Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 هو بروتين حركي ثنائي الاتجاه. يتحرك Cin8 في اتجاه نهاية ناقص الأنابيب الدقيقة كجزيء واحد ، ويغير الاتجاه في ظل عدد من الظروف التجريبية المختلفة. الهدف العام من بحثنا هو فهم آلية الحركة ثنائية الاتجاه من خلال دراسة العوامل والعناصر الهيكلية التي تنظم الحركة ثنائية الاتجاه ل Cin8.
يشرح هذا البروتوكول بشكل شامل تنقية Cin8 كامل الطول من نوع GFP في خلايا الخميرة ، وفحص حركية الجزيء الواحد ، والتحليل اللاحق للخصائص المتحركة للجزيئات المفردة ومجموعات Cin8. هذا الفصل مهم ، لأن اتجاه Cin8 يتأثر بتراكمه في مجموعات على الأنابيب الدقيقة. يمكن تكييف هذه التقنية بسهولة لتنقية البروتينات النووية الأخرى من الخميرة.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيقه على أي جسيمات فلورسنت تحتاج إلى فصلها إلى مجموعات حجم بناء على شدة التألق. ستوضح الإجراء الدكتورة ماري بوبوف ، مديرة مختبرنا ، والدكتورة ألينا غولدشتاين ليفيتين ، والدكتورة نوريت سيغلر ، زميلات ما بعد الدكتوراه. تاتيانا زفاجيلسكي ، مايان سادان ، وشيرا هيرشفينكل ، طلاب الدراسات العليا ؛ ونيتا يانير ، ياهيل أبراهام ، روي أفراهام ، وميتال هابرمان ، طلاب البكالوريوس من مختبرنا. للبدء ، تنمو خلايا Saccharomyces cerevisiae التي تحتوي على البلازميد للإفراط في التعبير عن Cin8-GFP-6His إلى مرحلة النمو الأسي في لتر واحد من الوسط الانتقائي للخميرة ، مع استكمال 2٪ raffinose عند 28 درجة مئوية.
ثم حث Cin8-GFP-6His على التعبير الزائد عن طريق إضافة 2٪ من الجالاكتوز ، ومراقبة نمو زراعة الخميرة عن طريق قياس الامتصاص عند 600 نانومتر. بعد خمس ساعات من إضافة الجالاكتوز ، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الخلايا في مخزن التحلل العازل ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل.
بعد ذلك ، باستخدام هاون ومدقة مبردة ، قم بطحن الخلايا المجمدة في النيتروجين السائل. استمر في إضافة النيتروجين السائل أثناء الطحن ، بحيث تظل المستخلصات مجمدة. راقب تحلل الخلايا تحت مجهر تباين التداخل التفاضلي أو الطور التفاضلي.
ثم إذابة الخلايا الأرضية ، والطرد المركزي لهم. قم بتحميل المادة الفائقة على عمود تدفق الجاذبية المملوء بملليلترين من النيكل NTA ، وقم بموازنته مسبقا باستخدام مخزن مؤقت للتحليل. دع السوبرناتانت يتدفق عبر العمود.
اغسل العمود بخمسة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتحلل ، متبوعا بخمسة أحجام أعمدة من المخزن المؤقت للتحلل مع إيميدازول 25 ملليمولار. ثم قم بإلغاء Cin8-GFP-6His مع المخزن المؤقت للاستخراج. قم بتحليل العينات التي تم التخلص منها عن طريق تجزئة SDS-PAGE ، متبوعة بتلطيخ Coomassie الأزرق وتحليل اللطخة الغربية التي تم فحصها باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل GFP.
بعد تجميع الكسور التي تحتوي على Cin8-GFP-6His، قم بتنقيتها بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم بمعدل تدفق قدره 0.5 ملليلتر في الدقيقة، وحد ضغط عمود يبلغ 1.5 ميغاباسكال. في وقت واحد مراقبة الامتصاص عند 280 نانومتر. جمع الكسور المقابلة ل Cin8-GFP tetramer وتحليلها بواسطة SDS-PAGE والنشاف الغربي.
ثم قم باقتباس الكسور المحددة ، ثم قم بتجميدها ، وتخزينها حتى الاستخدام عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لبلمرة وتثبيت البيوتين والرودامين المسمى microtubules ، امزج مكونات التفاعل في أنبوب 1.5 ملليلتر ، واحتضن الخليط لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. ثم أضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين الدافئ ، واخلطه بعناية ، وأجهزة الطرد المركزي.
تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات بعناية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين الدافئ. ثم قم بتخزين التعليق عند 28 أو 37 درجة مئوية. افحص الأنابيب الدقيقة باستخدام مجهر التألق ، باستخدام قناة الرودامين 647 نانومتر.
بعد ذلك ، قم بإزالة الورق الواقي من شرائط الشريط ووضع غطاء مائل على الشرائط لإنشاء ثلاث غرف تدفق بحجم 10 ميكرولتر. ثم قم بإجراء طلاء avidin للغطاء عن طريق الإضافة المتسلسلة للكواشف المشار إليها. احتضن الغطاء لمدة ثلاث إلى خمس دقائق قبل غسله ب 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين.
بعد ذلك ، قم بتوصيل الأنابيب الدقيقة البيوتينيل بأغطية b-BSA / avidin-المغلفة عن طريق إدخال 20 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة في غرفة التدفق. احتضن الشرائح مع توجيه الغطاء لأسفل في غرفة الرطوبة المظلمة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الشرائح ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت العام للتوبولين.
بعد ذلك ، ضع 30 ميكرولترا من مزيج تفاعل الحركة متبوعا بمحركات Cin8-GFP المخففة في 20 ميكرولتر من مزيج تفاعل الحركة في غرفة التدفق ، وانتقل على الفور إلى تصوير حركة المحركات على طول الأنابيب الدقيقة. لتصوير الحركة الحركية ، ضع قطرة من زيت الغمر على هدف المجهر ، ثم ضع غرفة التدفق على مرحلة المجهر الفلورسنت ، مع مواجهة الغطاء للهدف. قم بتشغيل قناة الرودامين للتركيز على الأنابيب الدقيقة المتصلة بسطح الغطاء.
بعد ذلك ، باستخدام برنامج ImageJ Micro-Manager ، احصل على الصورة بتعريض ضوئي يبلغ 20 مللي ثانية. بعد ذلك ، قم بتشغيل قناة GFP واحصل على 90 صورة بفاصل زمني مع فاصل زمني مدته ثانية واحدة وتعرض ضوئي يبلغ 800 مللي ثانية. في برنامج ImageJ Fiji ، افتح فيلم الفاصل الزمني وصورة حقل microtubule المقابلة.
قم بمزامنة هاتين النافذتين عن طريق اختيار تحليل، متبوعا بالأدوات ومزامنة Windows. للحصول على كيموجراف، قم بتمييز أنبوب دقيق واحد باستخدام خيار الخط المجزأ. ثم، من تحليل، حدد علامة التبويب متعدد Kymograph.
لتحديد حجم الكتلة لجزيئات Cin8-GFP ، قم بإجراء طرح الخلفية وتصحيحها للإضاءة غير المتساوية بالنقر فوق عملية ، متبوعة بطرح الخلفية. اضبط نصف قطر الكرة المتدحرجة على 100 بكسل، وتحقق من خيار القطع المكافئ المنزلق. ثم تتبع محرك Cin8-GFP محدد غير متحرك باستخدام المكون الإضافي TrackMate لبرنامج ImageJ Fiji.
اختر المكونات الإضافية ، متبوعة بالتتبع ، و TrackMate ، وكاشف LoG ، وتعقب LAP البسيط لمتابعة متوسط كثافة التألق لمحرك Cin8-GFP كدالة للوقت داخل دائرة نصف قطرها أربعة بكسل. بعد تكرار الإجراء لمحركات Cin8-GFP المختلفة ، ارسم كثافة التألق كدالة للوقت. بعد ذلك ، لتتبع حركة جزيئات Cin8-GFP على طول مسارات microtubule ، قم بقص الأنابيب الدقيقة المراد تحليلها في تسلسل الفاصل الزمني للإطارات المسجلة عن طريق تمييزها باستخدام أداة المستطيل والنقر فوق صورة ، متبوعة ب Crop.
اختر جسيم Cin8-GFP الفلورسنت للتحليل. سجل إحداثيات الجسيمات في كل إطار من تسلسل الفاصل الزمني باستخدام أداة النقطة وخيارات القياس. وبالمثل ، سجل إحداثيات جزيئات الفلورسنت الأخرى في تسلسل الفاصل الزمني.
ثم قم بتعيين حجم الكتلة لجميع جزيئات Cin8-GFP التي تم فحصها في الإطار الأول من ظهورها ، كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، باستخدام الصيغة المشار إليها وإحداثيات حركة Cin8-GFP المحددة ، احسب إزاحة Cin8-GFP في كل نقطة زمنية فيما يتعلق بالإحداثيات الأولية. من قيم الإزاحة هذه، احسب الإزاحة لجميع الفواصل الزمنية الممكنة لجسيم Cin8-GFP محدد.
كرر الإجراء لجميع جسيمات Cin8-GFP التي تم فحصها. وأخيرا، ارسم متوسط الإزاحة لجميع جسيمات Cin8-GFP التي تم فحصها مقابل الفاصل الزمني، وقم بإخضاعها لتناسب خطي. يمثل ميل هذا التناسب متوسط سرعة جسيمات Cin8-GFP المتحركة.
تظهر هنا الخصائص الحركية لبروتين المحرك ثنائي الاتجاه Cin8 بأحجام عنقودية مختلفة على الأنابيب الدقيقة المفردة. لكل فئة من فئات حجم المجموعة ، تم استخراج أكثر من 40 مسارا من Cin8-GFP الفردي من التسجيلات. أظهر رسم متوسط إزاحات الجزيئات المفردة ومجموعات محركات Cin8 كدالة للفاصل الزمني أن جزيئات Cin8-GFP المفردة تتحرك بطريقة أحادية الاتجاه ناقص النهاية موجهة بسرعة عالية.
في المقابل، تظهر مجموعات Cin8 سرعة أقل وحركية أعلى ثنائية الاتجاه. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، يجب استخدام بروتين المحرك عالي النقاء لتجنب أي تلوث يمكن أن يؤثر على التجمع الحركي. عند تحليل شدة التألق الحركي ، من المهم فحص المحركات في الإطار الأول الذي تظهر فيه ، لتجنب تأثير التبييض الضوئي.
عند دراسة حركية المحركات ثنائية الاتجاه ، من المهم للغاية تحليل الجزيئات والعناقيد الفردية بشكل منفصل ، لأن التجمع الحركي هو أحد العوامل الرئيسية التي تؤثر على الاتجاه الحركي.
