تلطيخ المناعة الهستوفيميائي لأدمغة الفئران هو تقنية شائعة الاستخدام في أبحاث علم الأعصاب. ومع ذلك، قد تختلف جودة وموثوقية والاستنساخ لنتائج الأنسجة الدماغية بين الباحثين والمختبرات المختلفة. نقدم منهجية راسخة للدراسات النسيجية لأدمغة الفئران التي ثبت أنها قابلة للاستنساخ وموثوقة وفعالة.
المساعدة في إثبات الإجراء سيكون الدكتور تشونمي وانغ، أستاذ مساعد من مختبري بعد تأكيد التخدير الناجح في ثمانية إلى 16 أسبوعا من العمر C57 أسود / 6J الماوس، إصلاح الماوس على لوحة رغوة وجعل شق سطحي طولي على طول خط الوسط على الصدر والبطن، ثم تحريك الجلد جانبا لفضح جدار العضلات من الصدر والبطن. بعد ذلك، قم بإجراء شق في طبقة العضلات لكشف الكبد والأمعاء. ثم، وذلك باستخدام مقص، وقطع القفص الصدري لفتح الصدر وفضح القلب والرئتين.
باستخدام ملقط الهيموستاتيكي، اسحب القفص الصدري جانبا لتوسيع منطقة العمل. مقبل. لوضع قنية النتوئة ، واختراق البطين القلب الأيسر مباشرة مع قنية حادة وإدراجه بعناية في الشريان الأورطي الصاعد. وضع دبابيس حول اقتران القنية والأنابيب إلى جانب على لوحة الرغوة لإصلاح القنية في مكان أثناء التشوه، والمضي قدما في خفض الأذين الأيمن للسماح لتدفق الدم من الدورة الدموية.
للتشويش مع المالحة، بدوره على مفتاح الضغط المالحة وثقب الماوس عبر القلب مع 40 إلى 60 ملليلتر من المالحة. مراقبة تدفق من الأذين الأيمن ولون الكبد عن كثب. بعد ذلك ، للتشويش مع الفورماليين ، قم بإيقاف تشغيل مفتاح الضغط المالح وتشغيل مفتاح ضغط الفورماليين لتشويش الماوس مع 40 ملليلتر من الفورماتين المحايد المخزنة بنسبة 10٪.
مراقبة أطراف الحيوان للحصول على أدلة على الهزات. لعزل الدماغ، استخدم مقص لإزالة الرأس وإجراء شق الخط الأوسط على طول integument لفضح الجمجمة، ثم تقليم قبالة الجلد والعضلات المرفق. بعد ذلك، وجعل قطع في التلال المدارية ووضع نهاية حادة من مقص قزحية العين في ماغنوم foramen.
تقدم المقص على طول السطح الداخلي للجمجمة ، مع الحفاظ على الضغط التصاعدي لتجنب تلف الدماغ. ثم، وإزالة بعناية العظام الجدارية والجبهية السحايا قبل إزالة الدماغ من الجمجمة المفتوحة. ضع الثلج الجاف فوق لوحة تعديل الارتفاع من ميكروتوم منزلق وانتظر حتى يظهر الصقيع الأبيض ، ثم انشر بعناية خمسة ملليلترات من السكروز بنسبة 30٪ فوق اللوحة لتشكيل طبقة قاعدة صلبة بعد تجميد السكروز.
بعد ذلك، ضع جميع عينات الدماغ أفقيا في خط أعلى قاعدة السكروز مع 500 ميكرولتر من السكروز بنسبة 30٪. بعد خمس إلى عشر دقائق من التجمد، عندما يصبح الدماغ صلبا وأبيض، قم بتقليم الدماغ حتى يتم الوصول إلى الطبقة أو المنطقة المطلوبة، ثم انتقل من وضع القطع إلى وضع التغذية وقسم أنسجة الدماغ لتوليد أقسام سمكها 25 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بإعداد لوحة من 48 بئرا مليئة ب PBS ووضع علامة على خمسة آبار لدماغ فأر واحد.
باستخدام فرشاة الطلاء، وجمع قسم واحد ووضعه في بئر واحد، ثم جمع القسم اللاحق من نفس الماوس ووضعه في البئر الثاني. كرر الإجراء حتى يتم الوصول إلى البئر الخامس وضع الأقسام من 6 إلى 10 في البئر الأول إلى الخامس ، وهلم جرا. ضع مصفاة الخلية في بئر واحد من لوحة ثقافة الخلايا سداسية البئر مليئة برنامج تلفزيوني و, باستخدام فرشاة الطلاء, نقل سلسلة واحدة من أقسام الدماغ في مصفاة الخلية.
شطف هذه المقاطع في برنامج تلفزيوني عن طريق نقل مصفاة الخلية إلى بئر أخرى مليئة برنامج تلفزيوني على شاكر. ثم، نقل أقسام الدماغ من مصفاة الخلية إلى أنبوب 1.5 ملليلتر تحتوي على ملليلتر واحد من WFA المسمى البيوتين واحتضان على منصة هزاز في 50 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح سابقا، ثم نقل المقاطع إلى أنبوب يحتوي على ملليلتر واحد من محلول streptavidin-DAYLIGHT 488 واحتضان لمدة ساعتين على منصة هزاز.
بعد شطف أقسام الدماغ مع برنامج تلفزيوني مرة أخرى، واحتضان لهم في حجب العازلة لمدة ساعتين، تليها الحضانة في الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها على منصة هزاز. في اليوم التالي ، بعد شطف PBS ، احتضان المقاطع في الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعتين. ملء اثنين من أطباق بيتري مع 100 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل جميع أقسام الدماغ من مصفاة واحدة في الطبق الأول.
محاذاة أقسام الدماغ في ترتيب التشريح العصبي من caudal إلى rostral. ثم، غمر شريحة واحدة في الطبق الثاني مع نهاية واحدة إمالة قليلا مع موقف، واستخدام فرشاة الطلاء غرامة، ووضع بلطف قسم الدماغ فقط تحت واجهة العازلة الهواء على الشريحة المائلة. بعد ذلك ، باستخدام ماصة نقل ، قم بإزالة المخزن المؤقت ببطء وبلطف لخفض مستواه حتى يكون قسم الدماغ فوق واجهة المخزن المؤقت للهواء تماما.
استمر في تكرار هذه العملية حتى يتم الوصول إلى أسفل الشريحة ويتم تحميل كافة المقاطع على الشريحة. للتصوير، قم بتشغيل الماسح الضوئي والكمبيوتر، ثم ضع الشرائح في حامل الشريحة مع جهاز التحميل، وأدخل الحامل في الماسح الضوئي. افتح البرنامج للماسح الضوئي، واختر موقع التخزين المناسب وملف تعريف المسح الضوئي.
ابدأ فحص المعاينة بالنقر على الزر بدء معاينة الفحص. بعد الفحص، افتح معالج الكشف عن الأنسجة، وحلق حول المناطق التي تهم التصوير. بعد اختيار المناطق للتصوير، انقر على زر بدء المسح الضوئي وانتظر حتى ينتهي الجهاز من المسح الضوئي.
تحقق من ملف النتائج ثم قم بتصدير الصور. تظهر هنا صور مضانة المناعة والكيمياء المناعية التمثيلية لأقسام دماغ الفأر التاجي في Bregma-negative 0.82 ملليمتر ، مما يعرض توزيع wisteria floribunda agglutinin و arginine vasopressin و DAPI. ويلاحظ إشارات الوستارية floribunda agglutinin في المنطقة perifornical من تحت المهاد الأمامي ونواة الريتيicular، في حين لوحظت إشارات أرجينين فاسوبريسين في نواة paraventricular.
عند تجربة هذا البروتوكول لأول مرة، نقترح تنفيذه تحت إشراف باحث متمرس. سيساعد البروتوكول على توليد نتائج النسيجية المثلى والمتسقة بين مختلف الباحثين والمختبرات، وسيكون بمثابة مرجع للمبتدئين الذين يتعلمون هذه التقنية.
