المؤلفون ممتنون كثيرا من السيدة هاى يينغ بان والسيد إيان Bellayr لما قدموه من مساعدة تقنية على عزل خلية للأفلام الحالي ، والسيد كايل هولدن والسيد جوناثان لوكاس لمساعدتهم على تحرير الشريحة. جزيل الشكر إلى القائمة التالية للأشخاص الذين تورطوا مع تطور التقنيات preplate تعديل على مدى السنوات الماضية : الدكاترة. برهان غرايبة ، تساو BaoHong ، بريدجيت Deasy ، توماس باين R. ، لو اى بينغ ، Hairong بنغ ، هيديكي أوشيما ، بو تسنغ شياو دونغ مو ، Kimimasa Tobita رون يانكوفسكي ، Makato Ikezawa. نحن ممتنون للمساعدة التقنية من جيمس H. الكمون ، Pruchnic ريان ، Feduska جوزيف ، ريبيكا Schugar جيم ، وعموم هاى يينغ وTebbets جيسيكا. المؤلف كما يود أن نعترف بالدعم المالي لهذا العمل من رابطة الضمور العضلي (MDA) ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، وزارة الدفاع (DOD) ، مستشفى الأطفال في بيتسبرغ من UPMC ، وإدارة جراحة العظام ، وجامعة بيتسبرغ.

بشكل عام ، واستكمال إجراءات تعديل preplate يتطلب 1-2 أيام من التحضير ، 1 اسبوع من تنفيذ الإجراء التقني ، 2-3 أيام لتحديد هوية الخلية مع كيمياء سيتولوجية مناعية ، ومبلغا إضافيا 2-3 أسابيع من الخلايا الجذعية والتوسع السكاني. المعدات اللازمة لزراعة الخلايا الجذعية هي مماثلة لتلك التي من غيرها من النظم التي تشمل الثقافة الخلية مقعد العلوي الطرد المركزي ، حاضنة CO 2 ، رقائقي زراعة الأنسجة وغطاء تدفق مجهر مقلوب مجهزة مضان وكاميرا رقمية. الخلايا الجذعية المعزولة يمكن أيضا أن تكون مستنسخة ، ويمكن تخزينها على المدى الطويل في النيتروجين السائل ل1،2 الدراسات الحالية أو المستقبلية. يجب على جميع الكواشف والمواد المستخدمة لهذا الإجراء أن يكون عقيما والتعامل معها جو معقم و مطهر. الخطوة 1 : إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكولاجين الأطباق الثقافة معطف النسيج والقوارير : النوع الأول الكولاجين المستمدة من جلد العجل (0.1 غرام في 1 لتر ؛ سيغما الدريخ). وبلستيكور إلى معطف يشمل : T - 25 قوارير ، 6 أو 12 لوحات جيدة ، والأطباق (60 و 100 ملم ، BD فالكون) كما هو موضح قبل 1،2. يهز بلطف بلستيكور كل نصف ساعة ، لمدة 4 ساعات لضمان طلاء حتى من الكولاجين. ثم تتم إزالة الحل الكولاجين. وسمح بعد ذلك ليجف بلستيكور مغلفة في نسيج الثقافة هود مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية وغطاء محرك السيارة كل يوم ، لضمان العقم ، وأوجز في النهاية أو تغطيتها لاستخدامها لاحقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الخلية مستنبت : 400mL DMEM (DMEM والجلوكوز المرتفعة ؛ Invitrogen) ، 50mL الحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS ، Invitrogen) ، 50mL مصل الحصان (HS ، Invitrogen) ، و 5 مل استخراج الجنين الفرخ (أوروبا الوسطى والشرقية ؛ الدقيقة كيميكال ) سيتم تصفيتها باستخدام الفراغ المتاح 0.22 ميكرومتر ، 500 مل نظام تصفية العقيمة (كورنينج). وستضاف العقيمة البنسلين / حل الستربتوميسين (Invitrogen) وأخيرا 100 وحدة / مل. ويمكن تخزين الحلول التي يجري اعدادها في 4 درجات مئوية واحدة على الأقل شهريا. ويستخدم هذا الحل لفصل الخلايا من القارورة عند تقسيم الثقافات أو إعداد الخلايا للزرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاحماء حلول لعزل الخلية : والكواشف التالية تحتاج إلى أن تكون درجة حرارة تصل إلى 37 درجة قبل استخدامها لعزل الخلايا C : الحل هانك في سولت التخزين المؤقت (HBSS ، Invitrogen) 0.2 ٪ (وزن / المجلد) كولاجيناز من نوع الحادي عشر (سيغما الدريخ) ، بمتوسط ​​قدره 3200 وحدة الهضم الكولاجين في HBSS مل ؛ Dispase 2.4 units/1mL (Invitrogen) 0.5 ٪ (وزن / المجلد) التربسين (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم المعدات الجراحية في التحضير : تتطلب عملية جراحية معقمة الأدوات الجراحية بما في ذلك : مختلفة الحجم الملقط ، المقص الصغير ، مقص القزحية و / أو شفرات المشرط. بالإضافة إلى ذلك ، 15 و 50 مل من أنابيب البولي بروبلين الطرد المركزي دينار بحريني (فالكون) ؛ مصفاة الخلية (حجم المسام 70 م) دينار بحريني (فالكون) ؛ 18 -- ، 23 -- و 27 - قياس الإبر دينار بحريني (PrecisionGlide) ؛ و 10 -- أو 20 مل المحاقن المعقمة (دينار بحريني). </li></ol> الخطوة 2 : الخزعات النسيجية والعزلة والتفكك الميكانيكية 1-4 يتم تنفيذ خزعات الأنسجة تحت غطاء الثقافة معقمة ويتم الحصول عليها حديثا تشمل الأوتار والعضلات الهيكلية التي تحصد من عضلات الساق أو النعلية من hindlimb البرية من نوع الفئران (C57BL/6J أنثى ، 4-5 أسابيع من العمر أو أقل جاكسون ، المختبر). ثم تتم إزالة أي نوع من الأنسجة الضامة وضوحا ، والأوعية الدموية والأنسجة الدهنية من عينات الخزعة. ثم يتم أنسجة الأوتار والعضلات التي تم تحديدها بعناية تحت مجهر تشريح الجراحي للتخلص من بقايا الجلد والعظام وتوضع في طبق يحتوي على البارد (4 درجات مئوية) HBSS (تستكمل مع إضافة 5 ٪ من FBS). ثم يتم وضعها في الأنسجة المعزولة بشكل منفصل على الأطباق التي تحتوي على الكولاجين المغلفة HBSS الباردة وسيتم المفروم (&lt;1x1 مم 3) في الطين الخشنة باستخدام المقص الصغير و / أو شفرات المشرط. الخطوة 3 : الهضم الأنزيمية للأنسجة : النسيج المفروم ثم يتم فصلها إنزيمي من خلال سلسلة من الخطوات 2،4،5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عجائن الأنسجة في أنابيب مفروم 15 مل منفصلة وأجهزة الطرد المركزي في 3500 دورة في الدقيقة ~ في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ، ويغسل مع HBSS الطرد المركزي وكرر مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ، وهضم هذه عجائن بإضافة 10 مل من prewarmed كولاجيناز الحادي عشر من نوع 0.2 ٪ (سيغما). احتضان لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية في حين تعصف باستمرار بلطف الأنابيب. بدلا من ذلك ، يهز باليد كل 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي وهذه resuspend عجائن في dispase 10 مل (2.4 وحدة / مل ، Gibco) حل. احتضان لمدة 45 دقيقة عند درجة 37 ، مع اهتزاز اليدين أو الهزاز برفق كل 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي ، وإعادة تعليق هذه عجائن في 10 مل من محلول 0.2 ٪ HBSS التربسين. سوف الحضانة تختلف استنادا إلى أي مدى يتم الإفراج عن واحد من الخلايا والأنسجة التي يمكن القيام بها من خلال مراقبة وقف تحت المجهر. فمن لا ننصح أن تتجاوز 30 دقيقة في 37 مع أنابيب لعكس درجة مئوية أو الهزاز برفق كل 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلية الناتجةق ، وإعادة تعليق. الكرية خلية في 10 مل من انتشار الأسلحة النووية المتوسطة (AM) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل تعليق الخلية وذلك بتمرير استخراج من خلال سلسلة من الإبر. يتم تمرير الخلايا ثم 2 مرات خلال 18G ، ثم 23G ، وأخيرا إبرة 27G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير استخراج الخلايا من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. </li></ol> الخطوة 4 : Preplating لعزل السكان خلية مختلفة استنادا التصاق الخلية معدل 1-3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي وresuspend الكريات خلية في متوسطة الانتشار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلية مخاليط على قارورة T - 25 الكولاجين المغلفة (أو 60 طبق مم) ، وعلامة على أنها PP1. ينبغي التقيد بوقف الخلية كما تملك أعدادا كبيرة من نوى الانكسار وغيرها من الحطام تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية في ترطيب ، 5 ٪ CO 2 الحاضنة لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى nonadherent المغلفة الكولاجين الجديد T - 25 قارورة (أو 60 طبق مم) ، وكما هو العلامة PP2. إضافة 5 مل من PM في لوحة المسمى PP1. الخلايا المبكرة التي يعلقونها على التمسك القارورة هي في معظمها myofibroblasts 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرجاع القوارير إلى حاضنة لمدة 24 ساعة ، ونقل الخلايا إلى nonadherent المغلفة الكولاجين الجديد T - 25 قارورة (أو صحن) وعلامة على أنها PP3. إضافة 5 مل من انتشار الأسلحة النووية متوسطة في لوحة المسمى PP2. هذه الخلايا التي تعلق الانضمام إلى هذه القارورة هي في معظمها 2،3 الليفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى قوارير الحاضنة وكرر الإجراء في آخر 24 ساعة حتى يتم إنشاء PP6 السكان. الحفاظ على كل مجموعة من الخلايا مع وقف التنفيذ والسماح لهم تتكاثر وفحصها بانتظام باستخدام مجهر مقلوب. PP3 - PP4 معظمها myoblasts بينما غالبا ما ينظر إلى خلايا العضلات الأقمار الصناعية معظمها في PP5 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معظم الخلايا ببطء التمسك نعلق عادة PP6. في هذه المرحلة ، وتظهر الخلايا ، صغيرة مدورة ، انكسار الضوء وتندر جدا في عدد وتعتبر أن يكون عدد السكان 1،2 الخلية الجذعية. </li></ol> الخطوة 5 : تحديد وتوسيع الخلايا الجذعية المعزولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعزولة PP6 الخلايا هي قليلة جدا في العدد والحاجة إلى الحفاظ عليها في متوسطة FBS انتشار الغني (20 ٪ في DMEM FBS) التي يتم تغييرها يوميا. معظم هذه الخلايا موجودة في ثقافة الموت PP6 خلال الأسابيع التالية للزراعة 1-2 ، ولكن عادة ما يتم إنشاؤه ، وصحية كبيرة PP6 السكان بعد أسابيع 1-2 إضافية للتوسع. الخلايا الجذعية المعزولة من الفئران شديدة التعبير عن الخلية الجذعية مستضد 1 (Sca1) ، CD34 ، الكبد الجنين كيناز 1 (Flk1) ، وعلامات أخرى 1،2،6،7 الجذعية التي يمكن تصور عبر تلطيخ immunocytochemical. هذه الخلايا الجذعية أيضا يحمل قدرات متعددة التمايز 3،6،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتم المحافظة على الخلايا المعزولة وتوسعت في مناطق ذات كثافة منخفضة في خلية ثقافة (12 الأطباق جيدا في الخلايا 5-10 / جيد أو &lt;التقاء 20-30 ٪ في قارورة أو صحن) لتجنب 1،2 التمايز. عدد قليل جدا من الخلايا شكل الحيوانات المستنسخة خلال التوسع ، وهذه الخلايا الجذعية المستنسخة يمكن الخضوع لفترة طويلة الانتشار الوقت (الكمونية) لأي اختصاص دراسات أخرى. استنساخ الخلايا الجذعية يمكن أيضا تخزينها في النيتروجين السائل باستخدام الإجراءات العامة لتخزين الخلايا مثل المتوسطة PM DMSO مع 10 ٪. جعل عددا من الأرصدة في ممر منخفض من الخلايا الجذعية لأية دراسات أخرى احتياطية. </li></ol>

<ol>
	<li>Gharaibeh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique.">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).</li><li>Qu-Petersen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+population+of+muscle+stem+cells+in+mice:+potential+for+muscle+regeneration.">Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration.</a> J Cell Biol. 157, 851-864 (2002).</li><li>Li, Y. &. a. m. p. ;. a. m. p., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+muscle-derived+cells+into+myofibroblasts+in+injured+skeletal+muscle.">Differentiation of muscle-derived cells into myofibroblasts in injured skeletal muscle.</a> Am J Pathol. 161, 895-907 (2002).</li><li>Watt, D. J., Lambert, K., Morgan, J. E., Partridge, T. A. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+donor+muscle+precursor+cells+into+an+area+of+muscle+regeneration+in+the+host+mouse.">Incorporation of donor muscle precursor cells into an area of muscle regeneration in the host mouse.</a> J Neurol Sci. 57, 319-331 (1982).</li><li>Lu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myogenic+progenitor+populations+from+Pax7-deficient+skeletal+muscle+based+on+adhesion+characteristics.">Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics.</a> Gene Ther. 15, 1116-1125 (2008).</li><li>Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+isolation+of+muscle-derived+cells+capable+of+enhancing+muscle+regeneration+and+bone+healing.">Clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing.</a> J Cell Biol. 150, 1085-1100 (2000).</li><li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+receptors+in+the+maturation-dependent+adenoviral+transduction+of+myofibers.">The role of receptors in the maturation-dependent adenoviral transduction of myofibers.</a> Gene Ther. 8, 627-637 (2001).</li><li>Cao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+stem+cells+differentiate+into+haematopoietic+lineages+but+retain+myogenic+potential.">Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential.</a> Nat Cell Biol. 5, 640-646 (2003).</li><li>Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+based+on+muscle+stem+cells.">Regenerative medicine based on muscle stem cells.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 8, (2008).</li><li>Gates, C. B., Karthikeyan, T., Fu, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+for+the+musculoskeletal+system+based+on+muscle-derived+stem+cells.">Regenerative medicine for the musculoskeletal system based on muscle-derived stem cells.</a> J Am Acad Orthop Surg. 16, 68-76 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد تم الاعتراف بأن بعض أنسجة البالغين تحتوي على خلايا جذعية متعددة. على مدى السنوات القليلة الماضية من الدراسة ، وقد تم الكشف عن الخلايا الجذعية في الأنسجة العضلية الناعمة لل، بما في ذلك الهيكل العظمي والعضلات والأوتار. هذا البروتوكول الحالي تفاصيل إجراء ، والمعروفة باسم تقنية preplate المعدلة ، التي استخدمت بنجاح في المختبر لدينا لعزل الخلايا الجذعية من الأوتار والعضلات والهيكل العظمي. ويمكن باستخدام تقنية preplate تعديل الخلايا المذكورة أعلاه يمكن تقسيمها إلى عدة السكان على أساس الخصائص التصاق لقوارير الكولاجين المغلفة (الشكل 1). وmyofibroblasts الليفية الموجودة داخل أنسجة التقيد بسرعة إلى قوارير الكولاجين مغلفة في غضون 24-48 ساعة ، ويتم فصلها في البداية من الخلايا الأخرى في PP2 - PP1. خلايا مولدة للعضل أو البطانية التمسك قوارير الكولاجين المغلفة بعد فترة زمنية أطول ، في غضون 48-96 ساعة (PP3 - PP5) ، ويمكن حصاده والتي حددها علامات على سطح الخلية. وتعتبر الخلايا preplated في وقت لاحق ، أو 96 ساعة في وقت لاحق (PP6) ، والخلايا الجذعية للبالغين (الشكل 2). خلايا صغيرة تظهر في وقت متأخر preplate ، الجولة ، وشفافة في بداية عزلتهم ، ويمكن أن تتسم بمزيد من التدفق الخلوي أو كيمياء سيتولوجية مناعية للتعبير بها عن مستضد الخلايا الجذعية 1 (Sca1) ، CD34 ، الكبد الجنين كيناز 1 (Flk1) ، و علامات أخرى من الخلايا الجذعية (الشكل 3). الخلايا الجذعية المعزولة لديها القدرة على التجديد الذاتي والدراسات التجريبية أثبتت multipotency من خلال المفاضلة الخاصة بهم في الطبقات الجرثومية الثلاث : الأديم المتوسط ​​، الأديم الظاهر والأديم الباطن 9. وقد كشفت التحقيقات أيضا أن العديد من هذه الخلايا الجذعية إلى خلايا تفرق من سلالة الأديم المتوسط ​​بما في ذلك osteocytes ، الخلايا الشحمية ، غضروفية ، والخلايا المكونة للدم 6،8. وقد أظهرت دراسات أخرى أن الخلايا الجذعية البالغة في التفريق الأنساب الخلية الأديم الظاهر من خلال التعبير عنها من علامات العصبية والخلايا الدبقية وقدرتها على تحسين وظيفة أطرافهم بعد أن تم تلف الأعصاب الطرفية 10. كانت هذه الخلايا الجذعية البالغة معزول مفيدة لإصلاح الأنسجة العضلية وإصابة المريضة ، وأجريت دراسات أخرى ذات صلة في الجسم الحي على الأنسجة الأخرى بما في ذلك القلب والكبد والنخاع الشوكي ، وكذلك ظروف طبية معينة مثل مخاطية الأمعاء والمثانة صغيرة لعلاج سلس البول الإجهاد 9. <img src="/files/ftp_upload/2011/2011fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. <img src="/files/ftp_upload/2011/2011fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. <img src="/files/ftp_upload/2011/2011fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#11995-073</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#10437-028</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heat-inactivated horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#26050-088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chick embryo extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>#CE650T-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100U ml penicillin/streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hank&#x2019;s Buffered Salt Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#24020-117</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase type XI 0.2%(wt/vol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>#C7657</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase2.4U ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#17105-041</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA0.5%(wt/vol) (10x;5g liter trypsin (1:250)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>#15400-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagen for coating flask : Type I collagen derived from calf skin 0.1 g liter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>#C-9791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>#D-2650</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolating stem cells from soft musculoskeletal tissues

منذ فترة طويلة الخلايا الجذعية البالغة التي نوقشت في ما يخص تطبيقها في مجال الطب التجديدي. لقد ولدت الخلايا الجذعية للبالغين قدرا كبيرا من الإثارة لعلاج الجرحى والأنسجة المريضة بسبب قدراتها على الخضوع للإعجاب متعددة النسب تمايز الخلايا وقدرتها على التجدد الذاتي. الأهم من ذلك ، جعلت هذه الصفات من المفيد لهم لاستخدامها في علاجات ذاتي زرع الخلايا. والبروتوكول الحالي يعرض القراء إلى تقنية تعديل preplate حيث الأنسجة الرخوة في الجهاز الحركي ، مثل الأوتار والعضلات ، هي 1<sup&gt; ش</sup&gt; نأت إنزيمي ثم يوضع في قوارير الكولاجين المغلفة مع المتوسط. يتم نقل متسلسل وطاف ، والذي يتكون من المتوسط ​​والخلايا المتبقية العائمة ، يوميا لقوارير جديدة. الخلايا الجذعية هي الأبطأ التمسك القوارير التي عادة ما يستغرق 5-7 أيام (أو نقل المسلسل preplates). ويمكن باستخدام هذه التقنية ، والخلايا الجذعية البالغة الموجودة في هذه الأنسجة حصادها بسهولة من خلال إجراءات غير الغازية إلى حد ما.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues at JoVE.com

Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

عزل الخلايا الجذعية من الأنسجة العضلية الناعمة على أساس سرعة الانضمام إلى الخلية القارورة.

عزل الخلايا الجذعية من أنسجة العظام والعضلات الناعمة

Adult stem cells have long been discussed in regards to their application in regenerative medicine. Adult stem cells have generated a great deal of ...

isolating-stem-cells-from-soft-musculoskeletal-tissues

Google

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Views.  Stem Cell Research Center, Childrens Hospital of Pittsburgh of UPMC. عزل الخلايا الجذعية من الأنسجة العضلية الناعمة على أساس سرعة الانضمام إلى الخلية القارورة.

Video: Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

اشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

عزل الخلايا الجذعية من الإنسان Xenografts سرطان البنكرياس

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

عزل الخلايا الصباغية تشبه الأولية من القلب ماوس

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells&#8217; (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.

Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging

Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.

عزل الخلايا الجذعية المعوية من الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; Midguts بواسطة FACS لدراسة سلوك الخلية الجذعية خلال الشيخوخة

Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly ...