Name: isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging
Uploaded: 2014-12-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging at JoVE.com

We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut f&#252;r Molekulare und Zellul&#228;re Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).

NOTA: Se il protocollo viene utilizzato per la prima volta a isolare CSI da FAC di smistamento, i seguenti controlli sono obbligatori al fine di impostare inizialmente i parametri FACS correttamente: le cellule dissociate da wild type (es w 1118) midguts Drosophila senza Sytox. Cellule dissociate da wild type (es w 1118) midguts Drosophila con Sytox (vedi punto 3.6). Cellule dissociato dal midguts della linea fly UAS-GFP ESG -Gal4 senza Sytox. 1. preparazione di soluzioni e piatti per Gut Dissection <ol><li> Preparare 4-6 flaconcini contenenti ciascuno 40 femminile vola da ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP. </li><li> Da una soluzione 10x PBS, preparare 500 ml 1x PBS (1,8 mm NaH 2 PO 4 · H 2 O, 8.4 mM Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 175 mM NaCl, regolare il pH a 7,4). </li><li> Preparare un 3,5Soluzione% agarosio in PBS 1x (3,5 g di agarosio grado elettroforesi in 100 ml PBS 1x). Preparare piatti dissezione versando questa soluzione in capsule di Petri (diametro 8,5 centimetri) per coprire il fondo. Lo strato di agarosio impedisce di danneggiare le punte della pinza durante la procedura di dissezione. Dopo che il gel è solidificato memorizzare le piastre di dissezione a 4 ° C. </li><li> Preparare 300 ml di PBS 1x + 1% BSA freschi prima dissezione e posizionare la bottiglia su ghiaccio oppure a 4 ° C. </li><li> Accendere centrifuga e lasciarlo raffreddare a 4 ° C. </li><li> Fiamma le punte dei 2 pipette Pasteur in vetro per lisciare i bordi. </li><li> Pulire due paia di pinze e una lama di rasoio con il 70% di etanolo. </li><li> Mettere da quattro a sei da 1,5 ml microprovette per la raccolta midguts sezionati sul ghiaccio. </li></ol> 2. Preparazione del tratto gastrointestinale e la dissezione del midgut <ol><li> Anestetizzare le mosche da un flaconcino (40 mosche) con CO 2 in un letto volo normale, decapitare tuttomosche usando una lama di rasoio e trasferirli al piatto dissezione. Versare fredda soluzione / 1% BSA PBS 1x nel piatto dissezione a coprire il gel di agarosio. Le mosche galleggia. </li><li> Prendete al volo addome con un paio di pinze, tenendo il torace con l&#39;altra coppia di pinze. Separare il torace dall&#39;addome. L&#39;intestino sarà visibile e la foregut / raccolto sarà molto probabilmente ancora collegato al torace. </li><li> Afferra l&#39;intestino ed estrarlo del torace. Per aprire l&#39;intestino, afferrare il raccolto e tirare l&#39;intestino leggermente anteriormente fuori dall&#39;addome. </li><li> Afferrare l&#39;estremità posteriore dell&#39;addome con una coppia di pinze e il bordo della cuticola aperta anteriormente con l&#39;altra coppia di pinze. Fare attenzione a non distruggere il tessuto intestinale sporgenti. Tirare l&#39;estremità posteriore via per rompere la cuticola e continuare a tirare posteriormente molto delicatamente finché l&#39;intero intestino è stato tirato fuori dalla cavità addominale. Il raccolto potrebbe dover essere rimosso in anticipo se è troppo grande per essereattraverso la cavità del corpo. </li><li> Rimuovere la foregut, tubuli malpighiani, hindgut e ovaie lasciando il midgut nudo. </li><li> Utilizzando un vetro pipetta Pasteur, trasferire il lotto di midguts sezionati in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente freddo soluzione BSA 1x PBS / 1% e mantenere il tubo in ghiaccio. I campioni devono essere trattati entro 2 ore. </li><li> Dopo la dissezione di un intero lotto è completa, lavare il piatto dissezione con acqua bidistillata a lavare sinistra sopra i detriti. Avviare sezionare il prossimo gruppo di midguts (ripetere i passaggi 2,1-2,7). Sezionare tante partite possibili entro 2 ore, quindi procedere al passo 3.1. </li></ol> 3. La digestione del Tissue Gut a Celle di raccolta per FAC Ordinamento <ol><li> Rimuovere la soluzione BSA / 1% 1x PBS dai midguts e aggiungere 500 ml di 0,5% soluzione di tripsina-EDTA per ogni campione. </li><li> Vortex bene per 20 sec e incubare i campioni dolce dondolio / rotante a 20 rpm a temperatura ambiente per 25-30 min. </li><li> Vortex nuovamente dopo circa 30 min e lascia intatta lavello tessuto midgut al fondo della provetta. Rimuovere delicatamente le cellule che sono in sospensione con una fiammata Pasteur pipetta di vetro e filtrare attraverso un nylon 35 micron rete in un nuovo 1,5 ml provetta. </li><li> Spin le cellule giù a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C. Da notare, quando si avvia il digest, un pellet di cellule potrebbe non essere visibile in un primo momento, ma sarà visibile come il tessuto digest progredisce. <ol><li> Trasferire accuratamente la soluzione tripsina torna alla provetta campione originale contenente il rimanente tessuto midgut intatto. Evitare il trasferimento troppe cellule dal pellet. </li><li> Delicatamente risospendere il pellet cellulare in 400 ml di freddo 1x PBS / BSA 1%. Tenere le provette da microcentrifuga contenenti le cellule dissociate su ghiaccio e coprire le provette con foglio di alluminio per proteggere le cellule dalla luce. </li><li> Vortex la soluzione tripsina contenente ancora il restante tessuto midgut intatta e posizionare i campionisul bilanciere per altri 30 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Ripetere i passaggi da 3.3 a 3.4.3 fino a quando tutti i tessuti dell&#39;intestino è stato digerito. Unire le cellule dissociate da tutti i tubi microcentrifuga in una provetta. Ciò può richiedere una fase di centrifugazione come in 3.4, in quanto il volume di tutte le sospensioni cellulari combinate possono superare 1,5 ml. Mantenere la sospensione cellulare su ghiaccio e proteggere le cellule dalla luce. </li><li> Spin le cellule dissociate giù a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere accuratamente la maggior quantità di surnatante possibile lasciando circa 50-100 ml di soluzione di BSA 1x PBS / 1% in provetta. Risospendere delicatamente le cellule dissociate in 800 microlitri 1x PBS / BSA 1% contenente Sytox (1: 20.000). </li><li> Trasferire la sospensione cellulare a 5 ml tubo Falcon rotondo fondo filtrando le cellule attraverso un cappuccio filtro cella (maglia di nylon 35 micron). Tenere sempre campioni di cellule su ghiaccio e al riparo dalla luce. Le cellule sono ora pronti peressere ordinati. </li><li> Pipettare 600 ml di soluzione di RNAlater in ogni provetta in cui le cellule verranno ordinati per successivo isolamento di RNA. Per altre applicazioni a valle le cellule possono essere raccolte in una soluzione diversa, ad esempio in PBS sterile. </li></ol> 4. FAC Ordinamento per isolare le cellule staminali intestinali <ol><li> Accendere lo strumento citometria di flusso almeno un&#39;ora prima di smistamento. Assicurarsi che il sistema di fluidica è privo di bolle d&#39;aria. </li><li> Scegli le dimensioni dell&#39;ugello 70 micron per iniettare le cellule nel flusso del liquido guaina. </li><li> Regolare l&#39;ampiezza della corrente di fluido principale in modo che il valore della distanza corrispondente al valore di riferimento (6-7, quando si utilizza l&#39;ugello 70 micron). Lasciate che il flusso del fluido nucleo stabilizzi prima di iniziare a ordinare. </li><li> Seguire questo ordine quando l&#39;impostazione iniziale dei parametri per l&#39;ordinamento: <ol><li> Caricare le cellule dissociate ottenute da tipo budella selvatici. In primo luogo, regolare le tensioni FSC e SSCper tracciare le cellule al centro del grafico a dispersione. In secondo luogo, regolare la FITC (GFP) tensione in modo che tutte le cellule sono tracciati inferiore a 10 2 sul logaritmico asse x. L&#39;impostazione del parametro CIC fissa il limite per autofluorescenza. </li><li> Caricare le cellule dissociate ottenute da tipo budella selvatici con Sytox aggiunto. Regolare il valore di Pacific Blue di tensione e porta a identificare e cellule soggiorno indipendente dai morti, cellule Sytox-positivi in ​​Blue Pacific vs FSC un diagramma a dispersione. </li><li> Caricare le cellule dissociate ottenute dalla ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP senza Sytox e regolare la tensione di FITC per garantire che tutte le cellule GFP-positive sono tracciati all&#39;interno del diagramma a dispersione. </li></ol></li><li> Caricare le cellule dissociate ottenute dalla ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP con Sytox aggiunto. Regolare il valore di Pacific Blue di tensione e porta a identificare e cellule soggiorni separati dai morti, cellule Sytox-positive (porta P1). <ol><li> Impostare la SSC-A e FSC Un cancello per identificare il GFPcellule positive (basati sulla trama istogramma) come determinato dalla dimensione e granularità (cancello P2). </li><li> Impostare la porta FSC-H e FSC-W per identificare ed escludere doppiette di cellule GFP-positive in base alla loro dimensione (cancello P3). </li><li> Impostare la SSC-H e la porta SSC-W per identificare ed escludere doppiette di cellule GFP-positive in base alla loro granularità (cancello P4). </li><li> Utilizzare cancello P4 per rappresentare le cellule GFP-positive in una trama istogramma che mostra il numero di cellule (contare) vs. intensità GFP. Due picchi distinti di cellule GFP-positive saranno visibili. Creare una porta per ogni picco (cancelli P5 e P6). Porta P5 contiene la popolazione di cellule che si arricchisce di CSI e possono essere ordinati separatamente dalle cellule nel cancello P6. </li><li> Back-porta in una trama di contorno per verificare che le due popolazioni GFP-positive distinte cellule contengono cellule viventi (confrontare con cancello P1) e le cellule del formato corretto (confrontare con cancello P2). </li></ol></li><li> Ordina le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 600 &amp; #181; l di soluzione RNAlater. La selezione è effettuata ad una velocità di flusso bassa (max. 2,0, 70 micron ugello, 1.000 eventi / sec, 70 psi) e impiegando un bidirezionale purezza sorta. </li><li> Dopo l&#39;ordinamento è completa, vortice immediatamente le cellule ordinati brevemente e mantenere i tubi microcentrifuga su ghiaccio fino procedere con l&#39;isolamento di RNA o altre applicazioni a valle. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Il protocollo presentato descrive un metodo per isolare ISC da giovani e meno giovani adulti midguts Drosophila, che possono poi essere utilizzati per ulteriori analisi molecolari come sequenziamento di nuova generazione. FAC ordinamento della popolazione di cellule GFP-positive dalla ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP è già stato raggiunto da diversi gruppi 21,22. Tuttavia, fino ad ora la presenza dei due picchi distinti di cellule GFP-positive è stata sia trascurato o sottovalutato. Abbiamo dimostrato che questa separazione non rappresenta solo due diverse popolazioni di tipi di cellule (ISC e EBS), ma anche che i due picchi di cellule GFP-positive rimanere nettamente distinto durante l&#39;invecchiamento. Questa osservazione è molto importante e prezioso per i ricercatori interessati allo studio delle cellule staminali o progenitrici durante l&#39;invecchiamento. Isolamento di ISC da vecchi midguts è stata ostacolata dal fatto che non vi è nessuna combinazione marcatore molecolare per identificare i CSI in un midgut invecchiato. L&#39;unico indicatore che uidentifica nambiguously ISC in un vecchio midgut è fosfo-histone3 (PH3), dal momento che ISC sono le cellule solo dividono nel midgut 12,13. Tuttavia, PH3 è un indicatore idoneo per isolare ISCs poiché il numero di divisione delle cellule staminali in qualsiasi dato punto di tempo è troppo bassa per ottenere una discreta quantità di CSI per analisi successive. La ESG linea di volo -Gal4, UAS-GFP è la linea di volo più comuni utilizzati dai ricercatori che studiano ISC funzione, la manutenzione e la differenziazione. La nostra conoscenza attuale sulla regolazione molecolare di CSI omeostasi è basata su studi in cui sono stati manipolati specifiche molecole e vie di segnalazione (valutata in 7). Quindi, ci manca ancora la conoscenza dei cambiamenti molecolari endogeni che si verificano durante l&#39;invecchiamento. Il metodo qui descritto chiude questa lacuna e si basa sul fatto che CSI può essere isolato base alle loro dimensioni, granularità e GFP intensità da midguts adulti in qualsiasi punto nel tempo durante l&#39;invecchiamento. Mentrestabilire e ottimizzare questo metodo abbiamo trovato le seguenti operazioni per essere critico per un risultato affidabile. Circa 200 viscere devono essere sezionato al fine di ottenere una buona quantità di CSI per FAC smistamento. La velocità di dissezione è fondamentale e dipende dalla pratica dell&#39;individuo. Un individuo addestrato può sezionare 40 budella entro 20-30 min. Poiché GFP si esprime anche nei tubuli malpighiani nel ESG -Gal4, UAS-GFP linea di volo, è indispensabile rimuovere completamente i tubuli malpighiani dal midgut. I midguts sezionati devono essere conservati in un ambiente fresco per evitare il degrado del tessuto e ridurre l&#39;attività RNAse nel tessuto. Pertanto, i midguts sezionati devono essere trasferiti dal piatto dissezione in microprovette contenenti freddo soluzione / 1% BSA 1x PBS dopo un massimo di 20-30 minuti e tenuti in ghiaccio. Tuttavia, i midguts sezionato non dovrebbero essere lasciati sul ghiaccio per più di 2 ore prima di iniziare la dissociazione di tessuto con tripsina. Il più efficiapproccio ent è quello di analizzare il maggior numero di partite di mosche possibili entro questi 2 ore, quindi avviare la tripsina digerire per questi lotti. Se sono necessarie più midguts, possono essere sezionati durante i tempi di incubazione della tripsina digest. Sebbene tripsina è un enzima molto potente e potrebbe avere effetti negativi sulle cellule, abbiamo ancora ottenuto abbastanza vita, le cellule sane per il successivo smistamento FAC. La fase chiave del nostro procedimento che permette l&#39;isolamento di cellule intatte è che le cellule dissociate sono rimossi dalla soluzione di tripsina ogni 30 min. Se le midguts sezionati sono incubate per 2 ½ ore in una soluzione di tripsina contenente a temperatura ambiente, abbiamo osservato un aumento del 20-30% in celle Sytox-positive morti. Va sottolineato che la soluzione tripsina usiamo contiene EDTA. La presenza di EDTA probabilmente facilita disgregazione del tessuto da chelanti ioni calcio e magnesio necessari per il corretto funzionamento delle molecole della matrice extracellulare. </p&gt; I passi più importanti per specie con successo ISC da giovani e vecchi coraggio sono le impostazioni iniziali appropriate dei FACS ed i parametri di gating utilizzando i comandi descritti e seguenti una gerarchia di ordinamento specifico. Abbiamo eseguito la FAC l&#39;ordinamento su un II Citofluorimetro ARIA (software FACSDiva). È importante che lo strumento sia acceso almeno un&#39;ora prima di smistamento per riscaldare i laser. Da segnalare, quando viene eseguito FAC ordinamento del CSI per la prima volta, i parametri per la selezione e per necessità di compensazione da impostare utilizzando i controlli di cui sopra: (1) le cellule dissociate da wild type (es w 1118) midguts Drosophila senza aggiunta di Sytox - impostazione di questo parametro (Step 4.4.1) impedisce l&#39;ordinamento delle cellule in base alla loro autofluorescenza; (2) dissociato da cellule wild type (es w 1118) midguts Drosophila con Sytox aggiunto - impostazione di questo parametro(Step 4.4.2) permette di separare morto da cellule viventi (le cellule morte hanno un elevato autofluorescenza e possono contaminare le cellule GFP-positive ordinati); (3) dissociato cellule dal midguts della ESG -Gal4, linea di volo UAS-GFP senza Sytox - impostare questo parametro (Step 4.4.3) assicura che tutte le cellule GFP-positive sono tracciati all&#39;interno del diagramma a dispersione. Se questi parametri non sono impostati correttamente, la popolazione cellulare ordinata, molto probabilmente conterrà le cellule morte e detriti (Figura 5B, C), molte cellule GFP-positive verranno perse (Figura 5D) e le due picchi distinti per cellule GFP-positive come visto nella trama istogramma (Figura 2E e Figura 3E) non vengono rilevati. Una volta impostati i parametri FACS e gating, lo strumento è calibrato e pronto per ordinare cellule dal ESG -GAL4, linea di volo UAS-GFP. Dal momento che questi parametri possono essere salvati, tutti i futuri ordinamento sessioni per CSI e EBs dalla ESG -GAL4, UAS-Linea di volo GFP può iniziare dal punto 4.5. Sebbene scegliendo la modalità &quot;Purezza&quot; ed effettuando una purezza bidirezionale sorta diminuisce il numero di cellule filtrate, consente una maggiore stringenza classificare (Passo 4.6 e Figura 4B, C). Da notare, il vantaggio di utilizzare Sytox invece di ioduro di propidio etichettare cellule morte è che c&#39;è solo una bassa straripamento nel canale FITC (GFP), che lo rende facile per compensare la ricaduta. Il nostro metodo di arricchimento per CSI e EBS, rispettivamente, si basa su ordinamento delle celle in base ai diversi livelli di espressione GFP. Può darsi che durante l&#39;invecchiamento la misdifferentiated EBs anche esprimere GFP a un livello più basso e potrebbe essere scambiato come CSI. Tuttavia, poiché le cellule ordinati differiscono per dimensioni e granularità, riteniamo che la nostra strategia di ordinamento è il più adatto a questa data per arricchire per ISC ed EBS. Inoltre, è noto che le cellule in un midgut invecchiamento ritegno ISC identità hanno un piccolo nucleo 15. Per ottenere maggiore chiarezza sull&#39;identità delle cellule ordinati, si poteva ordinare cellule da una linea transgenica mosca che porta esg -GAL4, UAS-GFP e un segnale di Notch giornalista transgene. Poiché Notch ha dimostrato di essere attivo solo nelle EBs 12,13, ISCs isolato da un giovane midgut sarebbe negativo per il reporter Notch, mentre i EBs sarebbe positivo per il reporter Notch. Tuttavia, durante l&#39;invecchiamento diventa segnale di Notch aberranti nel tessuto midgut. Pertanto, deve essere testato se questo set up sperimentale è davvero più affidabile per distinguere tra CSI e EBs isolato da un vecchio midgut. Abbiamo già impiegato questo approccio per l&#39;analisi del trascrittoma comparativa dei CSI da giovani e vecchi midguts e ha individuato una serie di fattori che sono regolati in modo differenziale durante l&#39;invecchiamento (unpub. Osservati.). Inoltre, questo metodo consente di analizzare le differenze di espressione genica tra CSI e EBS. Tale indagines fornirà comprensione dei cambiamenti molecolari iniziali che si verificano in una cellula entra nel processo di differenziazione. Inoltre, l&#39;isolamento di EBs durante l&#39;invecchiamento e le successive analisi farà luce sui cambiamenti molecolari di misdifferentiation età indotta. Inoltre, questo metodo può essere combinato con altri strumenti genetici utilizzati in Drosophila per studiare la funzione del gene. In sintesi, questo metodo offre un approccio imparziale per indagare le caratteristiche molecolari e cambiamenti di ISC ed EBS durante l&#39;invecchiamento. Si tratta di un prezioso strumento che faciliterà l&#39;esplorazione di invecchiamento meccanismi nelle cellule staminali e progenitrici adulte.

Una conseguenza inevitabile di invecchiare è la capacità decrescente di tessuti e organi a funzionare. Le cellule staminali adulte sono essenziali per mantenere l&#39;omeostasi dei tessuti e la funzionalità degli organi, ma come organismi di età, le cellule staminali anche sperimentare un calo della loro comportamento biologico. Ciò è particolarmente dannoso per tessuti che hanno un alto tasso di turnover, quali l&#39;epitelio intestinale. Caratteristiche di cellule staminali di età includono danni genomico, i meccanismi di riparazione deteriorate, regolazione del ciclo cellulare alterata e vie di segnalazione misregulated, tutti che influenzano il comportamento delle cellule staminali normali (rivisto in 1-3). Manipolando vie di segnalazione specifici o abbattere geni specifici, abbiamo acquisito conoscenze del loro ruolo nella regolazione e il mantenimento di un comportamento normale di cellule staminali. Dal momento che la maggior parte di questi esperimenti sono approcci molecola candidati, abbiamo pochissime informazioni circa i cambiamenti molecolari endogeni che si verificano nelle cellule staminali duranteinvecchiamento. Un modo per affrontare questo problema è quello di confrontare il trascrittoma di giovane rispetto a cellule staminali vecchie di identificare molecole il cui profilo di espressione cambia in modo significativo durante l&#39;invecchiamento. Purtroppo, problemi biologici e tecnici hanno ostacolato il nostro progresso per quanto riguarda questo approccio finora. Drosophila melanogaster è un organismo modello molto adatto per lo studio dell&#39;invecchiamento in quanto ha una vita breve (circa 60-70 giorni) e mostre fenotipi di invecchiamento (rivisto in 4). Inoltre, il processo di invecchiamento in Drosophila può essere accelerato dalla temperatura. Quando mantenendo in linea a 29 ° C, un fenotipo invecchiato nel tessuto intestinale può già essere osservato dopo 15 giorni 5. Inoltre, Drosophila è suscettibile per una pletora di manipolazioni genetiche. In particolare, il midgut Drosophila è emersa come un ottimo sistema modello per studiare l&#39;influenza di diverse vie di segnalazione e le sfide ambientalila biologia delle cellule staminali intestinali (CSI) durante l&#39;invecchiamento (rivisto in 6-10). L&#39;epitelio intestinale Drosophila ha un alto tasso di fatturato e si rinnova ogni due settimane nelle femmine e circa una volta al mese nei maschi 11. ISC residente nel midgut Drosophila ha la capacità di dividersi e produrre un ISC auto-rinnovata e una cellula progenitrice post-mitotico chiamato enteroblast (EB) 12,13. L&#39;EB differenzia in due un enterociti assorbente o una cella enteroendocrine secretoria. A questa data, l&#39;unica combinazione marcatore che le etichette in modo inequivocabile un ISC è l&#39;espressione del fattore di trascrizione escargot (ESG) e il ligando Notch Delta (Dl) 14. Tuttavia, questo vale per un giovane e sano intestino solo. Durante l&#39;invecchiamento, l&#39;epitelio midgut è caratterizzata da un aumento della proliferazione ISC 15-17. Inoltre, Notch aberranti sconvolge la decisione destino delle cellule figlie ISCe induce misdifferentiation di EBs 15. Ciò si traduce in un accumulo di cellule che sono attivi per la segnalazione Notch e co-express ESG e Dl, rendendo così espressione Dl insufficiente per identificare in buona fede le cellule staminali in un midgut invecchiato. La difficoltà di identificare i veri CSI ha impedito la possibilità di esaminare i cambiamenti endogeni in CSI invecchiamento fino ad ora. Abbiamo affrontato questo problema sfruttando la ESG -Gal4, UAS-GFP linea fly transgenici in cui il livello di espressione GFP in CSI e EBS è intrinsecamente diversa e resta diverso per tutta l&#39;invecchiamento. Un approccio simile è stato descritto per l&#39;isolamento di neuroblasti larvali e neuroni 18,19. Midguts di giovani e vecchi ESG -Gal4, mosche UAS-GFP sono stati sezionati e dissociate in singole cellule. Le cellule sono state poi ordinati per la cellule GFP-positive utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS). È interessante notare che l&#39;ordinato GFP-positive cells distribuiti in due picchi distinti sulla base dell&#39;intensità di fluorescenza GFP (GFP alti e bassi GFP). Inoltre, la distribuzione delle cellule GFP-positive nei due picchi anche correlati con dimensioni delle cellule: le cellule che mostravano bassa intensità GFP erano piccole e meno granulare che cellule con alta intensità GFP erano più grandi e più granulare. Questa osservazione ha suggerito che i CSI più piccole potrebbero essere distinti dai EBs di grandi dimensioni tramite FACS basati sull&#39;intensità GFP e scegliendo scatter appropriata in avanti (FSC) e le impostazioni di side scatter (SSC). Curiosamente, i due picchi sono rimasti nettamente separati durante l&#39;invecchiamento. Inoltre, il rapporto tra i due picchi modificata in modo da riflettere le caratteristiche di cui sopra di midguts invecchiamento: vale a dire che il numero di grandi dimensioni, misdifferentiated EBS aumenta nel tempo. Da questi risultati possiamo concludere che di classificare per le cellule GFP-positive utilizzando le impostazioni dei parametri FACS appropriate possiamo arricchire per CSI e EBs in qualsiasi punto temporale durante invecchiamento. In sintesi, si introduce una strategia di FACS che permette ai ricercatori di arricchire di due diverse popolazioni cellulari, CSI ed EBS, dalla Drosophila midguts di ogni età e isolare queste cellule per ulteriori analisi, come sequenziamento di nuova generazione. Questo metodo permette potente per lo studio dei meccanismi molecolari endogeni che sono inerenti all&#39;invecchiamento in una popolazione arricchito di cellule staminali o progenitrici. I dati ottenuti da questi studi saranno sicuramente facilitare l&#39;identificazione di molecole conservate che sono significativi per l&#39;invecchiamento tra le specie.

<table><tbody><tr><td>Forceps: Dumont, Inox Biologie #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>SefarNitex 03-150um/38 (35 &amp;micro;m nylon mesh)</td><td>Sefar</td><td>3A03-0150-102-00</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Polymax 1040</td><td>Heidolph</td><td>543-42210-00</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.</td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>Life Technologies</td><td>AM7023</td><td>Other solutions, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Trizol can be used for subsequent RNA isolation</td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Turn on one hour prior to sorting</td></tr></tbody></table>

isolating intestinal stem cells from adult drosophila midguts by facs to study stem cell behavior during aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Per ottenere tra 50.000-100.000 cellule da FAC ordinamento, tra 160 e 200 midguts devono essere sezionato. Ovviamente questo è il più tempo passo dell&#39;intera procedura. Il cartone mostrata in figura 1A illustra le fasi principali di budello dissezione, che sono descritti in dettaglio nel protocollo qui fornite. Questa procedura può essere modificata singolarmente. Un sezionato, tutto il tratto gastrointestinale è mostrato nella Figura 1B. Quando tutto il tessuto midgut è stato digerito, continua immediatamente con FAC smistamento. Seguendo la strategia di gating descritto nel protocollo consente l&#39;identificazione di successo e smistamento di una popolazione di cellule arricchito per CSI e EBs da giovane (Figura 2) e da vecchie midguts (Figura 3). Il cancello P1 è impostato per includere solo le cellule viventi sane e per escludere le cellule morte. Le cellule che tracciare sopra 10 3 sulla logaritmica y-axquando si utilizza il canale Pacific Blue sono definiti come cellule morte. I punti che trama sotto 40 sul asse x (FSC-A) sono per lo più detriti e quindi sono esclusi anche (Figura 2A). Nel grafico a dispersione di SSC-A vs FSC-A le cellule sono distribuiti in base alla loro dimensione e granularità. Per una risoluzione ottimale, le cellule sono posti nel diagramma di dispersione, come illustrato in Figura 2B regolando la tensione del tubo fotomoltiplicatore (PMT). Nei grafici a dispersione FSC-H vs. FSC-W e SSC-H e SSC-W singole cellule sono separate da aggregati e doppietti base alle dimensioni (Figura 2C) e sulla base di granularità (Figura 2D). Quando raffigurante le cellule contenute in porta P4 in una trama istogramma, la netta separazione di GFP-negativo, GFP basso (porta P5) e (cancello P6) cellule GFP alta è visibile (Figura 2E). Le cellule che presentano intensità GFP inferiore sono piccole e meno granulare e rappresentano CSI. Le cellule che presentano maggiore int GFPensità sono più grandi e più granulare e rappresentano EBs. Trascrittasi inversa (RT) -PCR per Dl su cDNA sintetizzato da RNA delle cellule di ogni popolazione GFP-positive (cancelli P5, P6) ha rivelato che il segnale Dl è davvero più forte nei più piccoli, GFP bassi cellule che nel più ampio, GFP alta cellule (Figura 2H). Le cellule sono state poi backgated e rappresentati in grafici di contorno per confermare che le cellule GFP basso (porta P5) e GFP alto (porta P6) differiscono per dimensioni e granularità (Figura 2F) e sono ancora vivi (Figura 2G). Di nota, i due picchi di cellule GFP-positive (GFP bassa e alta GFP) possono essere ben distinti solo se il (GFP) canale FITC è stato calibrato correttamente utilizzando i comandi descritti nel protocollo. La stessa strategia di gating è stato utilizzato durante l&#39;ordinamento CSI derivati ​​da vecchi budella (Figura 3). I grafici a dispersione (Figure 3A-D), l&#39;istogramma (Figura 3E) e le curve di livello (Figura 3F, G) sono analoghi a quelli mostrati in figura 2. Come accennato sopra, non vi è alcun marcatore buona fede identificare ISCs in vecchi midguts e quindi nessun dato RT-PCR è presentato qui. Tuttavia, l&#39;osservazione interessante è che i due picchi contenenti GFP basso (porta P5) o (P6) di gate cellule GFP elevati rimangono nettamente separati durante l&#39;invecchiamento. Inoltre, il numero di cellule in alta (gate P6) picco GFP aumenta significativamente durante l&#39;invecchiamento, che emula chiaramente l&#39;accumulo noto di EBs misdifferentiated con l&#39;età. La variazione del rapporto tra le due popolazioni cellulari può essere visto anche nelle trame dispersione (confrontare Figura 3A-D con la Figura 2A-D) e nei grafici di contorno (confronta figura 3F, G alla figura 2F, G). Da questi risultati possiamo concludere che di classificare per GFPcellule -positive utilizzando FACS si possono arricchire di ISC e EBs in giovani e vecchi midguts. Per convalidare la purezza della ISC isolata e EBs, un&#39;analisi post ordinamento è stato eseguito (Figura 4). Le trame istogramma del post-ordinati ISC ed EBS (Figura 4B, C) ​​raffigurano purezza tra il 95% e il 98%. Se la gerarchia di impostare i parametri FACS come sopra descritto è strettamente seguito, le due popolazioni cellulari differenti (GFP bassa, piccola e GFP alto, più grande) possono già essere distinte in un grafico a dispersione GFP vs. FSC-A (Figura 5A). Queste due popolazioni di cellule non si distinguono se questa gerarchia viene ignorata (Figura 5B-D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig1highres.jpg" /> Figura 1: (A) Uno schema delle fasi principali di Disseamen la mosca intestino. Innanzitutto, la testa viene rimossa (la rimozione delle ali è opzionale) seguito da una separazione del torace e dell&#39;addome per esporre l&#39;intestino. L&#39;intestino viene successivamente liberato dalla cavità del corpo nelle seguenti fasi. Le frecce nere indicano la progressione della dissezione, mentre le frecce rosse scure indicano la direzione di estrazione. Le linee rosse nella ultima immagine indicano anteriore e posteriore confini del midgut. (B) A immagine luce del microscopio della mosca adulta dell&#39;intestino. Le principali regioni e caratteristiche anatomiche sono etichettati. Le linee rosse segnano i confini del midgut. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig2highres.jpg" /> Figura 2:. FAC ordinamento strategia per identificare e isolare ISC e EBs da giovani (7 giorni) midguts Per una migliore visualizzazione, le cellule che rappresentano CSI sono evidenziate in rosso e le cellule che rappresentano EBs sono evidenziatein blu nel diagrammi di dispersione (AD) e nei grafici di contorno (F, G). (A) Il cancello P1 è impostato per escludere cellule morte, Sytox-positivi tracciate sopra 10 3 sul y logaritmico. La soglia del FSC-A è fissato a 40 per escludere anche le cellule morte e detriti. (B) Le cellule sono state gated per FSC-A e SSC-A per selezionare le celle in base alle dimensioni e granularità (cancello P2). La trama istogramma (E) è stato utilizzato in parallelo per identificare le cellule GFP-positive in FSC-A vs SSC-A grafico a dispersione (B). (C, D) I grafici a dispersione FSC-H vs. FSC-W e SSC-H e SSC-W servono per rimuovere aggregati e doppietti e selezionare per singlets (porta P3 in C e cancello P4 in D). (E) La trama istogramma mostra il numero di cellule e la loro intensità GFP. Due picchi, GFP basso (porta P5) e GFP alto (porta P6) possono essere distinti. (F, G) Le cellule sono state back-gated in una trama di contorno per verificare che le due cellule GFP-positive distinto populationi sono di dimensioni corrette (F) e contengono cellule viventi (G). (H) Reverse Transcriptase (RT) per -PCR Dl su cDNA sintetizzato da RNA isolato dalle cellule presenti nel primo picco (porta P5) e nel secondo picco (cancello P6), rispettivamente. Più espressione Dl potrebbe essere rilevato in cellule presenti in porta P5 P6 vs cancello. Tubulina servito come controllo di caricamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig3highres.jpg" /> Figura 3: FAC ordinamento strategia per identificare e isolare ISC e EBs dal vecchio (60 giorni) midguts Per una migliore visualizzazione, le cellule che rappresentano CSI sono evidenziate in rosso e le cellule che rappresentano EBs sono evidenziate in blu nei grafici a dispersione (AD) e in. grafici di contorno (F, G). (A) Il cancello P1 è impostato per escludere cellule morte, Sytox-positivi tracciate sopra 10 3 sul y logaritmico. La soglia del FSC-A è fissato a 40 per escludere anche le cellule morte e detriti. Da segnalare, l&#39;aumento di età-dipendente in cellule GFP-positive più grandi è già evidente in questa trama. (B) Le cellule sono state gated per FSC-A e SSC-A per selezionare le celle in base alle dimensioni e granularità (cancello P2). La trama istogramma (E) è stato utilizzato in parallelo per identificare le cellule GFP-positive in FSC-A vs SSC-A grafico a dispersione (B). (C, D) I grafici a dispersione FSC-H vs. FSC-W e SSC-H e SSC-W servono per rimuovere aggregati e doppietti e selezionare per singlets (porta P3 in C e cancello P4 in D). (E) La trama istogramma mostra il numero di cellule e la loro intensità GFP. Due picchi, GFP basso (porta P5) e GFP alto (porta P6) possono essere distinti. Da segnalare, l&#39;alta cellula popolazione GFP contenenti celle più grandi è aumentato in numero durante l&#39;invecchiamento. (F, G) le cellule sono state back-gated in una trama di contorno per verificare che le due popolazioni GFP-positive distinte cellule sono di dimensioni corrette (F) e contengono cellule viventi (G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig4highres.jpg" /> Figura 4:. Una analisi post sorta è stata eseguita per determinare la purezza della ISC isolata e EBs cellule (A) GFP-positivi dai giovani (7 giorni) e di età (60 giorni) midguts erano FAC allineati e le trame degli istogrammi mostrano la distribuzione in due picchi sulla base dell&#39;intensità GFP. (B) L&#39;analisi post sorta dimostra la purezza dei CSI isolati da giovani e meno giovani midguts che è&gt; 97%. (C) L&#39;analisi post sorta di ordinata EB da giovani e meno giovani midguts mostra una purezza&gt; 95%. Le lievi impurità possono derivare da fluorescenza tempra o cellule GFP esprimere danneggiate meccanicamente causati dalla ri-ordinare le cellule. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52223/52223fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52223/52223fig5highres.jpg" /> Figura 5: Esempi di grafici a dispersione che mostrano dati FACS non ottimali, che si vede quando i parametri FACS non sono stati fissati correttamente (A) profilo Rappresentante FACS di tutte le cellule, quando i parametri FACS sono stati impostati correttamente sulla base dei controlli descritti nel protocollo.. La popolazione di cellule contenenti CSI è cerchiata in rosso e la popolazione cellulare contenente EBS è cerchiata in blu. Le cellule cerchiate in verde sono le cellule morte che hanno una autofluorescenza forte rispetto alcellule viventi, che sono tracciate sotto 10 3 on y logaritmico. (B) Il diagramma a dispersione raffigura un tipico risultato ottenuto quando lo strumento FACS non è stata calibrata. Non vengono rilevati cellule GFP-positive. (C) Se la FSC non è impostato correttamente, le diverse popolazioni di cellule GFP-positive non vengono rilevati. (D) Se la (GFP) canale FITC non è regolato correttamente, la maggior parte di GFP cellule positive da ordinare non tracciata nel diagramma di dispersione, ma piuttosto lungo il bordo superiore della trama. Inoltre, nel grafico riportato qui, il limite per autofluorescenza non era regolata, quindi cellule che trama superiore a 10 2 sul y asse logaritmiche sono in realtà autofluorescenti e potrebbe essere scambiato come cellule GFP-positive.

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Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

Isolare cellule staminali intestinali da adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Midguts di FACS per Studiare Stem Cell Comportamento durante l&#39;invecchiamento

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...

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Research

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Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

20.2K Views.  Universität Ulm. Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging. 

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of individual cell populations often makes it difficult to obtain enough material for molecular studies. For example, the accessory gland of the Drosophila male reproductive system contains two distinct secretory cell types. The main cells make up 96% of the secretory cells of the gland, while the secondary cells (SC) make up the remaining 4% of cells (about 80 cells per male). Although both cell types produce important components of the seminal fluid, only a few genes are known to be specific to the SCs. The rarity of SCs has, thus far, hindered transcriptomic analysis study of this important cell type. Here, a method is presented that allows for the purification of SCs for RNA extraction and sequencing. The protocol consists in first dissecting glands from flies expressing a SC-specific GFP reporter and then subjecting these glands to protease digestion and mechanical dissociation to obtain individual cells. Following these steps, individual, living, GFP-marked cells are sorted using a fluorescent activated cell sorter (FACS) for RNA purification. This procedure yields SC-specific RNAs from ~40 males per condition for downstream RT-qPCR and/or RNA sequencing in the course of one day. The rapidity and simplicity of the procedure allows for the transcriptomes of many different flies, from different genotypes or environmental conditions, to be determined in a short period of time.

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Here, we present a protocol to dissociate and sort a specific cell population from the Drosophila male accessory glands (secondary cells) for RNA sequencing and RT-qPCR. Cell isolation is accomplished through FACS purification of GFP-expressing secondary cells after a multistep-dissociation process requiring dissection, proteases digestion and mechanical dispersion.

Un protocollo basato su FACS per isolare l'RNA dalle cellule secondarie delle ghiandole accessorie maschili della Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Genetica

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Biologia dello sviluppo

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Imaging e analisi dell'orientamento dei tessuti e delle dinamiche di crescita nell'epiteliale della Drosophila in via di sviluppo durante le fasi pupali

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissezione e colorazione di Drosophila Larvali ovaie

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Biologia

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex vivo Cultura della Drosophila pupa testicolo e singolo maschio cisti germinale: Dissezione, Imaging, e trattamento farmacologico

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

Stimolare e analizzare la neurogenesi adulta nel cervello centrale della Drosophila

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

Isolare cellule staminali intestinali da adulti

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