell shape, motility, and sensitivity to antigen.</a> Immunity. 4 (5), 421-430 (1996).</li><li>Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageStream+System:+a+key+step+to+a+new+era+in+imaging.">The ImageStream System: a key step to a new era in imaging.</a> Folia Histochem Cytobiol. 45 (4), 279-290 (2007).</li><li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification.">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), 409 (2007).</li><li>James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen+specific+CD4++T+cells+using+MHC+class+II+tetramers.">Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Wabnitz, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+phosphorylation:+a+novel+target+for+the+immunosuppressive+drug+dexamethasone+in+primary+human+T+cells.">L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells.</a> Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).</li><li>Freeley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-plastin+regulates+polarization+and+migration+in+chemokine-stimulated+human+T+lymphocytes.">L-plastin regulates polarization and migration in chemokine-stimulated human T lymphocytes.</a> J Immunol. 188 (12), 6357-6370 (2012).</li></ol>

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

باستخدام تقنية حديثة من تدفق التصوير الخلوي، ووضع استراتيجية النابضة سريعة ومفيدة لتحليل الأحداث الخلوية والجزيئية الناجم عن التحفيز chemokine يرد. من تجربة واحدة، يمكن للمرء الحصول على نوعين رئيسيين من المعلومات: التغييرات في مورفولوجية الخلايا الناجم عن التحفيز chemoki...

كيموكينات هي بروتينات قابلة للذوبان الصغيرة التي تجذب الخلايا لمواقع متخصصة 1. ولذلك، فإنها تشارك في الموضع الصحيح من الخلايا في الأنسجة، وهي وظيفة حاسمة في التنمية وعلم وظائف الأعضاء. الجهاز المناعي ليست استثناء لهذه القاعدة لأنها تعتمد على عمل العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تعمل في تناسق لجبل استجابة مناعية فعالة. من خلال التحكم في موقع معين من نوع واحد الخلايا المناعية في حالة معينة، كيموكينات هي المطلوبة مسبقا قبل أن يتم الكشف عن المستضدات الأجنبية وتحييدها. في الخلايا الليمفاوية T على وجه الخصوص، كيموكينات تربط لمستقبلات محددة السطح والتي، على المشاركة، وانتزاع العديد من الإشارات بين الخلايا (ارتفاع الكالسيوم، ERK الفسفرة، وتفعيل رو GTPases، وزيادة في integrins تقارب وهيكل الخلية التعديلات) التي تفضل T خلية حركية 2،3. على المستوى الخلوي، ويمكن للمرء أن يلاحظ التغيرات المورفولوجية أثار chemokine على التحفيز.هذه التغيرات في الأشكال خلية مثيرة خصوصا في خلايا T: يستريح خلايا T لها مورفولوجيا مستديرة تشبه حبة عند السفر في مجرى الدم. ومع ذلك، فإن الاستشعار عن وجود كيموكينات في مواقع التهابات أو على القرب من الأجهزة اللمفاوية هو الذهاب الى تغيير شكل خلايا T التي تعتمد الآن على &quot;اليد مرآة&quot; مورفولوجيا نموذجية تتكون من شكل ثنائي القطب: حافة الرائدة في الجبهة وميزة زائدة، أو قدم ذنبية، في الجزء الخلفي 4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمكونات داخل الخلايا تفصل في هذه المناطق المعاكس اثنين من خلية T المستقطبة للحفاظ على الهجرة. على سبيل المثال، ويزيد من خيوط الأكتين البلمرة على chemokine التحفيز 5 و الأكتين بلمرة تتراكم في الجزء الأمامي من T خلية الاستقطاب 2. من ناحية أخرى، والعديد من البروتينات، مثل البروتينات فسفرته من Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) الأسرة التي تربط بين غشاء البلازما إلى القشرية الهيكل الخلوي F-الأكتين، وإعادة توطين في قدم ذنبية من الاستقطابخلايا T 6. ومن المثير للاهتمام، نحن وغيرنا قد أظهرت أن هناك حاجة لهذه العملية الاستقطاب T الهجرة الخلية. والواقع أن أي علاج الذي يتداخل مع الاستقطاب تمنع الحركة الخلوية. على سبيل المثال، وتثبيط لنشاط أعضاء من البروتين غير نمطية تحركات C (PKC) أسرة، وكتل PKCζ وPKCι T الاستقطاب الخلية ولها عملية المسح المهاجرة من الخلايا الجذعية 7. وينظم T خلية الاستقطاب أيضا رو GTPases. لقد أظهرنا أن تعديل النشاط RhoA من البروتين Fam65b وصف مؤخرا يتداخل مع التغيرات الخلايا التائية في التشكل وقدرتها على الهجرة في مقايسة Transwell 6. كما الاستقطاب هو خطوة شرط أساسي لحركية الخلوية، وبالتالي فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على تحديد بأنها قراءات الرئيسية من الردود chemokine. تم إجراء تعديلات شكل خلية قياس سابقا يدويا 8. ومع ذلك، هذا النوع من القياس الكمي هو جدا تستغرق وقتا طويلا، بحيث عادة سوى عدد قليلتؤخذ عشرات الخلايا في الاعتبار. هنا، يتم تقديم طريقة جديدة لقياس بسرعة درجة التعديلات شكل من الخلايا الليمفاوية T تتعرض لchemokine التحفيز. تدفق التصوير الخلوي التكنولوجيا (انظر الجدول من الكواشف محددة / معدات) يستخدم، والذي يجمع بين مزايا تدفق عداد الكريات والمجهر 9 لقياس كفاءة كمية من الخلايا الاستقطاب في ظروف مختلفة من التحفيز chemokine. بالإضافة إلى تقدير حجم التعديلات الشكلية التي يمكن للمرء أن قياس بقوة مع هذه التكنولوجيا، فمن الممكن أيضا لتقييم التغيرات في توطين التحت خلوية من بعض البروتينات على chemokine الإشارات.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Human serum AB</td><td>PAA</td><td>C11-021</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3300</td><td>Pre-heat to inactivate the complement.</td></tr><tr><td>Human T cell nucleofactor kit</td><td>Lonza</td><td>VCA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Murine CCL19</td><td>Peprotech</td><td>250-27B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CCL19</td><td>Peprotech</td><td>300-29B</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells.</td></tr><tr><td>Human CXCL12</td><td>Peprotech</td><td>300-28A</td><td>Aliquots are thawed on ice before adding the chemokine to the cells. This chemokine can also be used on mouse T cells.</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>157-8-100</td><td>This is a 8% PFA solution in water. Mix volume to volume with 2x PBS to obtain a 4% PFA solution in PBS.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Fluka</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>FITC-anti-HLA-ABC antibody</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1838</td><td>clone B9.12.1</td></tr><tr><td>Anti-P-ERM antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3149P</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream&lt;sup&gt;x&lt;/sup&gt; Mark II</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid and robust analysis of cellular and molecular polarization induced by chemokine signaling

خلايا تستجيب لchemokine التحفيز عن طريق فقدان شكلها جولة في عملية تسمى الاستقطاب، وعن طريق تغيير توطين التحت خلوية من العديد من البروتينات. وقد استخدمت تقنيات التصوير الكلاسيكية لدراسة هذه الظواهر. ومع ذلك، أنها تتطلب اكتساب اليدوي من العديد من الخلايا تليها تستغرق وقتا طويلا الكمي من التشكل وشارك في توطين تلطيخ عشرات الخلايا. هنا، يتم وصف طريقة سريعة وقوية لدراسة هذه الظواهر على عينات تتكون من عدة آلاف من الخلايا باستخدام التدفق الخلوي التصوير التكنولوجيا التي تجمع بين مزايا المجهر مع تلك من عداد الكريات. استخدام الخلايا الليمفاوية T حفز مع CCL19 وتلطيخ لجزيئات MHC من الدرجة الأولى والأكتين الخيطية، وتقدم استراتيجية النابضة لقياس في وقت واحد درجة التعديلات شكل ومدى التعاون توطين علامات التي تتأثر CCL19 الإشارات. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الاستراتيجية النابضة سمحت لنا observه الفصل بين الأكتين الخيطية (في الجبهة) وفسفرته Ezrin-Radixin-Moesin (الفوسفات-ERM) البروتينات (في العمق) في خلايا T الاستقطاب بعد التحفيز CXCL12. وكانت هذه التقنية مفيدة لمراقبة تأثير حظر على الاستقطاب من عنصرين مختلفين أيضا: تثبيط الأكتين البلمرة التي كتبها مثبط الدوائية والتعبير عن المسوخ من Par6 / شاذة PKC يشير المسار. وهكذا، يظهر دليل على أن هذه التقنية مفيدة لتحليل كل التعديلات الشكلية وإعادة التوزيع البروتين.

المثال الأول المختار هنا يتعلق باستخدام الخلايا الليمفاوية T الأساسي الإنسان حفز مع CCL19. ومع ذلك، فإن الاستراتيجية ذاتها يمكن استخدامها مع خلايا T الماوس الابتدائي، خطوط الخلايا T أو أي نوع من الخلايا الأخرى استجابة لتحفيز chemokine. استراتيجية النابضة المعروضة هنا تشمل ?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling at JoVE.com

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

تحليل سريع وقوي من الخلوية والجزيئية الاستقطاب المستحث بواسطة Chemokine اشارة

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

rapid-robust-analysis-cellular-molecular-polarization-induced

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

8.1K Views.  Institut Cochin. Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Video: Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

تحليل البروتين الاستقطاب بلعم البشرية تحت بيئة منخفضة الأكسجين

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Biochemistry

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Neuroscience

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

نموذج تعبير كيميائي خارج الرحم لاختبار توظيف الضامة في فيفو

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Developmental Biology

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

فيروسات تنبيغ من الخلايا التائية المساعدة كنهج الوراثي لدراسة آليات السيطرة على التمايز وظيفة

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

طريقة الكل على رقاقة للتحليل الكيميائي العدلات السريعة مباشرة من قطرة الدم

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Bioengineering

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

التصوير G - مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) بوساطة الأحداث يشير إلى أن التحكم في الانجذاب الكيميائي Dictyostelium Discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Biology

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

التصوير إعادة التنظيم المكاني لMAPK اشارة المسار باستخدام نظام التعبير عابر التبغ

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...