وأيد هذا العمل من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) المنح 191597، 299432 و324265، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث منحة كندا ديسكفري ومنحة برنامج العلوم الحدودي الإنسان إلى CRL. CRL غير محقق CIHR الجديد. ويدعم غيوم ديس من قبل زمالة PROTEO. ويدعم صموئيل روشيت التي كتبها NSERC وFRQNT المنح الدراسية.

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92, 291-294 (1998).</li><li>Diss, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+avenues+for+exploring+the+dynamics+and+evolution+of+protein+interaction+networks.">Integrative avenues for exploring the dynamics and evolution of protein interaction networks.</a> Curr Opin Biotechnol. 24, 775-783 (2013).</li><li>Vidal, M., Cusick, M. E., Barabasi, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactome+networks+and+human+disease.">Interactome networks and human disease.</a> Cell. 144, 986-998 (2011).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+functional+atlas+of+Escherichia+coli+encompassing+previously+uncharacterized+proteins.">Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins.</a> PLoS biology. 7, e96 (2009).</li><li>Arifuzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+identification+of+protein-protein+interaction+of+Escherichia+coli+K-12.">Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12.</a> Genome Res. 16, 686-691 (2006).</li><li>Rajagopala, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+binary+protein-protein+interaction+landscape+of+Escherichia+coli.">The binary protein-protein interaction landscape of Escherichia coli.</a> Nature biotechnology. 32, 285-290 (2014).</li><li>Arabidopsis-Interactome-Mapping-Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map.">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li><li>Babu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+landscape+of+membrane-protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Interaction landscape of membrane-protein complexes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 489, 585-589 (2012).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes.">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li><li>Tarassov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+map+of+the+yeast+protein+interactome.">An in vivo map of the yeast protein interactome.</a> Science. 320, 1465-1470 (2008).</li><li>Uetz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+analysis+of+protein-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 403, 623-627 (2000).</li><li>Guruharsha, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+complex+network+of+Drosophila+melanogaster.">A protein complex network of Drosophila melanogaster.</a> Cell. 147, 690-703 (2011).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+map+of+the+interactome+network+of+the+metazoan+C.+elegans.">A map of the interactome network of the metazoan C. elegans.</a> Science. 303, 540-543 (2004).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li><li>Landry, C. R., Levy, E. D., Abd Rabbo, D., Tarassov, K., Michnick, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+insight+from+noisy+cellular+networks.">Extracting insight from noisy cellular networks.</a> Cell. 155, 983-989 (2013).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Wodak, S. J., Vlasblom, J., Turinsky, A. L., Pu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interaction+networks:+the+puzzling+riches.">Protein-protein interaction networks: the puzzling riches.</a> Current opinion in structural biology. 23, 941-953 (2013).</li><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li><li>Dunham, W. H., Mullin, M., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-purification+coupled+to+mass+spectrometry:+basic+principles+and+strategies.">Affinity-purification coupled to mass spectrometry: basic principles and strategies.</a> Proteomics. 12, 1576-1590 (2012).</li><li>Michnick, S. W., Ear, P. H., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods Enzymol. 470, 335-368 (2010).</li><li>Rochette, S., Gagnon-Arsenault, I., Diss, G., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+yeast+protein+interactome+in+response+to+DNA+damage.">Modulation of the yeast protein interactome in response to DNA damage.</a> Journal of proteomics. 100, 25-36 (2014).</li><li>Diss, G., Dube, A. K., Boutin, J., Gagnon-Arsenault, I., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+for+the+genetic+dissection+of+protein+complexes+in+living+cells.">A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells.</a> Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).</li><li>Gagnon-Arsenault, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+divergence+plays+a+role+in+the+rewiring+of+protein+interaction+networks+after+gene+duplication.">Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication.</a> Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).</li><li>Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+assay+for+condition-dependent+changes+in+protein-protein+interactions.">Multiplex assay for condition-dependent changes in protein-protein interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9213-9218 (2012).</li><li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+PCA,+a+systematic+approach+for+identifying+genes+important+for+the+physical+interaction+between+protein+pairs.">Reverse PCA, a systematic approach for identifying genes important for the physical interaction between protein pairs.</a> PLoS Genet. 9, e1003838 (2013).</li><li>Freschi, L., Torres-Quiroz, F., Dube, A. K., Landry, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCA:+a+scalable+assay+to+measure+the+perturbation+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).</li><li>Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+domain-directed+reassembly+of+active+dihydrofolate+reductase+from+rationally+designed+fragments.">Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schuldiner, M., Collins, S. R., Weissman, J. S., Krogan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+epistatic+miniarray+profiles+(E-MAPs)+and+its+application+to+chromatin+functions.">Quantitative genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae using epistatic miniarray profiles (E-MAPs) and its application to chromatin functions.</a> Methods. 40, 344-352 (2006).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Wagih, O., Parts, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gitter:+A+Robust+and+Accurate+Method+for+Quantification+of+Colony+Sizes+From+Plate+Images.">gitter: A Robust and Accurate Method for Quantification of Colony Sizes From Plate Images.</a> G3 (Bethesda). 4 (3), 547-552 (2014).</li><li>Leducq, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+robustness+of+protein+complexes+to+inter-species+hybridization.">Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization.</a> PLoS Genet. 8, e1003161 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Stark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioGRID:+a+general+repository+for+interaction+datasets.">BioGRID: a general repository for interaction datasets.</a> Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).</li><li>Vinayagam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex-based+analysis+framework+for+high-throughput+data+sets.">Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets.</a> Science signaling. 6, rs5 (2013).</li><li>Jansen, R., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+function+on+a+genomic+scale:+the+importance+of+gold-standard+positives+and+negatives+for+network+prediction.">Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction.</a> Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li></ol>

تم دفع جزء من رسوم النشر مفتوحة الوصول لهذا المقال من قبل S &amp; P الروبوتات.

نحن تصف البروتوكول على أساس فحص DHFR-PCA تمكين تحديد منهجي لinteractors المادية لأي بروتين الطعم يعطى في الإنتاجية العالية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها عن طريق فحص لمزيد من الطعم، وهذا على أي مستوى المطلوب من النسخ المتماثل. ونحن لشرح موثوقية هذا البروتوكول من قبل تحديد الشركاء التفاعل الجسدي لبروتين الطعم المشاركة في مجمع المسام النووية: Nup82. تحليلنا تمكين للعثور على خمسة interactors عنها سابقا واحد غير المبلغ عنها سابقا interactor ل(أرقام 3F &amp; 3G)، وتسليط الضوء على قدرة طريقة لدراسة interactome بروتين الخميرة. بروتوكول الموصوفة هنا يتضمن العديد من الخطوات الهامة التي المجرب وينبغي الالتفات. ونحن نوصي ل1) تأكد من أن DHFR الطعم F [1،2] الانصهار هو الصحيح (الشكل 1B)؛ هذا يمكن تحقيقه من خلال تسلسل البناء وقياس آثافةجي تعبير البروتين الصحيح باستخدام مضاد للDHFR F [1،2] أو مكافحة DHFR F [3] الأجسام المضادة. 2) قبل بداية الشاشة، فمن المستحسن للتحقق إن وجدت الطعم من مصلحة المعارض التفاعلات منحل في شاشات PCA. ويمكن القيام بذلك عن طريق أداء شاشات التحكم مع الطعوم عبرت مع سيطرة L-DHFR المناسبة أو عن طريق التزاوج يدويا الطعم مع سيطرة L-DHFR المناسبة وإجراء فحص النمو في MTX المتوسطة. 3) ينبغي صب لوحات اليوم قبل استخدامها بحيث الرطوبة المثلى لتمسك الخلايا على سطح أجار أثناء عملية الطباعة. 4) لوحات المصدر لا ينبغي أن تستخدم أكثر من أربع مرات لنقل ما يكفي من الخلايا على لوحة الوجهة. زيادة عدد النسخ من لوحة جهة يمكن أن تقوم به خطوات متتالية من التوسع (على سبيل المثال 4 نسخ -&gt; 16 نسخ -&gt; 64 نسخة). بدلا من ذلك، والخلايا يمكن التقاطها في مواقع مختلفة على مروج أو في المستعمرة بين جولات مختلفة من تكرارها. 5) إذا كان عدة صositions مفقودة بعد اختيار مضاعفا (ق)، وتأكد من أن لوحات مصدر لم تستخدم في كثير من الأحيان في الخطوة التزاوج (الخطوات 4،5-4،7)؛ 6) التأكد من أن متوسط ​​MTX يحتوي على جميع المكونات الأساسية في تركيزات الصحيحة. في الواقع، إذا لوحظ أي نمو على الإطلاق على المدى المتوسط ​​MTX، يمكن أن يكون إما لأنه لا يوجد التفاعل هو للكشف عن طريق PCA للبروتينات في المصالح أو لأنه لم يتم إعداد المتوسطة MTX بشكل صحيح. للتأكد من أن يسمح المتوسطة نمو سلالات تظهر DHFR شظايا تكامل، ويمكن إضافة التفاعل التأسيسي في مواقع فارغة من جمع واستخدام مثل مراقبة إيجابية مثل DHFR-شظايا تنصهر ليسين الأنصاف سحاب 33 (الشكل 1C). سوف الاختبارات المتوازية باستخدام شظايا رابط-DHFR أو شظايا سحاب-رابط-DHFR تسمح للتمييز بين الشروط التي تسمح لجميع الخلايا لتنمو (تركيز منخفض MTX أو البروتين الطعم التي تميل إلى جعل تفاعلات إيجابية كاذبة، كما أن described أدناه)، والظروف التي تحول دون نمو جميع سلالات (المكون تركيز MTX عالية جدا أو أساسي مفقود في المتوسط)؛ 7) ونظرا إلى أن PCA يتم تنفيذ من خلال جولات متعاقبة من مكررات من وسط إلى آخر، قد يحدث التلوث العرضي بين سلالات بين لوحات مختلفة إذا، على سبيل المثال، لا يتم تعقيمها دبوس أداة بشكل صحيح بين جولات تكرار و / أو الماء الماضي حمام (محطة أي الرطب) في إجراء التعقيم ملوثة من قبل مستعمرات جولات النسخ السابقة. عدة مناصب على صفائف فارغة وبالتالي يمكن استخدامها كمواقع السيطرة حيث ينبغي مراعاة أي نمو للكشف عن التلوث عبر. لا يمكن أن يؤديها تحليل الصور باستخدام عدة برامج نشرت (انظر القسم 5 من البروتوكول) أو أي برنامج نصي مخصص. في هذه الدراسة، وسيناريو مخصص ينفذ الخطوات التالية: 1) السيناريو يطرح القيم بكسل لوحة فارغة إلى بكسل القيم من كل لوحة من أجل أن تشاركrrect عن التحيزات الإضاءة. 2) البرنامج النصي بتحويل كل صورة لتصحيح الخلفية لثنائي باستخدام عتبة قيمة بكسل 10. 3) لكل 1،536 مواقف كل لوحة، والتي تحددها تتراكب مستطيل على المستعمرات الحافة، والنصي يعمل يماغيج &quot;تحليل الجزيئات ... &quot;وظيفة في مجموعة دائرية. يتم تعيين اختيار دائرية نصف قطرها يساوي الفترة الفاصلة بين موقعين ناقص 10 بكسل. 4) السيناريو يختار أقرب الجسيمات من مركز التحديد ويؤكد على أنها مستعمرة إذا موقعها ليست أكثر من نصف الفترة الزمنية الفاصلة بين مستعمرتين بعيدا عن مركز التحديد. 5) ويقيس النصي القيم بكسل من الجسيمات المختارة على الصورة لتصحيح الخلفية. 6) لمزيد من تصحيح أي المتبقية التحيزات الإضاءة الخلفية، والسيناريو يطرح قيمة متوسط ​​من كل بكسل من الاختيار الدائرية التي لم تكن جزءا من الجسيمات إلى القيم بكسل للمستعمرة. مجموع هذه القيمة بكسل تصحيحالصورة، المخزنة في العمود &quot;IntDenBackSub&quot; من الجدول التكميلي 1، وتستخدم كمقياس لحجم مستعمرة. والخطوة الحاسمة في الجزء التحليل هو الخيار عتبة أهمية. هنا، اخترنا عتبة على أساس توزيع السلبي L-DHFR F [3] ضوابط، ولكن اعتمادا على الهدف من الشاشة، قد تكون هذه العتبة صارمة للغاية. في الواقع، L-DHFR F [3] overexpressed الضوابط (المروج TEF قوي) بحيث شظايا التكميلية قد عفويا يكمل كل منهما الآخر، وهذه هي بالتالي لا تمثل التعبير عن معظم البروتينات. ويبرز هذا من حقيقة أن توزيع L-DHFR F [3] ضوابط أعلى من متوسط ​​النمو الخلفية (الشكل 3D). وهكذا، وبعض التفاعلات وجود عشرات أدناه هذه العتبة صارمة ولكن هذا بشكل واضح خارج لتوزيع النمو الخلفية يمكن اعتبار الزيارات المفترضة التي قد تمثل، على سبيل المثال، بين عابرة أو ضعيفةالإجراءات. ويمكن مزيد من الدراسة والتحقق من صحتها عبر إذا، على سبيل المثال، لا يتم أعرب عن البروتينات اثنين على المستويات التي يمكن أن تسمح للتكامل عفوية من شظايا DHFR مثل الضوابط L-DHFR. وكبديل لذلك، يمكن للمرء أن وضع عتبة أهمية على أساس نسبة من التداخل مع interactors المادية التي أعلن عنها في قواعد البيانات مثل BioGRID 35 من أجل تعظيم نسبة الإيجابيات الحقيقية على ايجابيات كاذبة. ومع ذلك، خلافا للاستخدام توزيع L-DHFR، هذا البديل قد لا يكون دائما مجديا إذا، على سبيل المثال، فإن عدد interactors المادية المعروفة ليست عالية بما فيه الكفاية. وعلاوة على ذلك، فإن اختيار عتبة أهمية له تأثير على نسبة كاذبة ايجابيات وسلبيات كاذبة في مجموعة البيانات النهائي. في الواقع، مثل أي دولة أخرى فحص الكشف عن مؤشر أسعار المنتجين، ويمكن ايجابيات كاذبة تنجم عن تفاعل غير محدد من البروتين مع البروتين DHFR الانصهار إذا، على سبيل المثال، والبروتين وفيرة للغاية كما ذكر في وقت سابق. هذاويتضح من حقيقة أن بعض يفترس تتفاعل بشكل منتظم مع جميع البروتينات الطعم في شاشات PCA، وبالتالي تحتاج إلى إزالتها من تحليل 11 (على سبيل المثال Tef2 وAde17 والجدول التكميلي 2). للتحايل على هذه المشكلة، وشاشة تحكم PCA من المجموعتين ضد السيطرة L-DHFR المناسبة (F [1،2] أو F [3]) لتحديد الطعم ويفترس واظهار عفوية DHFR شظايا تكامل لا يمكن أن يؤديها في شروط محددة كل شاشة. وعلاوة على ذلك، إجراء تحليل لتخصيب جين علم الوجود يمكن أن تزيد من الثقة في البيانات إذا كان من المعروف وظيفة الطعم معين. من ناحية أخرى، يمكن أن DHFR-PCA تؤدي إلى السلبيات كاذبة لعدة أسباب: 1) ليس كل البروتينات يمكن أن تنصهر إلى شظايا DHFR لأن هذه قد زعزعة الاستقرار في البروتينات أو تعديل التعريب في حال، على سبيل المثال، والانصهار DHFR ل C-محطة يتداخل مع إشارة توطين. 2) إعادة DHFR في بعض الأجزاء الخلوية Mالمنعم يوسف لا تنتج حمض الفوليك إذا، على سبيل المثال، شرطا ضروريا لتخليق حمض الفوليك غير متوفر؛ 3) C مصطلحات حاجة إلى أن يكون على مسافة من 8 نانومتر لDHFR تكامل تحدث 11. وبالتالي، قد لا يتم الكشف عن تفاعل المعروفة إذا بهم C-مصطلحات ليست قريبة بما فيه الكفاية في الفضاء. ويتمثل هذا هنا من حقيقة أن جزءا كبيرا من التفاعلات الفيزيائية Nup82 التي أعلن عنها في قواعد البيانات، ومعظمها غير مباشرة، لم تكتشف في فحص لدينا. وبالمثل، فإن التفاعلات بين البروتينات الغشاء من أجلها C-مصطلحات هي في غير المشبعة نسبة إلى الغشاء لا يؤدي إلى DHFR شظايا تكامل ولن يتم الكشف عن 11. القيود 1) و 3) يمكن التحايل ببساطة نسبيا عن طريق دمج جزء DHFR إلى N-مصطلحات من البروتين. القيام بذلك قد يمنع التدخل في إشارة توطين بالقرب من C-مصطلحات وقد تسمح للكشف عن وجود تفاعل بين البروتينات الغشاء الذي N و C-محطة هي في قريب رابطة الدول المستقلةلغشاء. لا تزال العديد من التحديات في دراسة الصنوبر (استعراضها في 2،3). إلى حد كبير وصفت الخرائط من الدبابيس أنتجت حتى الآن في حالة تجريبية واحدة لكل نوع وبالتالي توفر لقطة واحدة من كيفية تنظيم شبكات البروتين. ولذا فإن هناك حاجة لاستكشاف ظروف تجريبية أخرى لنرى كيف يمكن إعادة تنظيم المسامير في استجابة للتغيرات البيئية، منبهات محددة، عبر تطوير أو الطفرات التالية. سيتم التغلب على هذه التحديات من خلال تطوير تقنيات جديدة لاستجواب مثبطات مضخة البروتون في الوقت الحقيقي، في الخلايا الحية والتكيف مع التقنيات الحالية بحيث يمكن استخدامها من قبل مجتمع أكبر من المختبرات. كأسلوب الكمية التي يمكن الكشف عن التغييرات في كمية DHFR تكامل المجمعات 27، DHFR-PCA يمكن تكييفها للتغلب على هذه التحديات واستخدمت لدراسة كيفية تأثر مثبطات مضخة البروتون من قبل DNA الإضرار الوكيل 22 </sup&gt;، العوامل الكيميائية 25، الحذف الجين 23،26 أو في أنواع الخميرة الأخرى والهجينة من 33. سوف استكشاف هذه الأبعاد الجديدة تصبح أكثر وأكثر أهمية للكشف عن ديناميكية PIN.

شبكات التفاعل البروتين (دبابيس) تقدم قرارا خريطة منخفضة من كيفية تنظيم البروتينات وظيفيا في الخلية 1. كل اتصال فعلي بين اثنين من البروتينات، أو تفاعل البروتين البروتين (PPI)، قد تمثل الجمعية التي هي مستقرة في الوقت المناسب، مثل تلك التي وجدت داخل المجمعات البروتين والتي تساهم في التنظيم الهيكلي للخلية. قد تمثل هذه الاتصالات أيضا الجمعيات عابرة التي تنظم النشاط والاستقرار والتوطين والتفاعلات بين الشريكين. تحديد الشركاء التفاعل المادي للبروتين معين بالتالي يوفر المعلومات الغنية على وظيفة والتنظيم لهذا البروتين 2،3. لهذه الأسباب، وقد وضعت جهود كبيرة نحو رسم الخرائط من الدبابيس في الكائنات النموذج، بما في ذلك كولاي 4-6 ونبات الأرابيدوبسيس thaliana 7، خميرة الخباز 8-12، ذبابة الفاكهة البطن &lt;/ م&gt; 13، انواع معينة ايليجانس 14 والانسان العاقل 15. وقد وفرت هذه الدراسات معلومات هامة عن كيفية تنظيم البروتينات في الخلية وبالتالي المعلومات الأساسية على البروتينات مع وظائف لم تكن معروفة سابقا. وقد وضعت عدة استراتيجيات على مر السنين لدراسة الدبابيس. هذه التقنيات يمكن تصنيفها على نطاق واسع في ثلاث فئات على أساس هذا النوع من المعلومات التي يقدمونها على مثبطات مضخة البروتون (استعراضها في 16-18). ويستند أول واحد على الخميرة اثنين الهجين ومشتقاته 19. توفر هذه التقنيات من المعلومات عن ارتباط مباشر بين أزواج من البروتينات، التي تسمح ببناء شبكات الثنائية. ويستند الأسرة الثانية على تنقية تقارب من البروتينات الطعم وتحديد الشركاء المرتبطة بها، مثل تنقية تقارب تليها قياس الطيف الكتلي 20. هذه النهج تحديد مجموعات من البروتينات التي هي مباشرةأو المرتبطة بشكل غير مباشر، عموما بطريقة مستقرة، وتكون قوية للغاية لتحديد المجمعات البروتين. ويستند هذا النهج الثالث على المقايسات تكامل البروتين شظية (PCAs) 11،21. ويوفر هذا النهج على المستوى المتوسط ​​من قرار بين النهجين السابقة، لأنها تتيح الكشف عن جمعيات مباشرة والداني بين البروتينات. كل تقنية لها قوتها الخاصة والضعف، كما استعرضت مؤخرا 18. وPIN حقيقية النواة أفضل وصف هو إلى حد بعيد واحدة من الخميرة في مهدها خميرة الخباز، ويرجع ذلك جزئيا بروتيوم منه هو نسبيا أقل تعقيدا من تلك التي حقيقيات النوى نموذج الأخرى، ولأن المقايسات الإنتاجية العالية للكشف عن وأول مرة يتم يعاير مثبطات مضخة البروتون وأكثر كفاءة تنفيذها في هذا النموذج الحي 9-12. وهناك طريقة قوية بشكل خاص لنظام الخميرة هو اختزال ثنائي هيدروالفولات البروتين شظية تكامل فحص (DHFR-PCA)، مقايسة التي كانتيستخدم في سياقات مختلفة لدراسة PIN الخميرة في الظروف القياسية ومضطرب 11،22-26. ويعتمد هذا الأسلوب على فحص البقاء على قيد الحياة التي تمكن من الكشف عن مثبطات مضخة البروتون المباشرة وشبه المباشرة لبروتين الطعم يعطى في كل من مستويات التعبير الذاتية وتعريب التحت خلوية الأصلية للشركاء التفاعل 11،21 بطريقة كمية 27. إشارة تم الحصول عليها باستخدام هذا الاختبار (أي حجم مستعمرة على صفائف مستعمرة عالية الكثافة) وبالتالي يعكس كمية البروتين المجمعات التي تشكلت بين الطعم والفريسة في بيئة الخلوية يعادل تقريبا إلى واحدة من الخلايا من النوع البري. ويستند هذا الفحص على إعادة تشكيل انزيم مراسل تشارك في عملية الأيض حمض الفوليك، واختزال ثنائي هيدروالفولات (DHFR)، حيث يتم جلب اثنين من شظايا التكميلية للDHFR التي تنصهر فيها لاثنين من البروتينات ذات الاهتمام إلى القرب عندما تتفاعل البروتينات اللتين بدوره يؤدي إلى إعادة عكسها من نشاط انزيم 11 ونمو السلالة على المتوسط ​​تحتوي على الميثوتريكسيت (MTX، الشكل 1). هذا المركب يثبط انزيم DHFR الذاتية، ولكن ليست واحدة تحور المستخدمة في فحص 28. مجموعتين من سلالات PCA، واحدة تحتوي على ~ 4،300 ماتا سلالات مع تنصهر ORF إلى DHFR F [1،2] شظية واحدة تحتوي على ~ 4،800 MAT α سلالات مع تنصهر ORF إلى DHFR [3] جزء، ويمكن شراؤها ل تنفيذ DHFR-PCA على نطاق صغير أو كبير في أي مختبر. هنا، نحن تصف بروتوكول عام ولكن مفصلا إلى الشاشة لمثبطات مضخة البروتون بين واحد من البروتين الطعم و~ 4،800 البروتينات فريسة باستخدام هذا الاختبار.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipement</td>
			<td>&#160;Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>&#160;Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMatrix Robot, Bench-top Configuration</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>BM5-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-96-10</td>
			<td>Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-384-10</td>
			<td>Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1536-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-1536-05</td>
			<td>Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated imaging module&#160;</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>IMG-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>MTX440&#160;</td>
			<td>CAUTION: toxic compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>HYG003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin dihydrogen sulfate</td>
			<td>Werner BioAgents</td>
			<td>5010000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast-Interactome Collection&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>YSC5849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tray w/lid sterile&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[1,2] antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[3] antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide protein-protein interaction screening by protein-fragment complementation assay (pca) in living cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

هو الجدول التكميلي 2 مثال على نتائج ممثلة تم الحصول عليها باستخدام بروتين الخميرة تنصهر Nup82 إلى DHFR F [1،2] جزء كطعم. العتبة المحددة مع L-DHFR F [3] يمكن استخدام الضوابط باعتباره عتبة التجريبية لتحديد يضرب ثقة عالية (أرقام 3D و3E). بدلا من ذلك، ترتيب النتيجة يمكن استخدامها لإجراء التخصيب الجيني علم الوجود أو غيرها ظيفية يحلل 36 على أساس معايير الذهب 37. وinteractors الفيزيائية المعروفة من الطعم يمكن استرجاعها من قواعد البيانات مثل BioGRID 35 و مضافين على البيانات (أرقام 3E و 3F). في هذا المثال، تم الإبلاغ عن خمسة من أصل ثمانية ثقة عالية يضرب سابقا interactors Nup82 وهما جزء من subcomplex Nup82، Nup116 وNup159 (الشكل 3F &amp; 3G). عضو آخر من المجمع، Nsp1، لا تظهر أي ينتراكنشوئها في تجربتنا. وكان اثنان يفترس، Ade17 وTef2 (لا يظهر في الشكل 3F)، وعشرات فوق عتبة الصعبة تطبيقها، ولكن هذه من المحتمل أن تكون ايجابيات كاذبة لأنها تتفاعل مع ما يقرب من أي بروتين الطعم في شاشات PCA وقد أجرينا (نتائج غير منشورة). من ناحية أخرى، قد Pex30 تمثل interactor لالبدني رواية Nup82 وكنا قادرين على تأكيد هذا التفاعل باستخدام DHFR-PCA في منخفضة الإنتاجية (الشكل 3G). Pex30 هو بروتين الغشاء peroxisomal وتم الإبلاغ عن عدد قليل من التفاعل المباشر بين مجمع المسام النووي (NPC) وهذه العضية. حددت شاشة يومين هجين اثنين البروتين مجلس الشعب الآخر، Nup53 وAsm4 (Nup59)، وinteractors المادية للPex30 38، وقد تم الإبلاغ عن التفاعل الجيني بين Pex30 وNup170 39. شريكين آخرين التفاعل الكشف، Nup120 وNup85 (الشكل 3F &amp; 3G)، ليست جزءا من Nup82 شبه معقدة، مما يدل على قدرةمن DHFR-PCA للكشف عن التفاعلات داخل وبين subcomplexes في المجمعات الكبيرة 11. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig1highres.jpg" /> الشكل 1: سلالات الخميرة الهندسة العالى الإنتاجية DHFR-PCA (. الرقم مقتبس من Leducq وآخرون 2012 33) (A) بناء فرداني ماتا وMAT α سلالات لتلتحم Gene1 (G1) وGene2 (G2) مع DHFR F [1،2] -NatMX وDHFR F [3] -HPH الكاسيت، على التوالي. وتتضخم أشرطة من البلازميدات pAG25-DHFR F [1،2] وpAG32-DHFR F [3] مع الاشعال إلى الأمام G1-5 &quot;و G2-5، وعكس الاشعال G1-3&quot; و G2-3 &quot;، ومن ثم إدراج في الجينوم في نهاية 3 &#39;من الجينات المستهدفة من خلال إعادة التركيب مثلي. البروتينات الناتجة عن ذلك، P1 و P2، وتنصهر على التوالي إلى DHFR F [1،2] جزء (ماتا) وDHFR F [3] جزء (MATα) عن طريق رابط مرونة. (ب) التحقق من البناء في (A) يتم تنفيذها بواسطة تسلسل تقاطعات بين لGene1 وORFS Gene2 و الأشرطة DHFR. ثم يتم تزاوج سلالات PCA شيدت من معارضة أنواع التزاوج لتشكيل مضاعفا. سلالات مضاعفا تنمو على MTX المتوسطة إذا تم جلب اثنين من شظايا DHFR التكميلية إلى القرب من التفاعل بين P1 و P2، التي reconstitutes نشاط الإنزيم DHFR. (C) بناء تحكم مضاعفا PCA سلالات للشاشات DHFR-PCA. هي التي شيدت الضوابط السلبية (L-DHFR) عن طريق تحويل ماتا وMATα سلالات فرداني بشكل منفصل مع البلازميدات P41-رابط-DHFR F [1،2] وP41-رابط-DHFR F [3] (11)، على التوالي. وتزاوج سلالتين مما أدى إلى سيطرة سلبية سلالة مضاعفا التي شظايا DHFR غير قادرةليكمل كل منهما الآخر (أعلى). هي التي شيدت الضوابط الإيجابية باستخدام نفس النهج لعناصر سلبية، ولكن البلازميدات تحول في سلالات فرداني (P41 سستة-رابط-DHFR F [1،2] (P41-ZL-DHFR F [1،2]) وP41 -zipper-رابط-DHFR F [3] (P41-ZL-DHFR F [3])) تحتوي على اثنين GCN4 يسين مواز شظايا سحاب تنصهر إلى شظايا DHFR التكميلية، الأمر الذي يؤدي إلى التفاعل القوي والتأسيسي أن reconstitutes النشاط DHFR (القاع ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig2highres.jpg" /> الشكل 2: الإنتاجية العالية الإجراء DHFR-PCA (الرقم مقتبس من Leducq وآخرون 33.) (A) وMAT α DHFR F [3] جمع.<html> ويتم تكثيف في شكل 1536 من خلال جولتين متتاليتين من التكثيف. أولا، يتم الجمع بين لوحات الأسهم الجلسرين من قبل مجموعات من أربعة على انتقائية المتوسطة YPD + HygB في شكل 384 باستخدام 96 دبوس الأداة. ثانيا، يتم الجمع بين 384 صفائف من قبل مجموعات من أربعة على انتقائية المتوسطة YPD + HygB في شكل 1536 باستخدام 384 دبوس الأداة. يتم إعداد (B) المروج خلية من سلالة الطعم ماتا PCA التي تنمو ثقافة مشبعة من سلالة الطعم في وتستخدم YPD انتقائي + نات المتوسطة والطلاء الثقافة على YPD + نات omnitray. (C) هذه المروج للتزاوج سلالة الطعم مع DHFR F [3] جمع على YPD المتوسطة. يتم نقل الخلايا على التوالي مرتين على YPD + HygB + نات المتوسطة لتحديد لdiploids ومرتين على MTX المتوسطة لأداء PCA. سيتم فقط لوحظ نمو على MTX المتوسطة إذا شظايا DHFR يكمل كل منهما الآخر بعد التفاعل بين الطعم والبروتينات فريسة.e.jpg من &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig3highres.jpg" /> الشكل (3):.. ويحلل البيانات من خلال خطوات التطبيع، وتحديد عتبة أهمية وتحديد التفاعلات الإيجابية (A) توزيع كثافة حجم مستعمرة على كل لوحة (تسجيل 2) (ب) التطبيع من قبل الوسيط من كل صورة على تصحيح التحيز ل يرتبط مع لوحة إلى لوحة الآثار. (C) Heatmap تظهر معامل الارتباط سبيرمان بين لوحات، مؤكدا على استنساخ الإجراء. (D) توزيع الدرجات لمثبطات مضخة البروتون اختبارها و[3] ضوابط L-DHFR F. يمكن تعيين عتبة رقية إلى المئين عشر 95 من L-DHFR F [3] توزيع لتحديد مثبطات مضخة البروتون عالية الثقة (يمثله منقط الرأسيتوزيع الخط). (E) من اجل رتبة متوسط ​​درجة من كل فريسة. ويتم تحديد المبلغ عنها سابقا شركاء التفاعل المادي للNup82p في BioGRID 35 من الدوائر وتلك التي ذكرت في هذه الدراسة يتم تحديدها من قبل النقط الحمراء. ويظهر العتبة المحددة في (D) كخط منقط. (F) شبكة تبين مثبطات مضخة البروتون عالية الثقة التي تم تحديدها في هذه الدراسة. حواف زرقاء تظهر ذكرت سابقا interactors المادية (BioGRID 35) وحواف صفراء تظهر التفاعل غير المبلغ عنه سابقا مع Pex30. (G) بقعة-فحص تخفيف من PCA سلالات مضاعفا تنطوي Nup82-DHFR F [1،2] وفريسة-DHFR F [3 ] أزواج حددت كما interactors المادية للNup82p في هذه الدراسة. تم إجراء فحص النمو في DMSO المتوسطة (MTX المذيبات، اللوحة اليسرى) وMTX المتوسطة (اللوحة اليمنى). ضوابط السلبية التي تتكون من Nup82-DHFR F [1،2] - رابط-DHFR F [3] ورابط-DHFR F [1،2] - رابط-DHFR F [3] وتحكم إيجابية تتكون من ركان التفاعل القوي بين اثنين من الأنصاف يسين سحاب (سحاب-DHFR F [1،2] - سحاب-DHFR F [3]) كانوا المدرجة. ينبغي أن تفسر نمو الخلايا متفوقة على ضوابط السلبية في MTX المتوسطة باعتبارها التفاعل الجسدي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> الأحماض الأمينية </td><td> الكمية (ز) </td></tr><tr><td> الأدينين كبريتات * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-التربتوفان </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> L-التيروسين </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-الفنيل الانين </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> حمض الغلوتاميك-L (أحادية الصوديوم والملح) </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-الهليونين </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-فالين </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> L-ثريونين </td><td> 2.0 </tد&gt; </tr><tr><td> L-سيرين </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-الحامض الأميني حمض الهيدروكلوريك </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-ارجينين حمض الهيدروكلوريك </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-ميثيونين * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-ليسين * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-وسين </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> * المسحوبة عند تنفيذ معيار PCA (كما هو الحال في هذا البروتوكول)، ولكن يمكن أن تضاف لأغراض أخرى. </td></tr></tbody></table> الجدول 1: تكوين 10X -lys / التقى / ADE التسرب في الوسط MTX الكميات هي ليتر واحد من 10X التسرب. النجمة للدلالة على المركبات التي يجب سحبها لMTX المتوسطة القياسية، ولكن يمكن أن تضاف لأغراض أخرى. . يحتوي على البيانات المجمعة من لوحات 12 اختبار الجدول 1 دا متسلسلة: الجدول التكميلي 1تا من التحليل يماغيج تنفيذها باستخدام برنامج نصي يماغيج مخصصة مع كل صف المقابلة لموقف واحد على كل 1،536 صفيف. وبالإضافة إلى ذلك، تم المشروح كل صف مع معلومات حول ملف صورة، DHFR لوحة جمع وتكرار، ORF واسم البروتين. الجدول التكميلي 2: متوسط ​​نمو تطبيع لكل سلالة ويتضمن الجدول 2 متوسط ​​سجل 2 نمو تطبيع لكل سلالة من جمع جنبا إلى جنب مع الانحراف المعياري. ويتم تحديد يفترس تصفيتها، ويضرب وinteractors الفيزيائية المعروفة في أعمدة منفصلة.

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells at JoVE.com

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

genome-wide-protein-protein-interaction-screening-protein-fragment

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

13.2K Views.  Université Laval. Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA). 

Video: Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

الكمية والآلي عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق شاشات رني في C. ايليجانس</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em&gt; العقدية الدم</em&gt; من جانب PCR إنتاجية عالية

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

على صعيد رسم الخرائط الجينوم من المخدرات-DNA التفاعلات في الخلايا مع COSMIC (يشابك من الجزيئات الصغيرة لعزل لونين)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID وما يليها: رسم خرائط الجينوم على نطاق التفاعلات البروتين DNA بواسطة إنتاجية عالية تسلسل شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...