Diese Arbeit wurde vom Canadian Institute of Health Research (CIHR) Gewährt 191.597, 299.432 und 324.265, unterstützt ein Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada Discovery-Zuschuss und ein Human Frontier Science Program Stipendium CRL. CRL ist ein CIHR New Investigator. Guillaume Diss wird von einem PROTEO Gemeinschaft unterstützt. Samuel Rochette wird von NSERC und FRQNT Stipendien unterstützt.

1. Aufbau / Überprüfung der Bait-Stämme <ol><li> Wenn der Köder Stamm von Interesse ist in der MATa DHFR F [1,2] Sammlung zur Verfügung, rufen Sie sie aus der Sammlung, wie in Schritt 1.1.1, die Belastung auf andere Weise zu konstruieren, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben. HINWEIS: Die hier beschriebene Protokoll verwendet eine DHFR-F [1,2] Belastung als Köder und das DHFR-F [3] Sammlung als Beute, wie diese Sammlung enthält mehr Stämme als die DHFR F [1,2] Sammlung. Es ist jedoch möglich, den Bildschirm umgekehrt durchführen, wenn der Köder Stamm ist in der DHFR-F [3] Sammlung oder in beiden Orientierungen nur verfügbar, wenn eine höhere Abdeckung des Interaktom erfordert. <ol><li> Auftauen Glycerolstammlösung Platte, die den Köder Belastung auf Eis für eine Stunde enthält. Sterilisieren Sie die Aluminiumfolie bedeckt die Platte mit 95% igem Ethanol. Pierce die Folie mit einem sterilen Spitze Pipette auf und ab, um die Zellen und streifen 2-3 ul Glycerin Lager auf selektiven Hefeextrakt-Pepton resuspendierenDextrose (YPD) + 100 ug / ml Nourseothricin (Nat), um einzelne Kolonien zu isolieren. Inkubieren für zwei Tage bei 30 ° C. </li><li> Bau eines Köders PCA Stamm (MATa DHFR F [1,2]). <ol><li> Mit High-Fidelity-Polymerase und eine Standard-PCR-Protokoll, verstärken das DHFR F [1,2] Kassette aus dem Plasmid pAG25-Linker-DHFR F [1,2] -ADHterm unter Verwendung von Oligonukleotiden mit überhängenden Enden homolog zu der letzten 40 bp des ORF 3&#39;-Ende außer dem Stopcodon (Forward-Primer) und den ersten 40 bp des Gens der 3&#39;-UTR (Rückwärts-Primer) (1A). </li><li> Transformieren des PCR-Produkts in kompetente Hefezellen (üblicherweise in einem BY4741 Stamm) unter Verwendung von Standard LiOAc / PEG Hefe-Transformationsprotokoll, wie in 29 (1A). </li><li> Platte auf selektive YPD + Nat mittlere bis positive Transformanten zu isolieren. </li><li> Führen Sie eine Diagnose-Kolonie-PCR auf isolierten Kolonien, um die richtige DHFR F [1,2] Fusion zu bestätigen. Verwenden prIMers Tempern 1) in der Gen-kodierenden Sequenz (Forward oligo) etwa 100 bp stromaufwärts von der DHFR-Fusion und 2) in der ADH-Terminator der Kassette (Rückwärts-Oligo) (1B). </li><li> Sequenzierung des PCR-Produkts durch Sanger-Sequenzierung, um die ordnungsgemäße Genfusion zu bestätigen. </li><li> Archivieren Sie das bestätigt Köder Stamm in 25% Glycerin bei -80 ° C. HINWEIS: Das Protokoll kann in diesem Schritt angehalten werden. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Pin-Werkzeug Sterilisation und Vorgehensweise beim Drucken HINWEIS: Die nachfolgend beschriebene Sterilisationsverfahren wurde für die pin-Tools durch die BM3-BC (S &amp; P Robotics) Roboterplattform manipuliert optimiert, kann jedoch auf anderen Plattformen als auch angepasst werden. Dieser Abschnitt beschreibt die Pin-Werkzeug Sterilisation und Druckverfahren, die verwendet werden, um Zellen von einem Medium auf ein anderes für den Rest des Protokolls zu übertragen. In-house verwendet, um diese Routinen Skripte können auf Anfrage erhältlich. Hinweis that alle Schritte können ohne die Notwendigkeit eines Roboterplattform über eine manuelle Nadelwerkzeug 30 durchgeführt werden. <ol><li> Montieren Sie den entsprechenden Stift-Werkzeug auf der Roboterplattform. </li><li> Bereiten Reinigung und Nassstationen wie folgt: <ol><li> Fügen Sie 500 ml sterilem Wasser in das Wasserbad entfernt. </li><li> Fügen Sie 320 ml sterilem Wasser in der Bürstenstation. </li><li> Fügen Sie 380 ml 70% Ethanol im Ultraschallgerät beim Replizieren von Agar-Platte (86 x 128 mm OmniTray, mit 35 ml verfestigtes Medium) auf Agar-Platte oder 400 ml bei der Replikation von einer Mikrotiterplatte, die Flüssigkulturen auf einer Agar-Platte. </li><li> Fügen Sie 35 ml steriles Wasser in der nassen Bahn-Station (bestehend aus einer sterilen leeren OmniTray). </li></ol></li><li> Zu Beginn eines jeden Tages, die die Roboterplattform benötigt, Sterilisieren der Stift-Werkzeuge fünfmal für eine Minute im Ultraschallbad. In der Zwischenzeit, schalten Sie die UV-Lampe für fünf Minuten, um den Roboter Gehäuse zu sterilisieren. HINWEIS: Dies ist nicht, ob die rob erforderlichot unter einer sterilen Haube untergebracht. </li><li> Zwischen jedem Pin-Werkzeug Replikationsrunde, sterilisieren Sie die Pin-Tool wie folgt: <ol><li> Weichen Sie das Stift-Werkzeug fünfmal für 10 Sekunden in das Wasserbad Station Zellklumpen zu entfernen. </li><li> Weichen Sie das Stift-Werkzeug zweimal hin und her in der Bürstenstation. HINWEIS: Die rotierende Bürste wird Restzellen zu entfernen. </li><li> Weichen Sie das Stift-Werkzeug zweimal für 20 Sekunden in der Beschallungsgerät Station. HINWEIS: verbleibenden Zellen an den Zapfen wird durch Ultraschallbehandlung entfernt oder durch Ethanol getötet werden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Eintauchtiefe der Stifte erhöht bei jedem aufeinanderfolgenden Bad, um eine ordnungsgemäße Sterilisation gewährleistet. </li></ol></li><li> Trocknen Sie das Stift-Werkzeug in der Lufttrocknerstation für 25 Sekunden. </li><li> Vor der Einnahme von Zellen auf den Quellenplatten, die Stifte zu benetzen im Nassstation, die 35 ml steriles Wasser in einem OmniTray enthält. </li><li> Die Stifte Tauchen Sie zweimal in den Kolonien, die von der Source-Platte. </li><li> Drucken auf einem frisch gezapften Zielplatte, indem Sie die agar Fläche zweimal (im Folgenden als die Wirkung der &quot;Drucken&quot; ein Array bezeichnet). </li></ol> 3. Kondensation des DHFR-F [3] Sammlung in 1536 Arrays mit Hilfe eines automatisierten Roboter-Plattform <ol><li> Thaw auf Eis das DHFR-F [3] Sammlung (60 96-Well-Platten) und ein zusätzliches 96-Well-Platte mit dem L-DHFR-F [3] Kontrollstamm (1C), die das DHFR-F enthält [3] Fragment aufgefüllt und der stromaufwärts Linker allein als negative Kontrolle ausgedrückt. HINWEIS: Im Prinzip sollte dieses Fragment nicht mit einem DHFR-Fragment-Fusionsprotein (siehe Diskussion für Details) interagieren. </li><li> Zentrifugenplatten (schnelle Runde), bevor Sie die Aluminiumfolie um das Risiko von Kreuzkontaminationen bei den Brunnen zu vermeiden. </li><li> Kondensieren die Sammlung auf 16 Feldern von 384 Stämmen (Abbildung 2A). Um dies zu tun, für jede 384-Array, Druck vier Glycerin Platten an den vier Quadranten eines selektiven YPD + 250 ug / ml Hygromycin B (HygB) OmniTray mit the 96 pin-Tool (hier ein Array 384 kann in vier gleich beabstandeten Quadranten unterteilt werden, die jeweils aus 96 Positionen in einem 2 x 2-Matrix-Layout). Legen vier Platten mit 96 Vertiefungen, die das L-DHFR F [3] Negativkontrolle zwischen den anderen Platten 60, um einen endgültigen Satz von 64 Platten, die genau vier 1.536 Anordnungen füllen. Sterilisieren Sie den Stift-Werkzeug zwischen jedem Replikationszyklus wie in Schritt 2 beschrieben. HINWEIS: Legen Sie die L-DHFR-F [3] Platten, um eine solche Platte auf jeder der vier letzten 1536 Arrays. </li><li> Inkubation erfolgt für zwei Tage bei 30 ° C. HINWEIS: In diesem Stadium ist die DHFR Sammlung kann in einem 384-Format bei 4 ° C für bis zu einem Monat auf Agarplatten gespeichert. </li><li> Kondensieren die Sammlung in vier Arrays von 1536 Stämme (Abbildung 2A). Um dies zu tun, für jedes Array 1.536 Drucken vier Arrays von 384 Stämmen an den vier Quadranten einer Platte aus dem gleichen Medium wie in Schritt 3.2 mit der 384-Pin-Werkzeug (hier kann ein 1.536 Array in vier E unterteilt werdenQually beabstandet Quadranten, die jeweils aus 384 Positionen in einer 2 x 2-Matrix-Layout). </li><li> Inkubation erfolgt für zwei Tage bei 30 ° C. HINWEIS: In diesem Stadium ist die DHFR Sammlung kann in einem 1.536-Format bei 4 ° C für bis zu einem Monat auf Agarplatten gespeichert. </li><li> Replizieren Sie die vier Arrays auf dem gleichen Medium, um Koloniegröße Standardisierung mit Hilfe eines 1536 Pin-Werkzeug. </li><li> Inkubation erfolgt für zwei Tage bei 30 ° C. </li></ol> 4. Hochdurchsatz-DHFR-PCA Verfahren <ol><li> Impfen Sie eine Kultur des aus Schritt 1.1.1 oder 1.1.2 in 20 ml flüssigem YPD + Nat in einem 50-ml-Tube (2B) erhalten Köder Stamm (DHFR F [1,2] Fusion). </li><li> Inkubieren für zwei Tage bei 30 ° C unter Schütteln bei 250 rpm, damit die Kultur bis zur Sättigung zu erreichen. </li><li> Nach zwei Tagen Inkubation Platte 5 ml der Kultur auf einem YPD + Nat OmniTray. Lassen Zellen adsorbiert auf der Oberfläche für 5-10 Minuten und entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit (2B). Wiederholen twice zu drei Wiederholungen zu machen. </li><li> Inkubieren für zwei Tage bei 30 ° C. </li><li> Drucken Sie den Köder Stamm aus den Schritten 4.3 und 4.4 am 12. YPD-Platten (genug, um Paarung vier Platten des DHFR-F [3] Sammlung × drei Wiederholungen) mit einem 1536 Pin-Werkzeug mit jeder Zellrasen nicht mehr als das Vierfache. </li><li> Drucken Sie den entsprechenden Array des DHFR-F [3] Sammlung oben auf den Köder Zellen unter Verwendung des 1536 Stift-Werkzeug (2C). </li><li> Lassen Sie die Belastungen paaren durch Inkubation für 2 Tage bei 30 ° C. </li><li> Wählen diploiden Zellen durch Drucken Kolonien auf OmniTrays enthaltenden YPD + HygB + Nat (2C). </li><li> Inkubieren für zwei Tage bei 30 ° C. </li><li> Wiederholen diploiden Auswahl wie in den Schritten 4.8 und 4.9 (2B) beschrieben. </li><li> Bereiten Platten Medien mit MTX (MTX-Medium) am Tag vor der Verwendung die folgenden Schritte 21 (ACHTUNG:. Vorsicht beim Umgang mit MTX, da es eine toxische Verbindung Tragen Sie immer Handschuhe, protection Brille und Laborkittel beim Umgang mit es) (2C): <ol><li> Bereiten Sie die 10-fach-Lys / met / ade Aminosäure-drop-out in VE-Wasser. Filter-Sterilisation des Drop-out in eine sterile Flasche mit einem 0,2 um sterile Spritzenfilter oder, wenn in großen Mengen benötigt wird, eine 0,2 um Flaschenverschluss Filtertrichter (Tabelle 1). </li><li> Bereiten Sie eine 10 mg / ml MTX Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO). Unmittelbar nach dem Herstellen der Lösung und Gefriert der Rest bei -20ºC. Schützen Sie es vor Licht, da sie lichtempfindlich ist. MTX wieder Nicht einfrieren nach dem Auftauen es. </li><li> Vorbereiten der Medien wie folgt (mittel Bestandteile und Mengen sind die gleichen wie diejenigen in Tarassov et al 11 verwendet.): <ol><li> Für einen Liter des Mediums, mischen in zwei getrennten Kolben: 1) 6,69 g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren und ohne Ammoniumsulfat und 330 ml entionisiertem Wasser; 2) 25 g Agar und edlen 500 ml VE-Wasser. </li><li> Autoklaven-Kolben bei 121 ° C für 20 min. </li><li> Äquilibrieren Temperatur in einem Wasserbad bei 55 ° C für mindestens eine Stunde. </li><li> Man vermischt die beiden Kolben miteinander und 50 ml sterile 40% Glucose, 100 ml 10X sterile drop-out, und 20 ml MTX 10 mg / ml. </li><li> Gießen Sie 35 ml (siehe Anmerkung unten) von mittel OmniTrays. Lassen Sie erstarren für mindestens eine Stunde und eine Hälfte. Schutzplatten vor Licht. HINWEIS: Hier gießt 35 ml Medium pro OmniTray ist entscheidend für die gleiche Blechdicke, die für alle nachfolgenden Schritte ist zu gewährleisten. </li></ol></li></ol></li><li> Bildplatten von der zweiten Runde der diploiden Auswahl mit der Roboter-Plattform oder mit einer normalen Digitalkamera mit einheitlichen Schildbeleuchtung. Verwenden Sie diese Bilder zu leeren Positionen auf den Arrays zu identifizieren, wenn die Durchführung der Downstream-Analyse. Sicherstellen, dass die Parameter der Kamera immer die gleichen sind, und dass der Roboter Licht eingeschaltet ist. </li><li> Drucken diploiden Zellen auf MTX Medien using des 1536 Stift-Werkzeug. </li><li> Inkubieren für vier Tage bei 30 ° C in Plastikbeuteln um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Bereiten Sie eine zweite Charge von OmniTrays enthält MTX Medium wie in Schritt 4.11 beschrieben. </li><li> Nach vier Tagen Inkubation, Bildplatten mit Hilfe der Roboterplattform oder normalen Digitalkamera. Sicherstellen, dass die Parameter der Kamera immer die gleichen sind, und dass der Roboter Licht eingeschaltet ist. </li><li> Durchführen einer zweiten Runde der MTX-Selektion durch die Replikation der Zellen in der zweiten Charge von MTX Medien. Hinweis: das wird das Hintergrundwachstum von PCA-Stämme zu verringern und die quantitative Auflösung. </li><li> Inkubieren für vier Tage bei 30 ° C in Plastikbeuteln um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Bildplatten, wie in Schritt 4.16 beschrieben. </li></ol> 5. Bildanalyse <ol><li> Analysieren Sie Bilder der Kolonie-Arrays mit benutzerdefinierten ImageJ 31 Skripte oder mit veröffentlichten Software wie Colonizer, Ht Kolonie Grid-Analysator, Cell Profiler Colony Bildr, ScreenMill, YeastXtract und gitter (in 32 zusammengestellt). Die Bildanalyse ist die Gesamtproduktion einer oder mehrerer Tabellen, die Koloniegrößen für jede Position jedes Array, verwenden Sie diese Kolonie Größen für alle Downstream-Analysen. HINWEIS: In dieser Studie verwendeten wir ein in Leducq et al benutzerdefinierte ImageJ Skript 33 (siehe Diskussion Abschnitt für weitere Details).. </li></ol> 6. Datenanalyse HINWEIS: Die Ergebnisse der Bildanalyse in einem Tabulator wie Excel oder mit Hilfe einer Skriptsprache wie R 34 verarbeitet werden. Die folgenden Schritte beschreiben das Verfahren mit einem benutzerdefinierten Skript ImageJ 31. <ol><li> Mit einem benutzerdefinierten Skript, verketten Ausgabedateien von Bildanalyse und kommentieren jede Zeile mit der Platte und belasten Informationen wie in Tabelle 1 Zusatz. </li><li> Melden Sie 2 verwandeln die Koloniegröße Werte (Integrated Dichte oder Kolonie Bereich, hier Spalte &quot;IntDenBackSub &amp; #8221; Ergänzende von Tabelle 1 verwendet wurde). HINWEIS: Wertverteilung wird wie in 3A zu suchen. </li><li> Normalisierung dieser Werte durch Subtrahieren des Medianwerts von jeder Platte. Anmerkung: Dieser Schritt steuert für Platten Vorspannung, die aus ungleichen Medienmenge bzw. Variation der automatischen Bildaufnahme ergeben können, und reduziert die inter replicate Varianz (3B). </li><li> Überprüfen Sie, ob Wiederholungen miteinander korrelieren (3C), um die Reproduzierbarkeit der Versuche zu bewerten. </li><li> Zur Unterscheidung Interaktion von nicht-wechselwirkenden Köder-Beute-Paare, legen großen Vertrauen Schwelle, die den 95. Perzentil der Verteilung der L-DHFR-F [3] Kontrollen. HINWEIS: Bei diesem Versuch, dies entspricht 3,39 (3D). Alternativ kann ein Schwellwert auf der Grundlage der Überlappung mit bekannten physikalischen Interaktoren, wie sie in der BioGrid 35 gemeldet werden.Siehe Diskussion für weitere Details. </li><li> Für alle Köder, Beuten-Filter identifiziert wie in falsche positive Wechselwirkungen in DHFR-PCA-Bildschirme beteiligt (siehe Diskussion für weitere Details) und Ergänzende Tabelle 2 (in der Spalte &quot;1&quot; identifiziert &quot;gefiltert&quot;) aufgeführt. </li><li> Der Mittelwert der normalisierten Log2 Koloniegrößen der drei Wiederholungen jeder Interaktion (Spalte &quot;Durchschnitt&quot; im Ergänzungs Tabelle 2). </li></ol> 7. Überprüfung der Physical Interacter Mit Kleines Experimente Hinweis: alle PPI von besonderem Interesse, die eine Punktzahl über oder dicht an der angewendet Schwelle kann unter Verwendung des DHFR-PCA-Test in einer kleinen Versuchsanordnung mit einem Wachstumstest auf festem oder flüssigem MTX Medium geprüft. Die folgenden Schritte zeigen die Prozedur manuell zu erstellen diploiden PCA Stämme und führen vor Ort Tests auf MTX Medium. Der Versuchsleiter sollten diese Schritte für alle notwen führeny Kontrollen (Bait-DHFR F [1,2] x L-DHFR-F [3], Zipper-Linker-DHFR diploiden Stämme und Linker-DHFR diploide Stamm). <ol><li> Platte 2-3 ul der Glycerolstammlösung des Köders Belastung in 1.1.2.6 generiert), die L-DHFR-F [3] Kontrollstamm, der Zipper-Linker-DHFR und Linker-DHFR diploiden Stämme auf YPD + Nat, YPD + HygB und zweimal YPD + Nat + HygB Medien auf. </li><li> Rufen Sie die Beute von Interesse in der DHFR-F [3] Sammlung und folgen Sie den Anweisungen in Schritt 1.1.1, aber Streifen die Belastung auf YPD + HygB Medium statt YPD + Nat Medium. </li><li> Führen Sie eine diagnostische PCR wie in 1.1.2.4, um die DHFR F bestätigen [3] Fusion an der Beute Locus und Folge das Produkt. </li><li> Impfen Sie 1 ml Flüssigkeit YPD-Medium mit den haploiden Stämmen zu paaren (Bait x Prey, Bait x L-DHFR-F [3] Steuerung) und wachsen mindestens zwei Tage bei 30 ° C, damit die Diploide zu bilden. </li><li> Wählen Diploiden durch Ausstreichen 4-5 ul der Kultur in 7,4 auf festem YPD + HygB + Nat Medium. Wachsen 2 Tage bei 30 ° C. </li><li> Select eine isolierte Kolonie und über Nacht wachsen in Flüssigkultur (1 ml), um den Wachstumstest durchzuführen. </li><li> Bereiten MTX und DMSO (gleichen Inhaltsstoffe wie MTX Medium, aber ohne MTX) Platten am Tag vor dem Gebrauch. Siehe Schritt 4.11 für weitere Details. </li><li> Führen Wachstumstest durch Spotten Reihenverdünnungen der verschiedenen Kulturen auf die Kontrolle (DMSO) und Selektionsplatten (MTX). <ol><li> Verdünnen Vorkulturen auf OD = 1. </li><li> Führen fünffache Verdünnungen (bis zu einem Verdünnungsfaktor von 625) in einer sterilen 96-Well-Platte. </li><li> Spot 4 ul jeder Verdünnung auf der PCA Medien (DMSO und MTX). </li><li> Inkubation bei 30 ° C in Plastiktüten, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Bildplatten aus den Tagen 1 bis 7 der Inkubation mit dem Roboterplattform oder einen normalen Digitalkamera. </li></ol></li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+robustness+of+protein+complexes+to+inter-species+hybridization.">Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization.</a> PLoS Genet. 8, e1003161 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Stark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioGRID:+a+general+repository+for+interaction+datasets.">BioGRID: a general repository for interaction datasets.</a> Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).</li><li>Vinayagam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex-based+analysis+framework+for+high-throughput+data+sets.">Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets.</a> Science signaling. 6, rs5 (2013).</li><li>Jansen, R., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+function+on+a+genomic+scale:+the+importance+of+gold-standard+positives+and+negatives+for+network+prediction.">Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction.</a> Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li></ol>

Ein Teil der Open-Access-Publikationskosten für diesen Artikel wurden von S &amp; P Robotics bezahlt.

Wir beschreiben ein Protokoll auf Basis des DHFR-PCA-Test ermöglicht die systematische Ermittlung von physikalischen Interaktoren für einen bestimmten Köderprotein bei hohem Durchsatz. Dieses Protokoll kann durch Screenen auf mehr Köder ausgelegt werden, und dies in jeder gewünschten Höhe der Replikation. Wir demonstrieren die Zuverlässigkeit dieses Protokoll durch die Identifizierung von physischen Interaktionspartner für eine Köderprotein in der Kernporenkomplex beteiligt: ​​Nup82. Unsere Analyse aktivieren, damit Sie fünf bereits berichtet Interaktoren und einer zuvor unbekannten Interaktor (3F und 3G) zu finden, Hervorhebung der Fähigkeit des Verfahrens, um die Hefe Protein Interaktom studieren. Das hier beschriebene Protokoll enthält einige wichtige Schritte, denen der Experimentator sollte darauf achten. Wir empfehlen 1) Stellen Sie sicher, dass der Köder DHFR F [1,2] Fusion korrekt (Abbildung 1B) ist; dies kann durch Sequenzierung der Konstruktion und measur erreicht werdening korrekte Proteinexpression mit Hilfe eines Anti-DHFR F [1,2] oder Anti-DHFR F [3] Antikörper; 2) Vor dem Beginn des Bildschirms ist, wird empfohlen, um zu überprüfen, ob jeder Köder von Interesse aufweist Promiscuous Wechselwirkungen in PCA-Bildschirme. Dies kann durch die Steuerung Bildschirme mit Ködern mit den entsprechenden L-DHFR-Steuerung oder durch manuelle Paarung den Köder mit dem entsprechenden L-DHFR-Steuerung und Durchführung einer Wachstumstest in MTX Medium gekreuzt erfolgen. 3) Die Platten sollten gegossen werden der Tag, bevor sie verwendet werden, so dass die Feuchtigkeit optimal für Zellhaftung auf der Agar-Oberfläche während des Druckvorganges; 4) Quellplatten sollten nicht mehr als vier Mal verwendet, um genügend Zellen auf der Zielplatte zu übertragen. Eine Erhöhung der Anzahl der Kopien der Zielplatte durch aufeinanderfolgende Schritte der Expansion (-&gt; 16 Kopien -&gt; 64 Kopien zB 4 Kopien) erfolgen. Alternativ können die Zellen an unterschiedlichen Positionen auf dem Rasen oder in der Kolonie zwischen verschiedenen Replikationsrunden abgeholt werden; 5) Sind mehrere positions werden nach der diploiden Auswahl (en), stellen Sie sicher, dass die Quellplatten wurden nicht zu oft in der Paarungsschritt verwendet fehlt (Schritte von 4,5 bis 4,7); 6) Stellen Sie sicher, dass die MTX Medium enthält alle wesentlichen Bestandteile in den richtigen Konzentrationen. Wenn nämlich kein Wachstum bei allen auf der MTX Medium beobachtet, es sein kann, entweder weil keine Interaktion durch PCA nachweisbaren für die Proteine ​​von Interesse oder weil MTX Medium wurde nicht richtig vorbereitet. Um sicherzustellen, daß das Medium erlaubt das Wachstum von Stämmen, welche DHFR-Fragmenten Komplementierung kann eine konstitutive Wechselwirkung an leeren Positionen der Sammlung hinzugefügt werden und als eine positive Kontrolle, wie DHFR-Fragmenten an Leucin-Zipper-Einheiten 33 (1C) fusioniert werden. Parallelversuche mit den Linker-DHFR-Fragmente oder die Reißverschluss-Linker-DHFR-Fragmenten wird es ermöglichen, zwischen den Bedingungen, die alle Zellen wachsen lassen (low MTX-Konzentration oder Köderprotein, die zu falsch positiven Wechselwirkungen machen neigen zu unterscheiden, wie described unten) und Bedingungen, die das Wachstum von allen Stämmen (MTX-Konzentration zu hoch oder wesentlicher Bestandteil in das Medium fehlt) zu verhindern; 7) Da PCA wird durch aufeinanderfolgende Runden von Replikationen von einem Medium zu einem anderen durchgeführt wird, kann eine Kreuzkontamination zwischen den Belastungen zwischen den verschiedenen Platten auftreten, wenn zum Beispiel der Pin-Werkzeug nicht richtig zwischen Replikationsrunden und / oder das letzte Wasser sterilisiert Bad (dh feuchte Station) in der Sterilisationsverfahren wird von Kolonien der vorherigen Replikationsrunden kontaminiert. Mehrere Positionen auf den Arrays sind leer und kann somit als Steuerpositionen, wo kein Wachstum zu beachten, um Kreuzkontaminationen zu erkennen sein werden. Die Bildanalyse kann unter Verwendung von mehreren veröffentlichten Software (siehe Abschnitt 5 des Protokolls) oder ein benutzerdefiniertes Skript werden. In dieser Studie, die benutzerdefiniertes Skript führt die folgenden Schritte: 1) Das Skript subtrahiert Pixelwerte einem leeren Teller auf Werte von jeder Platte, um gemeinsam PixelRRECT für die Beleuchtung Vorurteile. 2) Das Skript wandelt jedes grundkorrigierte Bild in dual mit einem Pixelwert Schwelle von 10. 3) Für je 1536 Positionen jeder Platte, durch Überlagerung ein Rechteck auf den Rand Kolonien bestimmt, wird das Skript ImageJ &quot;Analyze Partikel ... &quot;Funktion in einer Kreisauswahl. Die kreisförmige Auswahl mit einem Radius gleich dem Abstand zwischen zwei Positionen minus 10 Pixel eingestellt. 4) Das Skript wählt die am besten Teilchen von der Mitte der Auswahl und bestätigt sie als Kolonie, wenn die Lage nicht mehr als die Hälfte des Intervalls zwischen zwei Kolonien von der Mitte der Markierung. 5) Das Skript misst Pixelwerte des ausgewählten Teilchen auf dem Hintergrund-korrigierten Bild. 6), um alle verbleibenden Hintergrundbeleuchtung spannt weiter zu korrigieren, subtrahiert das Skript den Mittelwert aller Pixel von der Kreisauswahl, die nicht Teil eines Teilchens in Pixelwerte der Kolonie waren. Die Summe dieser korrigierten Pixelwerts, in der Spalte &quot;IntDenBackSub&quot; des Ergänzungs Tabelle 1 gespeichert sind, werden als Maß für die Koloniegröße verwendet. Ein kritischer Schritt in dem Analyseteil die Wahl der Signifikanzschwelle. Hier haben wir uns für einen Schwellenwert basierend auf der Verteilung des negativen L-DHFR F [3] steuert, aber je nach dem Ziel auf dem Bildschirm kann eine solche Schwelle zu streng sein. Tatsächlich L-DHFR F [3] steuert überexprimiert werden (starke TEF-Promotor), so dass die komplementären Fragmente können spontan ergänzen einander und sind deshalb nicht repräsentativ für die Expression der meisten Proteine. Dies wird durch die Tatsache, dass die Verteilung der L-DHFR F [3] steuert ist höher als der Mittelwert der Hintergrund-Wachstum (Figur 3D) hervorgehoben. So dass Wechselwirkungen mit Noten unterhalb dieser Schwelle strengere, aber das sind eindeutig außerhalb des Hinterwachstumsverteilung kann als mögliche Treffer, die darstellen können, zum Beispiel, vorübergehende oder schwache inter betrachtenAktionen. Diese können weiter untersucht werden und eine Kreuzvalidierung, wenn beispielsweise die beiden Proteine ​​nicht ausreichte, um die spontane Komplementation der DHFR-Fragmente, wie die L-DHFR Steuerelemente ermöglichen kann ausgedrückt. Alternativ könnte man eine Signifikanzschwelle bezogen auf den Anteil der Überlappung mit berichteten physischen Interaktoren in Datenbanken wie BIOGRID 35, um den Anteil der wahren Positiven über falsche Positive zu maximieren. Im Gegensatz zu der Verwendung des L-DHFR Verteilung Diese Alternative kann nicht immer möglich sein, wenn, zum Beispiel, ist die Anzahl von bekannten physikalischen Interaktoren nicht ausreichend hoch. Darüber hinaus hat die Wahl der Signifikanzschwelle einen Einfluss auf den Anteil der falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse in der letzten Datensatz. Tatsächlich, wie jede andere PPI-Nachweistest, Fehlalarme aus unspezifischen Wechselwirkung eines Proteins mit dem DHFR-Fusionsprotein führen, wenn beispielsweise sehr reichlich das Protein wie zuvor erwähnt. Diesewird durch die Tatsache, dass einige Beute systematisch alle Köder-Proteine ​​interagieren in PCA-Bildschirme und so veranschaulicht, müssen vor der Analyse 11 (zB TEF2 und Ade17 und Ergänzungs Tabelle 2) entfernt werden. Um dieses Problem zu, ein Steuer PCA Bildschirm der beiden Sammlungen gegenüber dem entsprechenden L-DHFR Kontrolle zu umgehen (F [1,2] oder F [3]), um Köder und Beute zeigen spontane DHFR-Fragmente Ergänzung in den spezifischen Bedingungen durchgeführt werden, zu identifizieren auf jedem Bildschirm. Außerdem Durchführung eines Gene Ontology Bereicherung Analyse kann das Vertrauen in die Daten zu erhöhen, wenn die Funktion eines bestimmten Köder bekannt ist. Andererseits kann DHFR-PCA zu falschen Negativen aus mehreren Gründen: 1 zu ergeben) nicht alle Proteine ​​können an die DHFR-Fragmenten, da diese die Proteine ​​zu destabilisieren oder deren Lokalisation verändern, wenn beispielsweise verschmolzen werden, das DHFR-Fusion an die C-Terminus stört eines Lokalisierungssignals; 2) DHFR Rekonstitution in einigen zellulären Kompartimenten may keine Folsäure zu erzeugen, wenn zum Beispiel ein wesentlicher Vorläufer für Folat-Synthese ist nicht verfügbar; 3) C-Termini, ob innerhalb einer Distanz von 8 nm für DHFR Komplementation auftreten 11. So kann eine bekannte Interaktion nicht erkannt werden, wenn ihre C-Termini sind nicht nah genug im Raum. Dies wird hier durch die Tatsache, dass ein großer Anteil der Nup82 physikalische Wechselwirkungen in Datenbanken, von denen die meisten indirekten gemeldet werden, wurden in unserem Test nachgewiesen exemplifiziert. Ähnlich wird membrangebundene Proteine, für die die C-Termini sind in trans relativ zu der Membran nicht zu der DHFR-Fragmenten Komplementierung und nicht erkannt wird 11. Einschränkungen 1) und 3) kann relativ einfach durch Fusionieren des DHFR-Fragments mit dem N-Terminus des Proteins, umgangen werden. Andernfalls kann es zu verhindern, mit einem Lokalisierungssignal in der Nähe des C-Terminus beeinträchtigen und ermöglichen eine Interaktion zwischen Membranproteine, deren N- und C-Terminus zu erkennen sind in cis gegenauf die Membran. Einige Herausforderungen bleiben in der Studie von PINs (in 2,3 überprüft). Die Karten von PINs bisher produziert wurden weitgehend in einem einzigen experimentellen Bedingungen für die einzelnen Arten beschrieben worden und bieten somit eine einzelne Momentaufnahme, wie Protein-Netzwerken organisiert werden könnte. Es besteht daher ein Bedarf an der Erforschung der anderen experimentellen Bedingungen, wie PINs können als Reaktion auf Umweltveränderungen, bestimmte Reize, in die Entwicklung oder die folgenden Mutationen reorganisiert werden. Diese Herausforderungen werden durch die Entwicklung neuer Technologien für die Abfrage von PPI in Echtzeit, in lebenden Zellen und durch Anpassung der aktuellen Techniken, so dass sie von einer größeren Gemeinschaft von Laboratorien verwendet werden, überwunden werden. Als quantitatives Verfahren, das Änderungen in der Menge des verwendeten DHFR Komplementation erfassen kann Komplexe 27 kann DHFR-PCA geeignet ist, diese Herausforderungen zu überwinden und wurde verwendet, um zu untersuchen, wie EPI durch einen DNA-schädigenden Mittel 22 sind betroffen </sup&gt;, Chemikalien 25. Gendeletionen 23,26 oder in anderen Hefearten und ihre Hybriden 33. Erforschung dieser neuen Dimensionen wird mehr und mehr an Bedeutung gewinnen, um die Dynamik der PIN offenbaren.

Protein-Interaktionsnetzwerke (PIN) bieten eine niedrige Auflösung der Karte, wie Proteine ​​funktionell in der Zelle 1 organisiert. Jeder physikalische Verbindung zwischen zwei Proteinen oder Protein-Protein-Wechselwirkung (PPI) kann eine Verbindung, die zeitlich stabil ist, wie sie in Proteinkomplexe gefunden repräsentieren und die in die strukturelle Organisation der Zelle beitragen. Diese Verbindungen können auch stellen vorübergehenden Vereinigungen, die die Aktivität, Stabilität, Lokalisierung und Interaktionen der beiden Partner zu regeln. Die Ermittlung der physikalischen Interaktionspartner eines bestimmten Proteins bietet daher reichen Informationen über die Funktion und Regulation dieses Proteins 2,3. Aus diesen Gründen haben große Anstrengungen zur Kartierung von PINs in Modellorganismen wie Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster &lt;gesetzt worden/ Em&gt; 13, Caenorhabditis elegans 14 und Homo sapiens 15. Diese Studien haben wichtige Erkenntnisse darüber, wie Proteine ​​in der Zelle und damit wichtige Informationen über Proteine ​​mit bisher unbekannten Funktionen organisiert ist. Mehrere Strategien sind in den letzten Jahren zu studieren PINs entwickelt. Diese Technologien lassen sich grob in drei Kategorien auf der Grundlage der Art der Informationen, die sie auf PPI bieten (in 16 bis 18 überprüft) gruppiert werden. Die erste ist auf die Hefe-Zwei-Hybrid und seine Derivate 19 basiert. Diese Technologien liefern Informationen über die direkte Verbindung zwischen Paaren von Proteinen, die die Konstruktion binärer Netzwerke ermöglicht. Die zweite Familie basiert auf der Affinitätsreinigung von Köderproteine ​​und die Identifizierung ihrer zugehörigen Partner wie Affinitätsreinigung gefolgt von Massenspektrometrie 20 basiert. Diese Ansätze identifiziert Gruppen von Proteinen, die direktoder indirekt verbunden sind, im allgemeinen in einer stabilen Art und Weise und sind extrem leistungsfähig, um die Proteinkomplexe zu identifizieren. Der dritte Ansatz beruht auf Protein-Fragment Komplementierungsassays (PKA) 11,21 basiert. Dieser Ansatz bietet ein mittleres Niveau der Auflösung zwischen den beiden früheren Ansätzen, denn sie ermöglicht Erfassung direkter und proximalen Assoziationen zwischen Proteinen. Jede Technik hat ihre eigenen Stärken und Schwächen, wie vor kurzem überprüft 18. Die beste beschriebenen eukaryotischen PIN ist bei weitem die eines der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, zum Teil wegen seiner Proteom ist relativ weniger komplex als bei anderen Modell Eukaryoten und wegen Hochdurchsatz-Assays zum Nachweis PPI haben zunächst untersucht worden und effizienter sind in diesem Modellorganismus 9-12 implementiert. Eine besonders leistungsfähige Methode für die Hefe-System ist das Dihydrofolatreduktase-Protein-Fragment Komplementierungsassay (DHFR-PCA) ist ein Test, der gewesen istin unterschiedlichen Zusammenhängen verwendet, um die Hefe-PIN in Standard- und gestörte Bedingungen 11,22-26 studieren. Dieses Verfahren beruht auf einem Überlebens-Assay, der die Detektion von direkt und nahezu direkte PPI für eine gegebene Köderprotein sowohl endogenen Expressionsniveaus und nativen subzellulären Lokalisation der Interaktionspartner 11,21 auf quantitative Weise 27 ermöglicht. Die unter Verwendung dieses Tests (dh Koloniegröße auf High-Density-Kolonie-Arrays) erhaltene Signal spiegelt somit die Menge an Proteinkomplexen zwischen Köder und Beute in einer zellulären Umgebung fast gleichbedeutend mit dem eines Wildtyp-Zellen gebildet. Der Test basiert auf der Rekonstitution eines Reporterenzym in Folatstoffwechsel berücksichtigt, die Dihydrofolatreduktase (DHFR), wobei zwei komplementäre Fragmente von DHFR, die an die beiden Proteine ​​von Interesse fusioniert sind, in die Nähe gebracht wird, wenn die zwei Proteine ​​interagieren, die wiederum zu einer reversiblen Rekonstitution der Enzymaktivität 11 und das Wachstum des Stammes auf einem Medium, das Methotrexat (MTX; Abbildung 1). Diese Verbindung hemmt die endogene DHFR-Enzym, nicht aber das mutierte im Test 28 verwendet. Zwei Sammlungen von PCA-Stämmen, von denen eine ~ 4300 MATa Stämme mit ein ORF fusioniert mit dem DHFR-F [1,2] Fragment und eine mit ~ 4800 MAT α-Stämme mit einem ORF fusioniert mit dem DHFR [3] Fragment kann erworben werden Umsetzung DHFR-PCA bei kleinen oder großen Maßstab in jedem Labor. Hier beschreiben wir eine allgemeine, aber ausführliches Protokoll, um Bildschirm für die PPI zwischen einem Köderprotein und ~ 4800 Beuteproteine ​​unter Verwendung dieses Tests.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipement</td>
			<td>&#160;Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>&#160;Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMatrix Robot, Bench-top Configuration</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>BM5-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-96-10</td>
			<td>Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-384-10</td>
			<td>Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1536-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-1536-05</td>
			<td>Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated imaging module&#160;</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>IMG-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>MTX440&#160;</td>
			<td>CAUTION: toxic compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>HYG003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin dihydrogen sulfate</td>
			<td>Werner BioAgents</td>
			<td>5010000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast-Interactome Collection&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>YSC5849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tray w/lid sterile&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[1,2] antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[3] antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide protein-protein interaction screening by protein-fragment complementation assay (pca) in living cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Ergänzende Tabelle 2 ist ein Beispiel für repräsentative Ergebnisse mit dem Hefeprotein Nup82 verschmolzen mit dem DHFR-F [1,2] Fragment als Köder erhalten. Die mit der L-DHFR F definierte Schwelle [3] Steuerelemente können als empirische Schwelle verwendet werden, um ein hohes Vertrauen Hits (Abbildungen 3D u 3E) zu bestimmen. Alternativ kann der Core-Ranking verwendet werden, um Gene Ontology Anreicherungen führen oder andere funktionelle Analysen 36 basierend auf Goldstandards 37. Die bekannten physikalischen Interaktoren der Köder kann von Datenbanken wie BIOGRID 35 abgerufen und überlagert von den Daten (3E und 3F). In diesem Beispiel sind fünf von acht hohen Vertrauens Treffer wurden zuvor als Interaktoren Nup82 gemeldet und zwei sind Teil der Nup82 Subkomplex, Nup116 und Nup159 (Abbildung 3F 3G). Das andere Mitglied des Komplexes, nsP1, keinerlei Wechselwirkung nicht zeigention in unserem Experiment. Zwei Beute, Ade17 und TEF2 (nicht in 3F gezeigt), hatten Werte über der Fest Schwelle angewendet, aber mit Fehlmeldungen, wie sie mit fast jeder Köderprotein in PCA-Bildschirme haben wir (unveröffentlichte Ergebnisse) durchgeführt zu interagieren sind. Auf der anderen Seite kann Pex30 eine neuartige physikalische Interaktor der Nup82 stellen, und wir waren in der Lage, diese Interaktion mit DHFR-PCA bei niedrigen Durch (Abbildung 3G) zu bestätigen. Pex30 eine peroxisomale Membranprotein und ein paar direkte Wechselwirkungen zwischen dem Kernporenkomplexes (NPC) und dieser Organelle gemeldet. Ein Zwei-Hybrid-Screen identifiziert beiden anderen NPC Protein Nup53 und ASM4 (Nup59), als physikalische Interaktoren von Pex30 38 und eine genetische Interaktion zwischen Pex30 und Nup170 wurde berichtet, 39. Zwei weitere Interaktionspartner erkannt Nup120 und Nup85 (Abbildung 3F 3G) sind nicht Teil der Nup82 Unterkomplex, welches die Fähigkeitdes DHFR-PCA zu Wechselwirkungen innerhalb und zwischen den Unterkomplexe in größeren Komplexen 11 zu erkennen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig1highres.jpg" /> Abb. 1: Entwicklung Hefestämme für Hochdurchsatz-DHFR-PCA (. Figur aus Leducq et al angepasst 2012 33) (A) Bau von haploiden MATa und MAT α Stämme Gene1 (G1) und Gene2 (G2) mit dem DHFR-Sicherung F [1,2] -NatMX und das DHFR F [3] -HPH Kassetten auf. Kassetten aus den Plasmiden verstärkt pAG25-DHFR F [1,2] und pAG32-DHFR-F [3] mit Vorwärtsprimer G1-5 &#39;und G2-5&#39; und Reverse-Primer G1-3 &#39;und G2-3&#39;, und dann in das Genom am 3&#39;-Ende des Zielgens durch homologe Rekombination inseriert. Die resultierenden Proteine, P1 und P2 sind jeweils mit dem D verschmolzenHFR F [1,2] Fragment (MATa) und das DHFR F [3] Fragment (MATa) über einen flexiblen Linker. (B) Überprüfung der Konstruktion in (A) wird durch Sequenzierung der Verbindungsstellen zwischen Gene1 und Gene2 des ORFs und durch die DHFR-Kassetten. Die konstruierten PCA Stämme von gegnerischen Paarungstypen werden dann zusammengefügt, um einen diploiden zu bilden. Diploiden Stämme wachsen auf MTX Medium, wenn die zwei komplementären DHFR-Fragmente werden durch eine Wechselwirkung zwischen P1 und P2, die die Aktivität des Enzyms DHFR rekonstituiert in unmittelbare Nähe gebracht werden. (C) Konstruktion von Steuer diploiden Stämme PCA für DHFR-PCA-Bildschirme. Die Negativkontrollen (L-DHFR) durch separat haploiden MATa und MATa Stämme mit Plasmiden p41-Linker-DHFR F [1,2] und p41-Linker-DHFR-F [3] 11 bzw. Umwandlung errichtet. Die beiden Stämme werden gepaart, was zu einer negativen Kontrolle diploiden Stamm, in dem das DHFR-Fragmente sind nichtsich gegenseitig (oben) zu ergänzen. Positive Kontrollen werden mit dem gleichen Ansatz wie für die Negativkontrollen hergestellt, aber die Plasmide in haploiden Stämmen (p41-Reißverschluss-Linker-DHFR F [1,2] (p41-ZL-DHFR F [1,2]) und p41 verwandelt -Reißverschluss-Linker-DHFR F [3] (p41-ZL-DHFR F [3])) zwei parallel GCN4-Leucin-Zipper-Fragmente mit den komplementären DHFR Fragmente fusioniert, was zu einem starken und konstitutiven Interaktion, die DHFR-Aktivität rekonstituiert führt (bottom ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Hochdurchsatz-DHFR-PCA-Verfahren (Figur aus Leducq et al 33 angepasst.) (A) Die MAT α DHFR F [3] Sammlung.<html> befindet sich in einem 1536-Format durch zwei aufeinanderfolgende Runden Kondensation kondensiert. Zunächst werden Glycerolstammlösung Platten von einer Gruppe von vier auf selektiven YPD + HygB Medium in einem 384-Format mit dem 96 Pin-Tool kombiniert. Zweitens werden 384 Arrays von Gruppen von vier auf selektiven YPD + HygB Medium in einem 1536-Format mit Hilfe der 384 Pin-Tool kombiniert. (B) Zellrasen der MATa PCA Köder Belastung werden, indem eine gesättigte Kultur des Köders Belastung in vorbereitet selektive YPD + Nat mittel- und Galvanisieren der Kultur auf einem YPD + Nat OmniTray. (C) Diese Rasenflächen verwendet werden, um den Köder Belastung mit dem DHFR-F [3] Sammlung auf YPD-Medium passen. Die Zellen werden nacheinander zweimal auf YPD + HygB + Nat-Medium überführt, um für Diploiden und zweimal auf MTX mittlere bis PCA durchführen wählen. Wachstum nur auf MTX Medium beobachtet, wenn die DHFR-Fragmenten ergänzen einander nach einer Wechselwirkung zwischen Köder und Beute-Proteine ​​werden.e.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig3highres.jpg" /> Fig. 3:. Datenanalyse durch die Schritte der Normalisierung, die Bestimmung einer Signifikanzschwelle und Identifizierung von positiven Wechselwirkungen (A) Dichteverteilung der Koloniegröße auf jeder Platte (log 2) (B) Normalisierung durch die Median jedes Bildes korrigiert Vorspannungen mit Platte-zu-Platte Wirkungen verbunden. (C) Heatmap zeigt die Spearman Korrelationskoeffizient zwischen den Platten, bestätigt die Reproduzierbarkeit des Verfahrens. (D) Verteilung der Noten für die getesteten PPI und die L-DHFR-F [3] Kontrollen. Eine harte Schwelle kann auf die 95. Perzentil der eingestellt werden die L-DHFR-F [3] Verteilung an Hoch Vertrauen PPI identifizieren (durch eine gestrichelte vertikale vertretenLinie). (E) Rang um Verteilung der Durchschnittsnote von jeder Beute. Zuvor berichtete, physische Interaktionspartner von Nup82p im BIOGRID 35 sind durch Kreise gekennzeichnet und die in dieser Studie berichtet, sind durch rote Punkte gekennzeichnet. Die in (D) definierte Schwelle wird als gestrichelte Linie dargestellt. (F) Netzwerk, das die Hoch Vertrauen PPI in dieser Studie identifiziert. Blaue Kanten zeigen bereits berichtet körperliche Interaktoren (BIOGRID 35) und gelben Rändern zeigen einen zuvor unbekannten Interaktion mit Pex30. (G) Spot-Verdünnungsanalyse der PCA diploiden Stämme mit Nup82-DHFR F [1,2] und Beute-DHFR-F [3 ] Paare als physische Interaktionspartner von Nup82p in der vorliegenden Studie identifiziert. Wachstumstest wurde in DMSO-Medium (MTX Lösungsmittel, links) und MTX-Medium (rechts) durchgeführt. Negative Kontrollen aus Nup82-DHFR F [1,2] - Linker-DHFR-F [3] und Linker-DHFR F [1,2] - Linker-DHFR-F [3] und eine positive Kontrolle, bestehend aus ter starke Wechselwirkung zwischen zwei Leucin-Zipper-Einheiten (Reißverschluss-DHFR F [1,2] - Reißverschluss-DHFR-F [3]) waren eingeschlossen. Das Zellwachstum in MTX Medium besser als die Negativkontrollen sollten als eine physikalische Wechselwirkung interpretiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Aminosäure </td><td> Menge (g) </td></tr><tr><td> Adeninsulfat * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Tryptophan </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> L-Tyrosin </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-Phenylalanin </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> L-Glutaminsäure (Mononatriumsalz) </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-Asparagin </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> L-Threonin </td><td> 2.0 </td&gt; </tr><tr><td> L-Serin </td><td> 3,75 </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Histidin-HCl </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Arginin HCl </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Methionin * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Lysin * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Leucin </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Zurückgezogen beim Ausführen Standard PCA (dem in diesem Protokoll), können aber auch für andere Zwecke zugegeben werden. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Zusammensetzung des 10X -Lys / met / ade Drop-out in der MTX Mittelmengen sind für einen Liter 10x Drop-out. Sternchen bezeichnen die Verbindungen, die für die Standard-MTX Medium entzogen werden sollte, aber das kann für andere Zwecke zugegeben werden. Ergänzende. Tabelle 1: Kombinierte Daten aus den 12 Testplatten In Tabelle 1 sind die verketteten data von der ImageJ-Analyse unter Verwendung eines kundenspezifischen ImageJ Skript jede Zeile entspricht einer einzelnen Position auf jedem 1536-Arrays. Darüber hinaus hat jede Zeile mit der Information über die Bilddatei, DHFR Sammelteller annotiert, zu replizieren, ORF und Proteinnamen. Ergänzende Tabelle 2:. Durchschnittliche normalisierte Wachstums pro Stamm Tabelle 2 enthält die durchschnittliche Log 2 normalisierte Wachstums für jeden Stamm der Sammlung zusammen mit der Standardabweichung. Gefiltert Beute, Hits und bekannter physikalischer Interaktionspartner werden in separaten Spalten identifiziert.

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Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

13.2K Aufrufe.  Université Laval. Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA). 

Serie: Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen in Onion Zellen unter Verwendung des Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Forschung

Biologie

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Eine flüssige Phase Affinity Capture Assay Verwendung von magnetischen Kügelchen, um Protein-Protein Interaktion Studie: Das Poliovirus-Nanobody Beispiel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult Heads von Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Genomweite Kartierung der Drug-DNA-Wechselwirkungen in Zellen mit COSMIC (Vernetzung von kleinen Molekülen, um Chromatin isolieren)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...