We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.

1. البلازميد البناء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد بنيات بواسطة تكنولوجيا الاستنساخ كما هو موضح سابقا 1،6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أول استخدام البلمرة DNA عالية الدقة مع الاشعال المناسبة لتضخيم متواليات ترميز بعسل، جمعية تنمية الشباب وMPK6 ودون استنساخ لهم في ناقلات دخول. العثور على بروتوكول مفصلة في 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد إصدارات السلبية السائدة في MPK6 وجمعية تنمية الشباب (DNmpk6 8 و DNyda 4 على التوالي)، استخدام البلازميدات دخول MPK6 وYDA كقالب وإدخال الطفرات نقطة بطريقة الطفرات موقع الموجه 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبناء بنيات لفحوصات عابرة التبغ، وإجراء LR القياسية (attL س ATTR إعادة التركيب) ردود الفعل (إجراءات مفصلة في 7) لدمج بعسل إلى pH35CG 10، DNyda وDNmpk6 إلى pXNGW وpXCGW ناقلات 11، على التوالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد البلازميدات الناتجة بواسطة انزيم الهضم والتسلسل. مرة واحدة قuccessful، تحويل بنيات الثنائية في الأجرعية المورمة سلالة GV3101 12 وتنمو لهم على لوحات مختارة عند 28 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. </li></ol></li></ol> 2. إعداد الحل الأجرعية تسلل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم عدد قليل من المستعمرات الأجرعية تحولت حديثا إلى 10 مل من المتوسط ​​مع المضادات الحيوية المناسبة لوريا، Bertani (LB) (جنتاميسين 25 ميكروغرام / مل، ريفاميسن 25 ميكروغرام / مل، سبيكتينومايسين 100 ميكروغرام / مل لpH35CG، pXNGW وpXCGW يبني، ونفس تركيزات من الجنتاميسين وريفاميسن مع كانامايسين 50 ميكروغرام / مل لP19 (التعبير عن البروتينات ضد إسكات المعدلة وراثيا) 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الثقافات الأجرعية في 28 درجة مئوية شاكر بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة ومن ثم قياس OD 600 (يتوقع أن يصل إلى 1،5-1،8) (الشكل 2A-B). تدور باستمرار الثقافات في 2500 x ج لمدة 10 دقيقة. اعادة تعليق وواSH الكريات الخلايا مع 10 ملم من MgCl 2 (الحل تسلل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار الثقافات مرة أخرى واعادة تعليق الكريات مع كمية مناسبة من الحل تسلل للوصول الى OD النهائي 600 = 0.5 (الشكل 2C-D). قبل التسلل النباتات، وترك المزيج من الخلايا في درجة حرارة الغرفة ل1-3 ساعة. هذه الخطوة تساعد على الحفاظ على التوازن الخلية. </li></ol> 3. التبغ نبات ورقة حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نباتات التبغ (النيكوتين benthamiana)، ونمت 4 - القديم أسابيع 5 في غرفة نمو النبات القياسية (23 درجة مئوية مع دورات 16 ساعة الضوء / 8 ساعات الظلام) 14 للحقن ورقة. ملاحظة: في هذه المرحلة، نباتات التبغ وعادة ما يكون 6 أوراق (2 كبير، 2 متوسطة، و 2 صغيرة). واثنين من يترك المتوسطة الحجم هي الاكثر الأمثل للحقن ورقة (وهما الكبيرة هي قديمة جدا، في حين أن اثنين من الشركات الصغيرة غالبا ما تكون صغيرة جدا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم تسلل، يسقي tobacمحطات شارك إلى تشبع التربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم تسلل، قبل احتضان النباتات في الظلام لمدة 1-3 ساعة. هذه الخطوة تسمح الثغور في البشرة لفتح على نطاق واسع، مما يسهل كثيرا من الأجرعية عند اختراق في خلايا ورقة البشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الأشرطة اللون المسمى مع التمر والعلم الأوراق مخترقة. كافة المجالات التي سيتم تسلل مع sharpie سميك أسود (اختياري، والمناطق تسلل واضحة بعد إصابتها.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ كميات متساوية من الأجرعية اعادة تعليق ومزجها في 100 × 15 ملم طبق بيتري من قبل يحوم طيف (الشكل 2E). ملاحظة: في حالتنا، نحن مختلطة 1 مل من P19 مع 1 مل من الحراجية المعتمدة بعسل، 1 مل من DNyda-nYFP و 1 مل من DNmpk-cYFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في عملية تسلل، وملء 3 مل حقنة needleless مع مزيج تسلل (1-2 مل)، ودفع إلى الجانب السفلي (مجافي المحور) من أوراق التبغ (الشكل 2F). في حين اختراق، فإنه من المفيدلاستخدام يد واحدة لدفع واليد الأخرى لدعم بلطف الجانب العلوي (متجه نحو المحور، ضد قوة دفع). ملاحظة: عندما يتم حقن خليط تسلل بنجاح، سوف المناطق المصابة تصبح التعرف عليها بسهولة في البشرة. ومع ذلك، قد تفشل تسلل بسبب حقن القاسي (تلف الأنسجة) أو دفع كافية (لا اختراق السائل). لكل اختبار، نقترح اثنين على الأقل من الحقن في اثنين من يترك مستقلة (من نباتات مختلفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع النباتات المصابة مرة أخرى في غرفة النمو. عموما، والتعابير البروتين يمكن اكتشافها بعد 48 ساعة تسلل التالية. </li></ol> 4. متحد البؤر التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 48 ساعة بعد تسلل، استخدم الناخس حفرة لاستئصال قرص ورقة من منطقة حقن (عادة 3-4 أقراص / منطقة يمكن أن تنتج) (الشكل 2G). استخدام ملاقط لنقل بلطف الأقراص ورقة إلى شريحة (الجانب مجافي المحور الصاعد) وجبل لهم قطرات الماء. تجنب الضغط هار جداد على غلاف زلة لأنه لن تقلص / الخلايا التالفة لا تظهر بشكل جيد تحت المجهر متحد البؤر (الشكل 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التصوير متحد البؤر، تفحص عينات التي شنت على مجهر مركب برنامج التحصين الموسع الفلورسنت للتحقق من مستويات التعبير. ملاحظة: استنادا إلى تجربتنا، فإن الخلايا التي تظهر مستويات التعبير وسيطة هي أفضل ممثلة تحت المجهر متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبدأ مع 40X (NA 1.3) عدسة على المجهر متحد البؤر. ضبط الشريحة إلى الموضع المطلوب بحيث تبقى الخلايا معربا عن مستويات متوسطة من البروتين الفلورسنت في المركز. أطياف الإثارة / انبعاث لCFP و YFP هي 458 نانومتر / 480-500 نانومتر و 514 نانومتر / 520-540 نانومتر، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل زر &quot;لايف&quot; لمعاينة الصور ثم ضبط كثافة الليزر وزيادة الذكية للحصول على نسبة مضان كثافة / الضوضاء الأكثر توازنا. لتحسين جودة التصوير، وزيادة بكسل مسح و / أو المتوسط ​​إطار / خط. وأخيرا، وضبط مقبض التركيز على الجرميةالفصل البؤري متوسط ​​وفوق &quot;لقطة&quot; لاتخاذ صورة. ملاحظة: CFP والصور YFP يمكن التقاط أو بالتتابع في وقت واحد عن طريق فحص أو إيقاف خيار &quot;متسلسلة&quot; وضع المسح الضوئي، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الرغبة Z-الإسقاط للرأي في عمق الخلايا، حدد &quot;س ع ص&quot; واسطة التصوير، وتحديد عمق نطاق المسح (10-15 ميكرون)، وجمع الصور من أعلى إلى أسفل الخلية المستهدفة . تجميع الصور التي تم الحصول عليها مع برنامج لايكا عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على ملف الصورة لتحديد &quot;إعادة تسمية&quot; وتصدير الصور على هيئة ملفات TIFF.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة 30 - 40 خلايا للتحليل الكمي. </li></ol> تجهيز 5. صورة والتحليل الكمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرمجيات فيجي (http://fiji.sc/Fiji) لمعالجة الصور وإجراء القياس الكمي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم الرسوم البيانية كثافة مضان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور أفضل ما إذا كان التعبير CFP / YFP هوبشكل موحد وزعت، استخدم فيجي للتدليل على قوة إشارة CFP و YFP على طول محيط الخلية. ولتحقيق ذلك، إطلاق أول فيجي ثم حدد &quot;ملف&quot; و &quot;فتح&quot; لبدء صورة. انقر على &quot;خط&quot; في القائمة أداة وحدد &quot;خط مجزأة&quot; طريق النقر على الحق. تقرر المنطقة من اهتمام ورسم خط على طول محيط الخلية لتتبع CFP أو إشارة YFP (الشكل 3A-C). ملاحظة: فيجي يقيس قيمة كثافة مضان المطلقة على طول خطوط مجزأة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر من القائمة المنسدلة &quot;تحليل&quot; و &quot;الملف مؤامرة&quot; لإنشاء رسم بياني مع الموقف وشدة القيم التي تمثل مستويات CFP / YFP على طول خط مجزأة. إذا رغبت في ذلك، مكررة قيم الكثافة (من خلال اختيار قائمة &quot;نسخ&quot;) في EXCEL أو غيرها من برامج الرسم لتوليد الرسوم البيانية كثافة مماثلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس درجة القطبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما يقرب من 20 تمثيلا وخلايا tative من 3 تجارب تكرار لتقييم درجة قطبية CFP و YFP في الخلايا التبغ. حساب درجة الاستقطاب على أساس نسبة كثافة عالية مضان (كما هو موضح H) على مدى كثافة مضان منخفضة (كما هو موضح L). ملاحظة: يتم شرح طريقة الكمي في الشكل (3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس القيم H و L، رسم خط مجزأة على طول المنطقة المهتمة في محيط الخلية (المذكورة أعلاه)، انقر فوق &quot;تحليل&quot; من القائمة المنسدلة، ثم حدد &quot;القياس&quot;. عندما ملوثات العضوية الثابتة &quot;نتائج&quot; نافذة تصل، استخدم &quot;يعني&quot; القيم لأداء الكمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الخلايا التي تظهر التعبير موحدة نسبيا من CFP و YFP، على سبيل المثال، الحراجية المعتمدة بعسل (الشكل 3A) أو YFP تستكمل من شارك في التعبير عن DNyda-nYFP وDNmpk6-cYFP (الشكل 3B)، للحصول على القيم H و L عن طريق قياس اثنين تم اختيارها عشوائيا قطاعات هامشية على قدم المساواة مع الطول. </li> &lt;li&gt; من الخلايا العارضة تراكم القطبي واضح من البروتينات الفلورية، في هذه الحالة، وشارك في التعبير عن الحراجية المعتمدة بعسل، DNyda-nYFP وDNmpk6-cYFP (الشكل 3C)، وجمع القيم H من المناطق الطرفية مع إشارات مضان المخصب وليرة سورية من المناطق مع عدم وجود تراكم منخفض / مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع النسب الناتجة من H / L من 20 زنزانة معا، واختبار للتوزيع الطبيعي. حساب القيم p بواسطة اختبار ر الطالب (على التوزيع الطبيعي) أو اختبار كولموجوروف-سميرنوف (KS) (للتوزيع غير عادي). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis.">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li><li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis.">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li><li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase.">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304, 1494-1497 (2004).</li><li>Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+and+expanded+roles+for+MAPK+signaling+in+Arabidopsis+stomatal+cell+fate+revealed+by+cell+type-specific+manipulations.">Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations.</a> Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).</li><li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis.">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19, 63-73 (2007).</li><li>Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BASL+Polarity+Protein+Controls+a+MAPK+Signaling+Feedback+Loop+in+Asymmetric+Cell+Division.">The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division.</a> Dev Cell. 33, 136-149 (2015).</li><li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+Streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway(R)+TOPO+vector+system.">Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system.</a> Plant methods. 4, 4 (2008).</li><li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+evidence+that+the+Arabidopsis+MAP+kinase+MPK6+is+involved+in+anther,+inflorescence,+and+embryo+development.">Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.</a> J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).</li><li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-mediated+site-directed+mutagenesis.">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).</li><li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation.">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).</li><li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+regulation+of+transport+activity+by+heterotrimerization+of+Arabidopsis+ammonium+transporter+complexes+in+vivo.">Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo.</a> Plant Cell. 25, 974-984 (2013).</li><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method.">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH protocols. 2006 (7), (2006).</li><li>Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus.">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> Plant J. 33, 949-956 (2003).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in molecular biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+signaling+in+Arabidopsis.">Cell polarity signaling in Arabidopsis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).</li><li>Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIN+phosphorylation+is+sufficient+to+mediate+PIN+polarity+and+direct+auxin+transport.">PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).</li><li>Furutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar-localized+NPH3-like+proteins+regulate+polarity+and+endocytosis+of+PIN-FORMED+auxin+efflux+carriers.">Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers.</a> Development. 138, 2069-2078 (2011).</li><li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+localization+and+degradation+of+Arabidopsis+boron+transporters+through+distinct+trafficking+pathways.">Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).</li><li>Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OCTOPUS,+a+polarly+localised+membrane-associated+protein,+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana.">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis.">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li><li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth.">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li></ol>

أعلنت أي تضارب في المصالح.

الاستخدام العام والتعديلات الممكنة للنظام التعبير عابر التبغ لنقل الإشارة: overexpression من البروتين الفلوري (FP) -tagged البروتينات في البشرة التبغ استخدمت بنجاح لفحص سريع للبروتين توطين التحت خلوية في الخلايا النباتية. ومع ذلك، ودراسة توزيع الإشارات الديناميكي لل...

تتفاعل البروتينات داخل المجمعات شبكة وشكل هرمي المعقدة التي تلعب دورا محوريا في العمليات الحيوية كلها تقريبا التي تحدث في بيئة الخلوية لا يمكن التنبؤ بها. ومع ذلك، من تطوير المصنع لاستجابات النمو، فقد كان هناك نقص في أدوات ملائمة من لا يمكن بسرعة فحسب، بل أيضا في تحديد كفاءة ورصد هذه الأحداث يشير إلى ديناميكية على مستوى التحت خلوية. نظام بروتين تعبير عابر في البشرة أوراق التبغ وجذابة المزايا لتصور البروتينات الفلورية في الخلايا الحية. ويوفر هذا النظام شبه في الجسم الحي الظروف التي تسمح تعديل البروتين ما بعد متعدية والفحص السريع للتوطين البروتين. عن طريق فحص إشارة YFP تستكمل، وتكامل فلوري (BiFC) الفحص ثنائي الجزيء بإعلام إمكانية التفاعل البروتين البروتين في الخلايا النباتية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، على سبيل المثال، الخميرة اثنين الهجين (Y2H) وشارك-immunoprecipitation (المشارك IP)، ويوفر BiFC أيضا وسيلة قوية للتصور مقصورات حيث قد تحدث تفاعلات البروتين البروتين على مستوى التحت خلوية. بسبب انقسام الخلايا غير المتماثلة (ACD) يحافظ على وقف سكان الخلية أثناء إنشاء أنواع الخلايا الجديدة لتشكيل نسيج / الجهاز، وهو آلية لا غنى عنها لتعزيز multicellularity حقيقية النواة. وقد استخدمت تنمية نبات الأرابيدوبسيس الثغور كنظام نموذج لدراسة ACD في النباتات. الخلية السلائف، الخلية الأم meristemoid، يقسم غير متماثلة لإنتاج خليتين ابنة مختلفة، وmeristemoid (يخضع لوقف الانقسامات تشبه الخلايا قبل إنهاء في زوج من خلايا الحرس) وخلية الثغور النسب الأرض (SLGC) (قد الانقسام والتمايز إلى خلية الرصيف)، على التوالي (الشكل 1). في خلايا الثغور ACD، والاستقطاب في كسر رواية البروتين من عدم التماثل في النسب الثغور (بعسل) premitotically لدفع التماثل الانقسام، الذي المؤتمر الوطني العراقيعدم التكافؤ المادي lude ومصير خلية التباين 1. وتبدأ عملية متسلسلة MAPK تتألف من MAPKKK يودا وMAPKs، MPK3 و 6 هي المركزية لالزخرفة قسم الثغور واعتماد مصير 2،3، 4،5. في الآونة الأخيرة، وتشانغ وآخرون. ربط بعسل البروتين القطبية إلى مسار الإشارات YDA-MAPK في نبات الأرابيدوبسيس خلايا الثغور ACD 6. الكنسي يودا-MAPK الطريق، من خلال MPK3 / 6، phosphorylates بعسل وينشط الاستقطاب. وظائف بعسل فسفرته كما سقالة ويجند يودا (YDA) وMPK3 / 6 لتشكيل مجمع البروتين ويركز الإشارات في الخلية قشرة 6. الاستقطاب من المكونات MAPK وحلقة التغذية المرتدة الإيجابية بين بعسل ومسار YDA-MAPK يمثل آلية جديدة لاستقطاب البروتين في الخلايا النباتية. وافترض المخصب محليا مما يشير الى MAPK أن تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا التمايز مصير خلية في خلايا الثغور ACD 6 (الشكل 1). واحدة من كإرنست و يونغ البيانات التجريبية التي دعمت هذا النموذج جاء من المقايسات التبغ التي أظهرت إعادة توزيع المكاني للMAPKs الناجم عن التعبير عن بعسل 6. بشكل عام، فإنه ليس من السهل لمراقبة حيث تحدث MAPK إشارات لأن جزيئات MAPK وكثيرا ما وجدت في كل مكان داخل الخلية. في هذه الدراسة، ونحن الاستفادة من نظام تقسيم YFP لتصور التفاعل بين كيناز المنبع والمصب منها تشير إلى مكان حدوث تتابع الإشارات. مددنا كذلك استخدام نظام BiFC عن طريق المشاركة في التعبير عن بروتين الثالث (CFP الموسومة) مع انقسام YFP الزوج (موحية للتفاعل البروتين البروتين) لتصور ما إذا كانت وكيف YFP تستكمل يمكن التضمين مكانيا من قبل المشارك وأعرب البروتين CFP. وبذلك، أثبتنا أن شارك في التعبير عن الحراجية المعتمدة بعسل الناجم عن إعادة تنظيم المكاني للالتفاعلات بين جمعية تنمية الشباب وMPK6، حتى من توزيعها على الزخرفة الاستقطاب في القشرة خلية من epiderm التبغخلايا تنظيم. ولهذا النظام لديه القدرة على أن تكون المتقدمة لرصد الأحداث إشارات حيوية في خلايا النبات تحت ظروف عندما تحدى الخلايا عن طريق المحفزات الداخلية أو الخارجية (على سبيل المثال، وشارك في التعبير عن البروتينات الأخرى، تطبيق الكيميائية، مهاجمة مسببات الأمراض أو التغيرات البيئية وغيرها. ).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D/TOPO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent Technology</td>
			<td>200521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J106-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J673-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3632-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x75mm Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x50 mm Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS SP5 II</td>
			<td>&#160;LAS AF Lite software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 x objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;</td>
			<td>HCX&#160;Plan APO&#160;, NA 1.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SORVALL 6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml falcon tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>21-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 5 Forceps</td>
			<td>Canemco &#38; Marivac</td>
			<td>205EQA-Spec</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging spatial reorganization of a mapk signaling pathway using the tobacco transient expression system

وكانت تصور الأحداث الإشارات الحيوية في الخلايا الحية تحديا. قمنا بتوسيع نظام التعبير عابرة المعمول بها، والجزيئية البيولوجية تكامل فلوري (BiFC) الفحص في خلايا البشرة التبغ، من التفاعل اختبار البروتين البروتين لمراقبة التوزيع المكاني لنقل الإشارة في الخلايا النباتية. في هذا البروتوكول، ونحن استخدام فحص BiFC لإظهار أن التفاعل والإشارات بين نبات الأرابيدوبسيس MAPKKK يودا وMAPK6 تحدث في غشاء البلازما. عندما كان يشارك في اعرب عن بعسل بروتين سقالة، والتفاعل يودا-MAPK توزيعها مكانيا وشارك الاستقطاب مع CFP-بعسل. يسمح هذا النظام التعبير التبغ المعدلة للفحص السريع للإشارات توطين ودينامية التغيرات (أقل من 4 أيام) ويمكن أن تستوعب متعددة الألوان بروتين فلوري (ثلاثة على الأقل). قدمنا ​​أيضا طرق مفصلة لتحديد توزيع البروتين (توطين المكاني غير المتماثلة، أو &quot;الاستقطاب&quot;؛) في الخلايا التبغ. هذا النظام التعبير التبغ متقدمة لديه القدرة على أن تستخدم على نطاق واسع لاختبار سريع للأحداث الإشارات الحيوية في الخلايا النباتية الحية.

لمنع موت الخلايا الناجم عن إشارات MAPK مفرط، تم استخدام الإصدارات كيناز غير نشطة من YDA (DNyda) وMPK6 (DNmpk6) في فحص شاركت في التعبير في الخلايا التبغ. لا التفاعل بين DNyda وDNmpk6 التي كشفت عنها BiFC ولا الحراجية المعتمدة بعسل نفسها ولدت نمط التوزيع غير المتكافئ (?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System at JoVE.com

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

التصوير إعادة التنظيم المكاني لMAPK اشارة المسار باستخدام نظام التعبير عابر التبغ

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  Rutgers, The State University of New Jersey. The overall goal of this procedure is to visualize dynamic spatial distribution of protein

Video: Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

تصور انواع معينة ايليجانس</emالهياكل البشرة> استخدام الصبغة الحيوية محبة للدهون ، صلاح الغيدان

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

سير عمل التصوير عالي المحتوى لدراسة Grb2 مجمعات اشارة عن طريق الاستنساخ التعبير

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration كفاءة من النباتات للتعبير عابر الرفيع المستوى من البروتينات المؤتلف

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

التعبير عابرة من البروتينات عن طريق هيدرودينامي الجينات في الفئران التسليم

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.