We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut f&#252;r Molekulare und Zellul&#228;re Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).

ملاحظة: إذا تم استخدام هذا البروتوكول لأول مرة لعزل ISCS التي كتبها FAC الفرز، والضوابط التالية إلزامية من أجل وضع البداية المعلمات FACS بشكل صحيح: تنفصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة دون Sytox. خلايا فصلها عن نوع البرية (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة مع Sytox (انظر الخطوة 3.6). تنفصل الخلايا من midguts من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox. 1. إعداد الحلول وأطباق لغوت تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4-6 قارورة تحتوي كل منها على 40 أنثى الذباب من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من حل 10X PBS الأسهم إعداد 500 مل 1X PBS (1.8 ملي ناه 2 PO 4 · H 2 O، 8.4 ملي نا 2 هبو 4 · 2H 2 O، 175 مم كلوريد الصوديوم، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 3.5٪ محلول الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X (3.5 غرام الكهربائي الصف الاغاروز في 100 مل 1X PBS). إعداد لوحات تشريح بصب هذا الحل في أطباق بتري (قطر 8.5 سم) لتغطية الجزء السفلي. طبقة الاغاروز يمنع تضر نصائح من ملقط أثناء إجراء تشريح. بعد أن طدت هلام تخزين لوحات تشريح في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 300 مل من برنامج تلفزيوني 1X + 1٪ BSA الطازجة قبل تشريح ووضع زجاجة على الجليد أو على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل أجهزة الطرد المركزي وندعه يبرد إلى 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهب نصائح من 2 الماصات الزجاج باستور لتنعيم الحواف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة اثنين من أزواج من ملقط وشفرة حلاقة واحدة مع 70٪ من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 05:56 1.5 مل أنابيب microcentrifuge لجمع midguts تشريح على الجليد. </li></ol> 2. إعداد الجهاز الهضمي المسالك وتشريح المعي المتوسط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب من قارورة واحدة (40 الذباب) مع CO 2 على سرير ذبابة القياسية، وقطع رأس كلالذباب باستخدام شفرة حلاقة ونقلها إلى الطبق تشريح. صب الباردة 1X PBS الحل / 1٪ BSA في طبق تشريح لتغطية agarose هلام. سوف الذباب تطفو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على البطن الطاير مع زوج واحد من ملقط، في حين الضغط على الصدر مع الزوج الآخر من الملقط. فصل القفص الصدري من البطن. والقناة الهضمية تكون واضحة وعلى الأرجح لا يزال يتم توصيل المعي الأمامي / المحاصيل إلى القفص الصدري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على القناة الهضمية والخروج به من القفص الصدري. تتكشف القناة الهضمية، والاستيلاء على المحاصيل وسحب الأمعاء قليلا الأمامية بعيدا عن البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على نهاية الخلفي من البطن مع زوج واحد من ملقط وحافة بشرة المفتوحة الأمامية مع الزوج الآخر من الملقط. يجب الحرص على عدم تدمير الأنسجة الأمعاء جاحظ. سحب نهاية الخلفي بعيدا لكسر بشرة ومواصلة سحب الخلف بلطف شديد حتى تم سحب الأمعاء بأكمله من تجويف البطن. قد يكون المحصول المراد إزالتها مسبقا إذا كانت كبيرة جدا لاحتوائهمن خلال تجويف الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المعي الأمامي، الأنابيب مالبيغي، المعى المؤخر والمبايض وترك المعي المتوسط ​​العارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الزجاج ماصة باستير، ونقل دفعة من midguts تشريح لmicrocentrifuge 1.5 مل أنبوب يحتوي الباردة برنامج تلفزيوني 1X / 1٪ محلول BSA والحفاظ على أنبوب على الجليد. يجب أن تتم معالجة العينات في غضون 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشريح دفعة كاملة كاملة، شطف طبق تشريح مع الماء المقطر المزدوج ليغسل اليسار على الحطام. بدء تشريح الدفعة التالية من midguts (تكرار الخطوات 2،1-2،7). تشريح العديد من دفعات ممكن في غضون 2 ساعة، ثم انتقل إلى الخطوة 3.1. </li></ol> 3. الهضم من الأنسجة غوت إلى خلايا الحصاد لFAC الفرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة / 1٪ الحل BSA برنامج تلفزيوني 1X من midguts وإضافة 500 ميكرولتر من 0.5٪ التربسين-EDTA حل لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة جيدا لمدة 20 ثانية واحتضان العينات بواسطة هزاز لطيف / الدورية في 20 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 25-30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة مرة أخرى بعد حوالي 30 دقيقة، والسماح للسليما بالوعة الأنسجة المعي المتوسط ​​إلى أسفل الأنبوب. بعناية إزالة الخلايا التي هي في تعليق مع ملتهب الزجاج ماصة باستير وتصفية لهم من خلال النايلون 35 ميكرومتر إلى شبكة الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا في أسفل 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. من ملاحظة، عند البدء في هضم، وبيليه الخلية قد لا تكون مرئية في البداية ولكن سوف تصبح واضحة كما في الأنسجة هضم تقدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الحل التربسين إلى العينة أنبوب الأصلي تحتوي على ما تبقى من الأنسجة المعي المتوسط ​​سليمة. تجنب نقل عدد كبير جدا من الخلايا من بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف اعادة تعليق بيليه خلية في 400 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X / 1٪ BSA. الحفاظ على أنابيب microcentrifuge تحتوي على خلايا نأت على الجليد وتغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لحماية الخلايا من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الحل التربسين التي تحتوي على ما تبقى من الأنسجة المعي المتوسط ​​سليمة مرة أخرى ووضع عيناتعلى الروك لمدة 30 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3.3 إلى 3.4.3 حتى كل من الأنسجة المعي المتوسط ​​تم هضمها. الجمع بين الخلايا فصلها عن جميع أنابيب microcentrifuge في واحدة أنبوب microcentrifuge. قد تتطلب هذه خطوة الطرد المركزي كما هو الحال في 3.4، منذ حجم كل تعليق خلية مجتمعة قد يتجاوز 1.5 مل. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد وحماية الخلايا من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا نأت إلى أسفل في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية أكبر قدر من طاف ممكن ترك حوالي 50-100 ميكرولتر من / 1٪ الحل BSA برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب microcentrifuge. بلطف resuspend الخلايا فصل في 800 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X / 1٪ BSA تحتوي على Sytox (1: 20،000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى 5 مل جولة أسفل أنبوب فالكون من خلال تصفية الخلايا من خلال قبعة مبكرة مصفاة الخلية (35 ميكرومتر شبكة النايلون). دائما الاحتفاظ بعينات خلية على الجليد ومحمية من الضوء. الخلايا هي الآن جاهزة ليتم فرزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 600 ميكرولتر من حل RNAlater في كل أنبوب microcentrifuge إلى التي سيتم فرز الخلايا لاحقة العزلة RNA. لتطبيقات المصب الأخرى الخلايا يمكن جمعها في حل مختلف، على سبيل المثال في برنامج تلفزيوني العقيمة. </li></ol> 4. FAC الفرز لعزل الخلايا الجذعية المعوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على الصك التدفق الخلوي ساعة واحدة على الأقل قبل الفرز. تأكد من أن نظام فلويديك خال من فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 70 ميكرون حجم فوهة لحقن الخلايا في مجرى السائل غمد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط السعة للتيار السائل الأساسية بحيث يتوافق مع قيمة الفجوة إلى القيمة المرجعية (6-7، وعند استخدام فوهة 70 ميكرون). السماح للتيار السائل الأساسية تستقر قبل البدء في فرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتباع هذا النظام عندما وضع في البداية المعلمات للفرز: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من الشجاعة نوع البرية. أولا، وضبط FSC وSSC الفولتيةلرسم الخلايا في وسط مؤامرة مبعثر. ثانيا، ضبط FITC (GFP) الجهد بحيث يتم رسم جميع الخلايا أقل من 10 2 على لوغاريتمي محور س. تعيين المعلمة FITC يحدد الحد الأقصى لتألق ذاتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من الشجاعة نوع البرية مع Sytox أضافت. ضبط قيمة الأزرق المحيط الهادئ الجهد وبوابة لتحديد وخلايا معيشة منفصلة من الخلايا الميتة Sytox إيجابية في الأزرق المحيط الهادئ مقابل FSC-A مؤامرة مبعثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox وضبط الجهد FITC للتأكد من أن كل الخلايا GFP إيجابية يتم رسم ضمن مؤامرة مبعثر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأضاف خط الطيران UAS GFP مع Sytox تحميل الخلايا نأت تم الحصول عليها من ESG -Gal4. ضبط قيمة الأزرق المحيط الهادئ الجهد وبوابة لتحديد وخلايا معيشة منفصلة من القتلى، وخلايا Sytox إيجابية (بوابة P1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين SSC-A وFSC-A بوابة للتعرف على GFP-خلايا إيجابية (على أساس المؤامرة الرسم البياني) على النحو الذي يحدده حجم وتحبب (بوابة P2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين بوابة FSC-H وFSC-W لتحديد واستبعاد الحلل خلية GFP إيجابي على أساس حجمها (بوابة P3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين SSC-H وبوابة SSC-W لتحديد واستبعاد الحلل خلية GFP إيجابية على أساس من تحبب (بوابة P4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البوابة P4 لتصوير الخلايا GFP إيجابية في مؤامرة رسم بياني يوضح عدد الخلايا (العدد) مقابل كثافة GFP. سوف قمتين متميزة من الخلايا GFP إيجابية تكون مرئية. إنشاء بوابة لكل الذروة (بوابات P5 وP6). يحتوي بوابة P5 السكان الخلية التي يتم تخصيبها للISCS ويمكن فرزها بشكل منفصل من الخلايا في بوابة P6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلفية البوابة في مؤامرة كفاف للتحقق من أن اثنين من السكان الخلية متميزة GFP إيجابية تحتوي على الخلايا الحية (قارن مع بوابة P1) والخلايا من الحجم الصحيح (مقارنة مع بوابة P2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرز خلايا في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل يحتوي على 600 &amp; #181؛ ل من حل RNAlater. ويتم الفرز في معدل تدفق منخفض (بحد أقصى 2.0، 70 ميكرون فوهة، 1،000 أحداث / ثانية، و 70 رطل) وتوظيف اتجاهين نقاء النوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال الفرز، دوامة فورا الخلايا مرتبة لفترة وجيزة والحفاظ على أنابيب microcentrifuge على الجليد حتى الشروع في العزلة RNA أو التطبيقات المصب الأخرى. </li></ol>

<ol>
	<li>Jones, D. L., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+models+and+paradigms+for+stem+cells+ageing.">Emerging models and paradigms for stem cells ageing.</a> Nat. Cell Biol. 13 (5), 506-512 (2011).</li><li>Ot&#237;n, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li><li>Signer, R. A., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+stem+cell+aging+and+life+span.">Mechanisms that regulate stem cell aging and life span.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 152-165 (2013).</li><li>Iliadi, K. G., Knight, D., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+Aging+&#8211;+Insights+from+Drosophila.">Healthy Aging &#8211; Insights from Drosophila.</a> Front. Physiol. 3, 106 (2012).</li><li>Biteau, B., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGF+signaling+regulates+the+proliferation+of+intestinal+stem+cells+in+Drosophila.">EGF signaling regulates the proliferation of intestinal stem cells in Drosophila.</a> Development. 138 (6), 1045-1055 (2011).</li><li>Jasper, H., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+stem+cell+behavior+and+implications+for+aging.">Metabolic regulation of stem cell behavior and implications for aging.</a> Cell Metab. 12 (6), 561-565 (2010).</li><li>Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+tissue+homeostasis:+dynamic+control+of+somatic+stem+cell+activity.">Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity.</a> Cell Stem Cell. 9 (5), 402-411 (2011).</li><li>Wang, L., Jones, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+aging+on+stem+cell+behavior+in+Drosophila.">The effects of aging on stem cell behavior in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 46 (5), 340-344 (2011).</li><li>Lucchetta, E. M., Ohlstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+midgut:+a+model+for+stem+cell+driven+tissue+regeneration.">The Drosophila midgut: a model for stem cell driven tissue regeneration.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (5), 781-788 (2012).</li><li>Ayyaz, A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+inflammation+and+stem+cell+homeostasis+in+aging+Drosophila+melanogaster.">Intestinal inflammation and stem cell homeostasis in aging Drosophila melanogaster.</a> Front. Cell Infect. Microbiol. 3 (98), (2013).</li><li>Jiang, H., Patel, P. H., Kohlmaier, A., Grenley, M. O., McEwen, D. G., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine/Jak/Stat+Signaling+Mediates+Regeneration+and+Homeostasis+in+the+Drosophila+Midgut.">Cytokine/Jak/Stat Signaling Mediates Regeneration and Homeostasis in the Drosophila Midgut.</a> Cell. 137 (7), 1343-1355 (2009).</li><li>Ohlstein, B., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adult+Drosophila+posterior+midgut+is+maintained+by+pluripotent+stem+cells.">The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells.</a> Nature. 439, 470-474 (2006).</li><li>Micchelli, C. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+stem+cells+reside+in+the+adult+Drosophila+midgut+epithelium.">Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium.</a> Nature. 439, 475-479 (2006).</li><li>Ohlstein, B., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+Drosophila+intestinal+stem+cells+specify+daughter+cell+fates+by+differential+notch+signaling.">Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential notch signaling.</a> Science. 315 (5814), 988-992 (2007).</li><li>Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK+Activity+in+Somatic+Stem+Cells+Causes+Loss+of+Tissue+Homeostasis+in+the+Aging+Drosophila+Gut.">JNK Activity in Somatic Stem Cells Causes Loss of Tissue Homeostasis in the Aging Drosophila Gut.</a> Cell Stem Cell. 3 (4), 442-455 (2008).</li><li>Choi, N. H., Kim, J. G., Yang, D. J., Kim, Y. S., Yoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+Drosophila+midgut+are+associated+with+PVF2,+a+PDGF/VEGF-like+growth+factor.">Age-related changes in Drosophila midgut are associated with PVF2, a PDGF/VEGF-like growth factor.</a> Aging Cell. 7, 318-334 (2008).</li><li>Park, J. S., Kim, Y. S., Yoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+p38b+MAPK+in+age-related+modulation+of+intestinal+stem+cell+proliferation+and+differentiation+in+Drosophila.">The role of p38b MAPK in age-related modulation of intestinal stem cell proliferation and differentiation in Drosophila.</a> AGING. 1 (7), 637-651 (2009).</li><li>Berger, C., Harzer, H., Burkard, T. R., Steinmann, J., vander Horst, S., Laurenson, A. S., Novatchkova, M., Reichert, H., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+and+transcriptome+analysis+of+Drosophila+neural+stem+cells+reveals+a+role+for+Klumpfuss+in+self-renewal.">FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal.</a> Cell Rep. 2 (2), 407-418 (2012).</li><li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing.">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nat. Protoc. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li><li>Yagi, Y., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Drosophila+EGF+receptor+in+determination+of+the+dorsoventral+domains+of+escargot+expression+during+primary+neurogenesis.">Role of the Drosophila EGF receptor in determination of the dorsoventral domains of escargot expression during primary neurogenesis.</a> Genes Cells. 2 (1), 41-53 (1997).</li><li>Amcheslavsky, A., Ito, N., Jiang, J., Ip, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberous+sclerosis+complex+and+Myc+coordinate+the+growth+and+division+of+Drosophila+intestinal+stem+cells.">Tuberous sclerosis complex and Myc coordinate the growth and division of Drosophila intestinal stem cells.</a> J. Cell Biol. 193 (4), 695-710 (2011).</li><li>Dutta, D., Xiang, J., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+expression+profiling+from+FACS-isolated+cells+of+the+Drosophila+intestine.">RNA expression profiling from FACS-isolated cells of the Drosophila intestine.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 13 (27), (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

يصف بروتوكول المعروضة طريقة لعزل ISCS من الشباب والكبار القديم midguts ذبابة الفاكهة، والتي يمكن أن تستخدم لاحقا لمزيد من التحليلات الجزيئية مثل الجيل القادم التسلسل. FAC الفرز من السكان خلية GFP إيجابية من ESG -Gal4، تم تحقيق-UAS GFP خط الطيران بالفعل من قبل العديد من الجماعات 21،22. ولكن، حتى الآن وجود اثنين من القمم متميزة من الخلايا GFP إيجابية تم إما التغاضي أو مقومة بأقل من قيمتها. وتبين لنا أن هذا الفصل لا يمثل سوى اثنين مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا (ISCS وEBS)، ولكن أيضا أن اثنين من قمم خلايا GFP إيجابية تبقى منفصلة بوضوح أثناء الشيخوخة. هذه الملاحظة هي ذات أهمية كبيرة وقيمة للباحثين المهتمين في دراسة الخلايا الجذعية أو السلف أثناء الشيخوخة. وقد أعاق عزل ISCS من midguts القديمة من حقيقة أنه لا يوجد مزيج الواسمات الجزيئية لتحديد ISCS في المعي المتوسط ​​العمر. العلامة الوحيدة التي شيحدد nambiguously ISCS في المعي المتوسط ​​القديم هو الفوسفات-histone3 (PH3)، منذ ISCS هي تقسيم الخلايا فقط في المعي المتوسط ​​12،13. ومع ذلك، PH3 هو علامة غير مناسبة لعزل ISCS منذ عدد من تقسيم الخلايا الجذعية في أي نقطة زمنية معينة منخفض جدا من أجل الحصول على مبلغ محترم من ISCS للتحليلات لاحقة. وESG خط الطيران -Gal4، UAS-GFP هو خط الطيران الأكثر شيوعا التي يستخدمها الباحثون الذين يدرسون ISC وظيفة والصيانة والتمايز. ويستند معرفتنا الحالية بشأن تنظيم الجزيئي للISCS التوازن على الدراسات التي تم التلاعب بها جزيئات محددة ومسارات إشارات (استعراضها في 7). بالتالي، لا يزال يفتقرون إلى المعرفة عن التغيرات الجزيئية الداخلية التي تحدث أثناء الشيخوخة. طريقة هنا وصف يغلق هذه الفجوة، ويستند على حقيقة أن ISCS يمكن عزل بناء على حجمها وتحبب وGFP كثافة من midguts الكبار في أي نقطة زمنية أثناء الشيخوخة. في حينإنشاء وتحسين هذه الطريقة وجدنا الخطوات التالية لتكون حاسمة لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها. تحتاج ما يقرب من 200 الشجاعة أن تشريح من أجل الحصول على كمية جيدة من ISCS لFAC الفرز. سرعة تشريح أمر بالغ الأهمية ويعتمد على ممارسة الفرد. ويمكن للفرد مدربين تشريح 40 الشجاعة في غضون 20-30 دقيقة. منذ يتم التعبير عن GFP أيضا في الأنابيب مالبيغي في ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران، فمن الضروري لإزالة الأنابيب مالبيغي تماما من المعي المتوسط. يجب أن تظل midguts تشريح في بيئة باردة لتجنب تدهور الأنسجة وتقليل النشاط ريبونوكلياز في الأنسجة. ولذلك، يجب نقل midguts تشريح من الطبق تشريح في أنابيب microcentrifuge تحتوي الباردة 1X PBS الحل / 1٪ BSA بعد كحد أقصى من 20-30 دقيقة، وأبقى على الجليد. ومع ذلك، لا ينبغي أن يترك لتشريح midguts على الجليد لمدة أكثر من 2 ساعة قبل بدء تفكك الأنسجة مع التربسين. الأكثر efficiنهج الأنف والحنجرة هو تشريح العديد من دفعات من الذباب ممكن داخل هذه الساعة 2، ثم تبدأ التربسين هضم لهذه دفعات. إذا هناك حاجة لمزيد midguts، ويمكن تشريح خلال الأوقات حضانة التربسين هضم. وعلى الرغم من التربسين هو انزيم قوية جدا، ويمكن أن يكون لها آثار ضارة على خلايا، ما زلنا الحصول عليها ما يكفي من المعيشة، الخلايا السليمة لاحق FAC الفرز. الخطوة الرئيسية الداخلي في أن يسمح لعزل خلايا سليمة هي أن تتم إزالة الخلايا فصلها من الحل التربسين كل 30 دقيقة. إذا حضنت midguts تشريح لمدة 2 ½ ساعة في التربسين التي تحتوي على الحل في درجة حرارة الغرفة، لاحظنا زيادة 20-30٪ في الخلايا الميتة، Sytox إيجابية. وتجدر الإشارة إلى أن الحل التربسين التي نستخدمها يحتوي على EDTA. وجود EDTA ربما يسهل تفكك الأنسجة التي كتبها مخلبية أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم اللازمة للوظيفة المناسبة من جزيئات المصفوفة خارج الخلية. </P&gt; أهم الخطوات الحاسمة بنجاح لنوع ISCS من الشجاعة الصغار والكبار هي الإعدادات الأولية المناسبة للFACS والمعلمات النابضة باستخدام عناصر التحكم وصفها وبعد تسلسل هرمي محدد الفرز. نحن إجراء FAC فرز على II تدفق عداد الكريات ARIA (البرمجيات FACSDiva). من المهم أن يتم تشغيل الأداة على ساعة واحدة على الأقل قبل الفرز في عملية الاحماء الليزر. من ملاحظة، عندما يتم تنفيذ FAC فرز ISCS لأول مرة، والمعلمات للفرز وضرورة التعويض الواجب تعيين باستخدام ضوابط المذكورة أعلاه: (1) فصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة دون إضافة Sytox - تحديد هذه المعلمة (الخطوة 4.4.1) يمنع فرز الخلايا استنادا تألق ذاتي لهم. (2) فصل الخلايا من النوع البري (على سبيل المثال ث 1118) midguts ذبابة الفاكهة مع Sytox وأضاف - وضع هذه المعلمة(الخطوة 4.4.2) تتيح فصل القتلى من الخلايا الحية (الخلايا الميتة لها تألق ذاتي عالية، ويمكن تلوث الخلايا GFP إيجابية مرتبة)؛ (3) فصل الخلايا من midguts من ESG -Gal4،-UAS GFP خط الطيران دون Sytox - وضع هذه المعلمة (الخطوة 4.4.3) يضمن أن جميع الخلايا GFP إيجابية يتم رسم ضمن مؤامرة مبعثر. إذا لم يتم تعيين هذه المعلمات بشكل صحيح، من المرجح أن تحتوي على السكان الخلية فرزها الخلايا الميتة والحطام (الشكل 5B، C)، العديد من الخلايا GFP إيجابية سيفتقد (الشكل 5D) واثنين من القمم متميزة للخلايا GFP إيجابية كما ينظر في المؤامرة الرسم البياني لن يتم الكشف عن (الشكل 2E والشكل 3E). مرة واحدة وقد تم تعيين FACS والمعلمات النابضة، يتم معايرة الصك وعلى استعداد لفرز الخلايا من ESG -GAL4،-UAS GFP خط الطيران. وبما أن هذه المعايير يمكن انقاذه، وكلها المستقبل الفرز جلسات لISCS وEBS من ESG -GAL4، UAS-GFP خط الطيران يمكن أن تبدأ من الخطوة 4.5. وعلى الرغم من اختيار وضع &quot;الطهارة&quot; وأداء نقاء اتجاهين نوع يقلل من عدد الخلايا مرتبة، فإنه يسمح لصرامة فرز أعلى (الخطوة 4.6 و الشكل 4B، C). من المذكرة، والاستفادة من استخدام Sytox بدلا من يوديد propidium لتسمية الخلايا الميتة هي أنه لا يوجد سوى امتداد منخفض في FITC (GFP) القناة، مما يجعل من السهل للتعويض عن غير المباشرة. لدينا وسيلة لإثراء لISCS وEBS، على التوالي، تقوم على فرز الخلايا وفقا لمختلف المستويات GFP التعبير. ومن المحتمل أن يكون خلال الشيخوخة misdifferentiated EBS أيضا عن GFP على مستوى أدنى، ويمكن أن يكون مخطئا كما ISCS. ومع ذلك، منذ الخلايا مرتبة تختلف أيضا من حيث الحجم وتحبب، فإننا نعتقد أن استراتيجية الفرز لدينا هو الأكثر مناسبة لهذا التاريخ لإثراء لISCS وEBS. أيضا، فمن المعروف أن الخلايا في المعي المتوسط ​​الشيخوخة الاحتفاظ بالهوية ISC لديها نواة صغيرة 15. للحصول على مزيد من الوضوح بشأن هوية الخلايا فرزها، يمكن للمرء أن فرز الخلايا من خط المعدلة وراثيا ذبابة الذي يحمل ESG ​​-GAL4، UAS-GFP والشق يشير مراسل التحوير. منذ وقد تبين الشق أن تكون نشطة فقط في EBS 12،13، معزولة ISCS من المعي المتوسط ​​الشباب ستكون سلبية لمراسل الشق، في حين أن EBS ستكون إيجابية لمراسل الشق. ومع ذلك، أثناء الشيخوخة الشق يشير يصبح الشاذة في النسيج المعى المتوسط. لذلك، لا بد من اختبار ما إذا كان هذا التجريبية انشاء هو في الواقع أكثر موثوقية للتمييز بين ISCS وEBS معزولة من المعي المتوسط ​​القديم. لقد استخدمنا بالفعل هذا النهج لتحليل مقارن لTranscriptome على ISCS من midguts الصغار والكبار وحددت عددا من العوامل التي يتم تنظيمها بشكل مختلف خلال الشيخوخة (unpub. observ). بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحليل الاختلافات في التعبير الجيني بين ISCS وEBS. هذا التحقيقالصورة ستوفر نظرة ثاقبة على التغيرات الجزيئية الأولية التي تحدث كما يدخل خلية عملية التمايز. أيضا، فإن العزلة من خلال EBS الشيخوخة واللاحقة التحليلات تسليط الضوء على التغيرات الجزيئية التي يسببها سن misdifferentiation. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن دمجها مع أدوات الوراثية الأخرى المستخدمة في ذبابة الفاكهة لدراسة وظيفة الجين. وباختصار، هذا الأسلوب يوفر نهج غير متحيز للتحقيق في الخصائص الجزيئية والتغيرات في ISCS وEBS أثناء الشيخوخة. هذا هو أداة قيمة من شأنها أن تسهل استكشاف آليات الشيخوخة في الخلايا الجذعية والسلف الكبار.

وهي نتيجة لا مفر منها لتقدم السن هي القدرة تقليل من الأنسجة والأعضاء على البقاء وظيفية. الخلايا الجذعية البالغة ضرورية للحفاظ على توازن الأنسجة وظائف الجهاز، ولكن كما من الكائنات العمر، والخلايا الجذعية أيضا تشهد انخفاضا في السلوك البيولوجية. هذا هو ضار بشكل خاص إلى الأنسجة التي لديها معدل دوران عالية، مثل ظهارة الأمعاء. وتشمل السمات المميزة للخلايا الجذعية الذين تتراوح أعمارهم بين الضرر الجيني، وآليات إصلاح المتضررة، وضعف تنظيم دورة الخلية ومسارات الإشارات misregulated، وكلها تؤثر على سلوك الخلايا الجذعية العادي (استعراضها في 1-3). عن طريق التلاعب مسارات إشارات محددة أو هدمت جينات معينة، لقد اكتسبت نظرة ثاقبة دورهم في تنظيم والحفاظ على سلوك الخلايا الجذعية العادي. لأن معظم هذه التجارب من النهج جزيء مرشح، لدينا القليل جدا من المعرفة حول التغييرات الجزيئية الداخلية التي تحدث في الخلايا الجذعية خلالالشيخوخة. طريقة واحدة لنهج هذا السؤال هو لمقارنة Transcriptome على من الشباب مقابل الخلايا الجذعية القديمة لتحديد الجزيئات التي تتغير بشكل ملحوظ خلال الشيخوخة الملف الشخصي التعبير. للأسف، أعاقت التحديات البيولوجية والتقنية تقدمنا ​​بشأن هذا النهج حتى الآن. ذبابة الفاكهة البطن هو كائن نموذج مناسب للغاية لدراسة الشيخوخة لأنه لديه لمدة قصيرة (حوالي 60-70 يوما) والمعارض الشيخوخة الظواهر (استعراضها في 4). وعلاوة على ذلك، يمكن تسريع عملية الشيخوخة في ذبابة الفاكهة في درجة الحرارة. عندما الحفاظ على الذباب في 29 ° C، وهو النمط الظاهري العمر في الأنسجة المعوية يمكن بالفعل لوحظ بعد 15 يوما 5. وعلاوة على ذلك، ذبابة الفاكهة غير قابلة لعدد كبير من التلاعب الجيني. على وجه الخصوص، برزت المعي المتوسط ​​ذبابة الفاكهة كنظام نموذجا ممتازا لدراسة تأثير مسارات الإشارات المختلفة والتحديات البيئية علىبيولوجيا الخلايا الجذعية المعوية (ISCS) أثناء الشيخوخة (استعراضها في 6-10). ظهارة الأمعاء ذبابة الفاكهة لديها نسبة دوران عالية، وجددت كل أسبوعين في الإناث وعن مرة واحدة في الشهر في الذكور 11. ISCS المقيمين في المعي المتوسط ​​ذبابة الفاكهة لديها القدرة على الانقسام وإنتاج ISC-متجدد النفس وخلية السلف ما بعد الإنقسامية يسمى enteroblast (EB) 12،13. وEB يفرق في إما خلية معوية الاستيعابية أو خلية enteroendocrine إفرازية. لهذا التاريخ، والجمع علامة الوحيدة التي تصف بشكل لا لبس فيه لتكاليف الدعم غير المباشر هو تعبير عن نزهة عامل النسخ (ESG) ويجند الشق دلتا (DL) 14. ومع ذلك، وهذا ينطبق على القناة الهضمية من الشباب والأصحاء فقط. أثناء الشيخوخة، يتميز ظهارة المعي المتوسط ​​زيادة في انتشار ISC 15-17. بالإضافة إلى ذلك، يشير الشاذة الشق يعطل قرار مصير الخلايا الوليدة ISCويدفع misdifferentiation من EBS 15. وهذا يؤدي إلى تراكم الخلايا التي تنشط لإشارات الشق وشارك في التعبير عن ESG ودل، مما جعل دل التعبير غير كافية لتحديد بحسن نية الخلايا الجذعية في المعي المتوسط ​​العمر. صعوبة في تحديد ISCS الحقيقية قد أعاق القدرة على دراسة التغيرات المحلية في ISCS الشيخوخة حتى الآن. لقد تناولت هذه القضية من خلال الاستفادة من ESG -Gal4، UAS-GFP خط الطيران المعدلة وراثيا في أي مستوى من التعبير GFP في ISCS وEBS مختلفة بطبيعتها ويبقى مختلف أنحاء الشيخوخة. وقد وصفت نهج مماثل لعزل neuroblasts اليرقات والخلايا العصبية 18،19. تم تشريح Midguts من الشباب وESG -Gal4 القديمة، الذباب، UAS GFP وفصلها إلى خلايا واحدة. ثم تم فرز الخلايا لخلايا GFP إيجابية باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS). ومن المثير للاهتمام، وفرز GFP إيجابية جells موزعة على اثنين من قمم مختلفة تعتمد على كثافة GFP مضان (GFP عالية ومنخفضة GFP). وعلاوة على ذلك، فإن توزيع الخلايا GFP إيجابية في اثنين من القمم المترابطة أيضا مع حجم الخلية: كانت الخلايا التي عرضت منخفضة الكثافة GFP صغير وكانت أقل الحبيبية في حين أن الخلايا مع كثافة عالية GFP أكبر وأكثر الحبيبية. وتشير هذه الملاحظة أن ISCS أصغر يمكن تمييزها عن EBS أكبر باستخدام FACS على أساس كثافة GFP واختيار المناسب مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) الإعدادات. يثير الاهتمام والفضول، ظلت قمم اثنين من فصل واضح أثناء الشيخوخة. وعلاوة على ذلك، تغيرت نسبة من قمم اثنين في الطريقة التي يعكس بصمات المذكورة أعلاه midguts الشيخوخة: وهي أن عدد كبير، misdifferentiated زيادات EBS مع مرور الوقت. من هذه النتائج فإننا نستنتج أنه من خلال الفرز للخلايا GFP إيجابية باستخدام إعدادات المعلمة FACS المناسبة يمكننا إثراء لISCS وEBS في أي وقت نقطة دخلال شهر الشيخوخة. وخلاصة القول، ونحن نقدم استراتيجية FACS التي تمكن الباحثين لإثراء لمدة السكان الخلية مختلفة، ISCS وEBS، من midguts ذبابة الفاكهة في أي عمر وعزل هذه الخلايا لمزيد من التحليل، مثل الجيل القادم التسلسل. يسمح هذا سيلة قوية لدراسة الآليات الجزيئية الذاتية التي هي ملازمة لالشيخوخة في سكان المخصب من الخلايا الجذعية أو السلف. فإن البيانات التي تم الحصول عليها من هذه الدراسات تسهيل مما لا شك فيه تحديد جزيئات المحفوظة والتي تكون مهمة في الشيخوخة عبر الأنواع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="677">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:105px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:197px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Forceps: Dumont, Inox Biologie #5</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:104px;">11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">SefarNitex 03-150um/38 (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td style="width:105px;">Sefar</td>
			<td style="width:104px;">3A03-0150-102-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Polymax 1040</td>
			<td style="width:105px;">Heidolph</td>
			<td style="width:104px;">543-42210-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">0.5% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:105px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:104px;">15400-054</td>
			<td>Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry</td>
			<td style="width:105px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">S34857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td style="width:105px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">AM7023</td>
			<td>&#160;other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">FACSAria II cell sorter</td>
			<td style="width:105px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>Turn on one hour prior to sorting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

للحصول بين 50،000-100،000 الخلايا من FAC الفرز، بين 160 و 200 midguts تحتاج إلى تشريح. ومن الواضح أن هذا هو الأكثر تستغرق وقتا طويلا خطوة من الإجراء بأكمله. الرسوم المتحركة هو مبين في الشكل 1A يوضح الخطوات الرئيسية لتشريح امعاء، والتي وصفها بالتفصيل في بروتوكول المقدمة هنا. هذا الإجراء يمكن تعديلها بشكل فردي. ويرد تشريح والجهاز الهضمى كله في الشكل 1B. عندما تكون كافة الأنسجة المعي المتوسط ​​تم هضمها، والاستمرار على الفور مع FAC الفرز. بعد استراتيجية النابضة موضح في البروتوكول يسمح لتحديد نجاح والفرز من السكان الخلية المخصب لISCS وEBS من الشباب (الشكل 2) ومن midguts القديمة (الشكل 3). يتم تعيين بوابة P1 لتشمل الخلايا السليمة الحية وفقط لبوابة الخروج الخلايا الميتة. الخلايا التي رسم فوق 10 3 على وغاريتمي Y-الفأسوعند استخدام قناة الأزرق المحيط الهادئ والذي يعرف بأنه الخلايا الميتة. ويستثنى من النقاط التي مؤامرة أقل من 40 على محور س (FSC-A) هي في معظمها الحطام وبالتالي أيضا (الشكل 2A). في المؤامرة مبعثر من SSC-A مقابل FSC-A ويتم توزيع الخلايا على أساس حجمها وتحبب. للحصول على قرار الأمثل، ويتم وضع الخلايا في مؤامرة مبعثر كما هو مبين في الشكل 2B عن طريق ضبط أنبوب مضخم (PMT) الجهد. في المؤامرات مبعثر FSC-H مقابل FSC-W وSSC-H مقابل SSC-W يتم فصل الخلايا واحد من وحدات العمل والحلل على أساس حجم (الشكل 2C) وبناء على تحبب (الشكل 2D). عندما تصور الخلايا المدرجة في بوابة P4 في مؤامرة الرسم البياني، وفصل واضح للGFP سلبية، GFP منخفض (بوابة P5) وعالية (بوابة P6) خلايا GFP غير مرئية (الشكل 2E). الخلايا العارضة أقل كثافة GFP صغيرة وأقل الحبيبية وتمثل ISCS. الخلايا العارضة العالي GFP كثافة العملياتensity تكون أكبر وأكثر تفصيلا وتمثل EBS. عكس الناسخ (RT) -PCR لدل على كدنا] توليفها من RNA من خلايا كل السكان GFP إيجابية (بوابات P5، P6) كشفت أن إشارة دل هي في الواقع أقوى في الخلايا منخفضة GFP أصغر مما كانت عليه في أكبر، GFP عالية الخلايا (الشكل 2H). الخلايا ثم تم backgated وصفت في المؤامرات كفاف للتأكد من أن GFP منخفض (بوابة P5) وGFP عالية (بوابة P6) الخلايا تختلف من حيث الحجم وتحبب (الشكل 2F) ومازالت على قيد الحياة (الشكل 2G). وتجدر الإشارة، يمكن أن اثنين من قمم GFP إيجابية الخلايا (منخفض GFP وGFP عالية) يكون فقط حاليا بشكل جيد إذا تم معايرة FITC (GFP) قناة باستخدام صحيح الضوابط المبينة في البروتوكول. استخدمت استراتيجية النابضة نفسها عندما يكون الترتيب ISCS المستمدة من الشجاعة القديمة (الشكل 3). المؤامرات مبعثر (شملت رقمالبريد 3A-D)، والرسم البياني (الشكل 3E) والمؤامرات كفاف (الشكل 3F، G) هي مشابهة لتلك التي هو موضح في الشكل (2). وكما ذكر أعلاه، وليس هناك علامة حسنة النية لتحديد ISCS في midguts القديمة، وبالتالي لم يتم تقديم البيانات RT-PCR هنا. ومع ذلك، فإن الملاحظة المثيرة للاهتمام هنا هو أن قمم اثنين تحتوي على GFP منخفض (بوابة P5) أو عالية (بوابة P6) خلايا GFP مفصولين بوضوح أثناء الشيخوخة. وعلاوة على ذلك، فإن عدد الخلايا في عالية (بوابة P6) ذروة GFP يزيد بشكل ملحوظ خلال الشيخوخة، والذي يحاكي بشكل واضح تراكم معروفة من EBS misdifferentiated مع التقدم في السن. ويمكن أيضا أن ينظر إلى التغير في نسبة السكان الخلية اثنين في المؤامرات مبعثر (قارن الشكل 3A-D مع الشكل 2A-D) والمؤامرات كفاف (قارن الشكل 3F، G مع الشكل 2F، G). من هذه النتائج فإننا نستنتج أنه من خلال فرز لGFPخلايا -positive باستخدام FACS نحن يمكن أن تثري لISCS وEBS في midguts الصغار والكبار. للتحقق من صحة نقاء ISCS معزولة وEBS، تم إجراء تحليل نوع آخر (الشكل 4). المؤامرات الرسم البياني للISCS وEBS بعد فرز (الشكل 4B، C) تصور درجات نقاء تتراوح بين 95٪ و 98٪. إذا تم اتباع التسلسل الهرمي للتعيين المعلمات FACS على النحو المبين أعلاه بدقة، وهما السكان خلية مختلفة (GFP منخفضة، وصغيرة وGFP عالية، وأكبر) يمكن بالفعل تمييز في مؤامرة مبعثر GFP مقابل FSC-A (الشكل 5A). هؤلاء السكان الخلية اثنين لا يمكن تمييزها إذا تم تجاهل هذا التسلسل الهرمي (الشكل 5B-D). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig1highres.jpg" /> الشكل (1): (A) والتخطيطي من الخطوات الرئيسية لديسcting الأمعاء الطاير. أولا، يتم إزالة الرأس (إزالة أجنحة اختيارية)، يليه الفصل بين الصدر والبطن لفضح القناة الهضمية. يتم تحرير القناة الهضمية في وقت لاحق من تجويف الجسم في الخطوات التالية. وتبين الأسهم السوداء تطور تشريح، في حين أن السهام الحمراء الداكنة تدل على الاتجاه سحب. الخطوط الحمراء في الصورة الأخيرة تشير إلى الأمامية والخلفية حدود المعي المتوسط. (B) صورة المجهر الخفيفة من الأمعاء ذبابة الكبار. وصفت المناطق الرئيسية والميزات التشريحية. خطوط حمراء علامة حدود المعي المتوسط. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig2highres.jpg" /> ويسلط الضوء FAC فرز استراتيجية لتحديد وعزل ISCS وEBS من الشباب (7 أيام) midguts لأفضل تصور، والخلايا التي تمثل ISCS باللون الأحمر وأبرزت خلايا تمثل EBS: الرقم 2.باللون الأزرق في المؤامرات مبعثر (AD) والمؤامرات كفاف (F، G). ومن المقرر (A) بوابة P1 لاستبعاد الخلايا الميتة Sytox إيجابية تآمر فوق 10 3 على وغاريتمي المحور ص. يتم تعيين عتبة FSC-A في 40 أيضا لاستبعاد الخلايا الميتة والحطام. وبوابات (B) خلايا لFSC-A وSSC-A لتحديد الخلايا وفقا لحجم وتحبب (بوابة P2). تم استخدام مؤامرة الرسم البياني (E) بالتوازي مع تحديد الخلايا GFP إيجابي في FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة مبعثر (B). (C، D) والمؤامرات مبعثر FSC-H مقابل FSC-W و SSC-H مقابل SSC-W تعمل على إزالة الركام والحلل وحدد لفانلات (بوابة P3 في C وبوابة P4 في D). (E) معارض المؤامرة الرسم البياني عدد الخلايا وكثافة GFP بهم. اثنين من القمم، GFP منخفض (بوابة P5) وGFP عالية (بوابة P6) يمكن تمييزها. (F، G) خلايا وبوابات العودة في مؤامرة كفاف للتحقق من أن الخلايا GFP إيجابية متميزة اثنين populatالأيونات هي من الحجم الصحيح (F) وتحتوي على الخلايا الحية (G). (H) الناسخ العكسي (RT) -PCR لدل على كدنا] توليفها من RNA معزولة عن الخلايا الموجودة في الذروة الأولى (بوابة P5) وفي الذروة الثانية (بوابة P6)، على التوالي. يمكن أن يتم الكشف عن المزيد من التعبير DL في الخلايا الموجودة في البوابة P5 مقابل بوابة P6. خدم تويولين كعنصر تحكم التحميل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig3highres.jpg" /> الشكل 3: FAC فرز استراتيجية لتحديد وعزل ISCS وEBS من العمر (60 يوما) midguts لأفضل تصور، ويسلط الضوء على الخلايا التي تمثل ISCS باللون الأحمر وأبرز خلايا تمثل EBS باللون الأزرق في المؤامرات مبعثر (AD) وفي. المؤامرات كفاف (F، G). (A) يتم تعيين بوابة P1 لاستبعاد الخلايا الميتة Sytox إيجابية تآمر فوق 10 3 على وغاريتمي المحور ص. يتم تعيين عتبة FSC-A في 40 أيضا لاستبعاد الخلايا الميتة والحطام. من المذكرة، والزيادة التي تعتمد على العمر في الخلايا GFP إيجابية الأكبر هي بالفعل واضحة في هذه المؤامرة. تم بوابات (B) خلايا لFSC-A وSSC-A لتحديد الخلايا وفقا لحجم وتحبب (بوابة P2). تم استخدام مؤامرة الرسم البياني (E) بالتوازي مع تحديد الخلايا GFP إيجابي في FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة مبعثر (B). (C، D) والمؤامرات مبعثر FSC-H مقابل FSC-W و SSC-H مقابل SSC-W تعمل على إزالة الركام والحلل وحدد لفانلات (بوابة P3 في C وبوابة P4 في D). (E) معارض المؤامرة الرسم البياني عدد الخلايا وكثافة GFP بهم. اثنين من القمم، GFP منخفض (بوابة P5) وGFP عالية (بوابة P6) يمكن تمييزها. من المذكرة، وارتفاع خلية GFP السكان تحتوي على خلايا أكبر زاد طوكان عدد ن خلال الشيخوخة. (F، G) خلايا بوابات العودة في مؤامرة كفاف للتحقق من أن اثنين من السكان الخلية متميزة GFP إيجابية هم من الحجم الصحيح (F) وتحتوي على الخلايا الحية (G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig4highres.jpg" /> كانت أجري تحليل آخر لتحديد نوع نقاء ISCS معزولة وEBS خلايا (A) GFP إيجابية من الشباب (7 أيام) وعمره (60 يوما) midguts FAC فرزها وتظهر المؤامرات الرسم البياني توزيعها: الشكل 4. في قمتين على أساس كثافة GFP. (B) يوضح تحليل آخر نوع نقاء ISCS معزولة من midguts الصغار والكبار وهو&gt; 97٪. (C) تحليل آخر نوع من فرزها Eبكالوريوس من midguts الصغار والكبار يظهر نقاء&gt; 95٪. الشوائب طفيفة قد تنجم عن تبريد مضان أو التالفة ميكانيكيا GFP معربا عن الخلايا التي تسببها إعادة الفرز الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig5highres.jpg" /> الشكل 5: أمثلة من المؤامرات مبعثر التي تظهر البيانات FACS دون المستوى الأمثل، الذي ينظر إليه عندما يتم تعيين المعلمات FACS بشكل صحيح (A) لمحة الممثل FACS من كل الخلايا عندما تم تعيين معلمات FACS بشكل صحيح على أساس الضوابط المبينة في البروتوكول. وحلقت السكان الخلية التي تحتوي ISCS باللون الأحمر وحلقت السكان الخلية التي تحتوي EBS باللون الأزرق. الخلايا دائري باللون الأخضر هي الخلايا الميتة التي لديها تألق ذاتي أقوى مقارنةالخلايا الحية، والتي يتم رسم أقل من 10 3 على وغاريتمي المحور ص. (B) مؤامرة مبعثر تصور نتيجة نموذجية تم الحصول عليها عندما لم يكن معايرة الصك FACS. لم يتم اكتشاف خلايا GFP إيجابية. (C) إذا لم يتم تعيين FSC بشكل صحيح، لا يتم الكشف عن مختلف السكان الخلية GFP إيجابية. (D) إذا لم يتم ضبط FITC (GFP) القناة بشكل صحيح، فإن غالبية GFP- خلايا الإيجابية التي يمكن فرزها لا يتم رسم في المؤامرة مبعثر بل على طول الحافة العليا من هذه المؤامرة. أيضا، في المؤامرة هو موضح هنا، لم يكن تعديل الحد الأقصى لتألق ذاتي، وبالتالي الخلايا التي مؤامرة فوق 10 2 على المحور Y-لوغاريتمي هي autofluorescent في الواقع، ويمكن أن يكون مخطئا كما GFP إيجابية الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging at JoVE.com

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

عزل الخلايا الجذعية المعوية من الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; Midguts بواسطة FACS لدراسة سلوك الخلية الجذعية خلال الشيخوخة

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

isolating-intestinal-stem-cells-from-adult-drosophila-midguts-facs-to

Research

JoVE Journal

Biology

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

19.9K Views.  Universität Ulm. Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging. 

Video: Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Adult stem cells have long been discussed in regards to their application in regenerative medicine. Adult stem cells have generated a great deal of excitement for treating injured and diseased tissues due to their impressive capabilities to undergo multi-lineage cell differentiation and their self-renewal ability. Most importantly, these qualities have made them advantageous for use in autologous cell transplantation therapies. The current protocol will introduce the readers to the modified preplate technique where soft tissues of the musculoskeletal system, e.g. tendon and muscle, are 1st enzymatically dissociated and then placed in collagen coated flasks with medium. The supernatant, which is composed of medium and the remaining floating cells, is serially transferred daily to new flasks. The stem cells are the slowest to adhere to the flasks which is usually takes 5-7 days (serial transfers or preplates) . By using this technique, adult stem cells present in these tissues can be easily harvested through fairly non-invasive procedures.

Isolating adult stem cells from musculoskeletal soft tissues based on the cell's adherence speed to flask.

عزل الخلايا الجذعية من أنسجة العظام والعضلات الناعمة

Adult stem cells have long been discussed in regards to their application in regenerative medicine. Adult stem cells have generated a great deal of ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...