وقد دعم هذا العمل منحة المعاهد الوطنية للصحة GM118085، وجزؤا من مؤسسة روبرت ويلش (منحة F-1811 إلى R.M.H.).

1. عزل المسوخ القامع في سلالات نقص الحركة
ملاحظة: استخدم هذا الأسلوب ك "catch-all" واسعة لتحديد الطبيعة العامة للعيب الحركة.
<ol><li>إعداد لوحة لينة أجار ملاحظة: لينة أجار، ويشار إليها أيضا باسم الحركة- أو السباحة أجار، هو agar نسبة منخفضة (~0.2-0.35٪ ث /v)، وتستخدم منذ فترة طويلة لاحصاء chemotaxis31،32.<ol>
<li>إضافة 3 غرام من باكتو أغار (0.3٪ ث / v) و 20 غرام من LB إلى قارورة أسفل جولة 2 L. إضافة 1 لتر من DDH2O (الماء المقطر المزدوج) إلى القارورة وخلط بالتساوي تعليق باستخدام قضيب اثارة ولوحة التحريك المغناطيسي.</li>
		<li>أوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.</li>
		<li>السماح لتبرد مع التحريض لطيف باستخدام قضيب / لوحة على النحو الوارد أعلاه. عندما تصل درجة الحرارة إلى حوالي 50 درجة مئوية، صب 25 مل في أطباق بيتري العقيمة (100 مم × 15 ملم)، والسماح للأجار المنصهر لضبط مع غطاء في مكان لمدة 1 ساعة على الأقل، للاستخدام في غضون 16 ساعة.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد الثقافة والتلقيح وعزل المسوخ القامعة ملاحظة: E. القولونية تلقيح في وسط وسائل الإعلام الغنية بالمغذيات تتوطد مع أجار لينة تستهلك المواد الغذائية محليا، وخلق التدرج المغذيات التي يتبعونها. كما أنها تتحرك إلى الخارج، تعريف 'حلقات' تظهر(الشكل 1A)،والتي ترتبط الكيميائي محددة التراكتات البكتيريا تستجيب ل. يمكن أن العيوب في نظام chemotaxis أو المكونات الهيكلية للمحرك flagella المساس بالأداء في هذا المقايسة. في كثير من الأحيان ، تنشأ المسوخ ذات ميزة الحركة أثناء الفحص ، ويمكن رؤيتها تخرج من نقطة واحدة أو من نقاط متعددة على طول محيط الحلبة ، من حيث "توهج"(الشكل 1C). وسوف يلاحظ المرء أن الحافة الخارجية من جبهة السباحة يتناقض بسهولة ضد أجار الناعمة العذراء غير المنقوطة.<ol>
<li>تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من سلالة الحركة الناقصة المطلوبة في 5 مل من مرق لينوكس (LB; 10 غرام / لتر تريبتوني, 5 غرام / لتر استخراج الخميرة, و 5 غرام / لتر NaCl, جدول المواد) في 30 درجة مئوية مع اهتزاز أفقي (220 r.p.m.). في اليوم التالي، والثقافة الفرعية (1:100 التخفيف) في LB الطازجة، وتنمو في ظل نفس الظروف إلى مرحلة الأسي (OD600 من 0.6).</li>
		<li>تلقيح 6 ميكرولتر من الثقافة في وسط لوحة لينة أجار (1.1) باستخدام ماصة، ودفع طرف عقيم محملة في أجار لطرد بلطف محتويات. نقل إلى 30 درجة مئوية واحتضان (الشكل 1B)، حتى حركية 'مشاعل' واضحة، المنبثقة من نقطة التطعيم أو محيط حلقات الحركة، وعادة في 24-36 ح (الشكل 1C). ملاحظة: في المقايسات الحركة، تلقيح سلالة من النوع البري جنبا إلى جنب مع عزل متحولة للمقارنة. هذه السلالة البرية من نوع سوف تظهر حلقات chemotactic متحدة المركز مميزة (الشكل 1A) وملء لوحة في غضون 8-10 ساعة.</li>
		<li>استخدام حلقة سلكية معقمة لرفع الخلايا من منطقة "مضيئة" وشرائط لتنقية مستعمرات واحدة على لوحة أجار الصلب LB (LB أعدت على النحو الوارد أعلاه، توطدت مع 15 غرام / لتر bacto-أغار).</li>
		<li>اختيار مستعمرات واحدة من لوحة خط باستخدام حلقة سلك عقيم وإعادة تنقية عن طريق streaking لمستعمرات واحدة لضمان عزل مستعمرة "نقية".</li>
	</ol></li>
	<li>تأكيد وتوصيف المسوخ القامعة
	<ol>
<li>تأكد من أن متحولة القامع المعزولة (ق) قد استعادت الحركة. إعداد لوحات لينة أجار (1.1)، والثقافات لسلالات من الاهتمام (كما هو الحال في 1.2.1)، بما في ذلك البرية من نوع وبدء 'الحركة ناقصة' سلالة للمقارنة.</li>
		<li>تلقيح الصفائح (كما في 1.2.2) واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 8-10 ساعة.</li>
		<li>تسجيل قطر الحلقة الخارجية (حافة الدائرة) ومقارنة لتحديد أي من العزلات قد استعادت إلى حد كبير الحركة. ملاحظة: يوصى بتصوير اللوحات طوال الدورة الزمنية للتجربة. للحصول على أفضل النتائج، استخدم جهاز "دلو الضوء"30، حيث يتم تركيب كاميرا رقمية فوق مصدر ضوء لتحسين الإضاءة لقياس قطر مستعمرة السباحة وتمييزها عن أجار غير المكتونة.</li>
		<li>يتم التحقق من عزل الموضوع إلى WGS كما هو مطلوب ، مما يسمح ب "تغطية تسلسلية" كافية لتحديد الطفرات التي أعادت وظيفة النوع البري بشكل إيجابي.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تحديد السلوك الحركي flagella عن طريق الربط الخلية
ملاحظة: استخدم هذا الأسلوب عندما يظهر سلوك التشغيل-tumble العادي (chemotaxis) للخطر.
<ol><li>
إعداد الثقافة والقص flagella
	<ol>
<li>إعداد ثقافة المرحلة الأسية لسلالة الاهتمام كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.</li>
		<li>بيليه 10 مل من الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 3 دقائق قبل إعادة تعليق في 10 مل من العازلة حركية مرشح معقمة (MB; 10 م ص البوتاسيوم الفوسفات العازلة [0.0935 M K2HPO4، 0.0065 M KH2PO4، درجة الحموضة 7.0] ، 0.1 mM EDTA [درجة الحموضة 7.0] ، 10 MM NaCl ، 75 mM KCl). ملاحظة: MB يدعم الحركة، ولكن لا يدعم النمو البكتيري</li>
		<li>كرر الخطوة 2.1.2 مرتين أخريين قبل إعادة تعليق بيليه النهائي في 1 مل من ميغابايت.</li>
		<li>نقل تعليق الخلية إلى حقنة 1 مل وإرفاق إبرة 23G حتى النهاية. تجميع جهاز حقنة / إبرة متطابقة وإرفاق اثنين معا عن طريق 6 بوصات من أنابيب البولي ايثيلين (القطر الداخلي من 0.58 ملم) مغمد بإحكام على كل طرف إبرة.</li>
		<li>القص flagella (فهي هشة وكسر بسهولة) عن طريق تمرير بلطف تعليق الخلية ذهابا وإيابا من حقنة واحدة إلى أخرى 50x، مع توقف 1 دقيقة بين كل 10 يمر.</li>
		<li>الطرد المركزي الخلايا المقص في 2000 س ز لمدة 3 دقائق وإعادة الإنفاق في حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر من ميغابايت.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد الشرائح وربط الخلايا
	<ol>
<li>إعداد غرفة تثبيت الخلية عن طريق التراص 18 ملم × 18 مم coverslip على 3 بوصة × 1 بوصة × 1 مم الزجاج مجهر الشريحة، مفصولة شريط على الوجهين(الشكل S1).</li>
		<li>اغسل الغرفة بحل بولي ليسين بنسبة 0.01٪ (ث/v) من خلال تطبيقها على الجزء العلوي من الغرفة. إمالة الحافة السفلية (تدفق الأغطية مع شريحة المجهر) على ممسحة مهمة (ورقة الأنسجة) للمساعدة في رسم الحل من خلال الغرفة(الشكل S1). ثم احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.</li>
		<li>غسل الغرفة ثلاث مرات مع 40 ميكرولتر من ميغابايت باستخدام كما هو موضح في الخطوة 2.2.2</li>
		<li>أضف 40 ميكرولتر من تعليق الخلية المقص (المعد أعلاه) إلى أعلى الغرفة واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا بالتعلق بالزلاقة.</li>
		<li>قم بتدفق الغرفة برفق مع 40 ميكرولتر من ميغابايت كما هو الحال في 2.2.3 لإزالة الخلايا غير المرتبطة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تسجيل دوران الخلية وتحديد كميتها
	<ol>
<li>نقل الشريحة المجهر محملة الخلايا المربوطة إلى مرحلة المجهر.</li>
		<li>باستخدام المجهر على النقيض من المرحلة وهدف 100x ، مسح السكان للخلايا التي يتم إصلاحها في مكانها ، وتناوب على محور واحد ، أي تناوب سلس على نقطة ثابتة بدلا من تقديم في زاوية حيث تتحرك الخلية داخل وخارج التركيز(فيديو 1).</li>
		<li>استخدام المجهر التجاري والكاميرا المرتبطة بها. افتح البرنامج المرتبط، وتأكد من أن الخلايا ذات الاهتمام هي في التركيز وانقر فوق الحصول على الفيديو لتسجيل دوران الخلية لمدة دقيقة واحدة (بمعدل 10 إطارات في الثانية أو أعلى).</li>
		<li>من تشغيل الفيديو، قم بتحديد عدد الدورانات الكاملة في الدقيقة وعدد المرات التي تغير الخلية اتجاهها (تبديل التردد). ملاحظة: قد تكون سرعات الدوران وتردد التبديل سريعين جدا لقياسها بالعين لذلك يوصى باستخدام برامج الفيديو التي توفر تشغيلا بطيءا / دقيقا ، أو تعتمد نظاما برمجيا آليا لتحديد أنماطالدوران 33. والبديل هو زيادة لزوجة ميغابايت باستخدام السليلوز الميثيل (أو وكيل مماثل) للمساعدة في إبطاء وحل دوران البكتيريا أسرع أو تعويض عندما الكاميرات مع انخفاض framerates قيد الاستخدام.</li>
		<li>كرر الخطوة 2.3.2 مع التكرارات البيولوجية لتجميع تمثيل السكان من الفائدة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. إعداد أسراب في عملية فحص عبور الحدود
ملاحظة: استخدم هذه الطريقة لتقييم تأثير طفرة أو حالة على الحركة الجماعية. سرب أغار يشير إلى أجار حيث النسبة المئوية عادة ما تكون أعلى من تلك الناعمة أجار. في أجار لينة (0.3٪)، تسبح الخلايا بشكل فردي داخل أجار. في سرب أجار (0.5٪ وما فوق)، تتحرك الخلايا كمجموعة على السطح. في حين يجب استخدام لوحات سرب كما هو مفصل هنا، لوحات السباحة لها عمر أطول الرف، ويمكن استخدامها لعدة أيام. تفضيلنا الشخصي هو استخدام في 1-2 أيام.
<ol><li>
إعداد سرب أجار
	<ol>
<li>إضافة 5 غرام من إيكن أغار (0.5٪ ث / v) و 20 غرام من LB إلى قارورة أسفل جولة 2 L. إضافة 1 لتر من DDH2O إلى القارورة وخلط بالتساوي تعليق باستخدام قضيب اثارة ولوحة التحريك المغناطيسي.</li>
		<li>أوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.</li>
		<li>السماح لتبرد مع التحريض لطيف لتجنب أي فقاعات الهواء باستخدام قضيب / لوحة على النحو الوارد أعلاه. عند حوالي 50 درجة مئوية، أضف الجلوكوز المعقم للفلتر لتركيز نهائي قدره 0.5٪.</li>
		<li>صب 25 مل في أطباق بيتري العقيمة (100 ملم × 15 ملم) والسماح لتعيين في درجة حرارة الغرفة لمدة 14 ساعة على الأقل وليس أكثر من 20 ساعة. لا تخزن للاستخدام في المستقبل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تلقيح واحتضان لوحات سرب
	<ol>
<li>تلقيح 6 ميكرولتر من ثقافة منتصف الأسي (أعدت كما هو الحال في 1.2) عن طريق اكتشاف على رأس أجار.</li>
		<li>اترك الغطاء لمدة 5-10 دقائق واستبدله عندما يجف ال inoculum إلى سطح أجار.</li>
		<li>حضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 8 ساعة. تجنب إغراء لفحص التقدم سرب عن طريق إزالة الغطاء، وهذا سوف يسهم في تجفيف أجار وضعف يحتشدون. ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة حسب النمط الظاهري للإجهاد. قد تعوق بعض الطفرات المعزولة القدرة على الاحتشاد وستتطلب نسبة أقل من أجار أو فترة حضانة أطول.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد لوحات المقايسة لعبور الحدود ملاحظة: يستخدم هذا المقايسة طبق Petri معدل، حيث يقوم قسمة بلاستيكية (حدود) بإنشاء حجرتين، بدلا من غرفة واحدة(الشكل 2A). يمكن إعداد كل غرفة بشكل مستقل عن الأخرى ، مما يوفر ظروفا مختلفة للحشد ، قبل "ربط" الاثنين. اعتمادا على التصميم التجريبي، يمكن إعداد الغرفة الأولى (المعينة إلى اليسار) إما مع أجار السباحة (0.3٪ ث / v) أو سرب أجار (0.5٪ ث / الخامس) من حيث يمكن للبكتيريا الهجرة عبر الحدود إلى الغرفة اليمنى التي تحتوي على سرب أجار +/- أي ملحق المطلوبة أو التحدي (على سبيل المثال، المضادات الحيوية). عادة ما يتم قياس الهجرة على أي من أجار / مقارنة عن طريق تسجيل أوسع قطر من الاستعمار البكتيري (من الحافة إلى الحافة) من النقطة الأصلية للتلقيح.<ol>
<li>إعداد أجار السباحة كما هو موضح في 1.1 إذا لزم الأمر.</li>
		<li>إعداد سرب أجار كما هو موضح في 3.1.</li>
		<li>صب ~ 30 مل من أجار سرب (مع مكملات المطلوب إذا لزم الأمر) في الغرفة اليمنى من طبق بيتري مزدوجة المقصورة (100 ملم × 15 ملم)، لدرجة أنه هو مستوى مع مقسم البلاستيك بين الغرف، ولكن لا تفيض في اليسار(الشكل 2B).</li>
		<li>بعد أن تصلب أجار، وملء الغرفة اليسرى مع ~ 30 مل من السباحة أو سرب أجار، مرة أخرى إلى نقطة الاتصال مع الفجوة البلاستيكية(الشكل 2C). قبل أن يحدد، استخدم طرف ماصة معقمة لسحب بلطف أجار عبر الحدود لربط الجانبين مع جسر أجار طويل القامة ~ 1 ملم الذي يمتد على طول الفجوة(الشكل 2D).</li>
		<li>السماح للطبق لتجف في درجة حرارة الغرفة (3.1). ملاحظة: طريقة بديلة لإنشاء جسر هو السماح للغار الغرفة اليسرى لتجف ثم ماصة ببطء ~ 100 ميكرولتر من أجار سرب المنصهر على طول المقسم البلاستيك لسد الغرفتين (3.4). تلقيح لوحات على الغرفة اليسرى كما هو مفصل أعلاه للسباحة (1.2.2) أو سرب (3.2) أجار، قبل احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة، أو حتى أسراب حققت تقدما كافيا على الغرفة اليمنى للسماح بإجراء مقارنات بين سلالات الاهتمام.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

وقد ساهم عزل وتوصيف الطفرات القامعة بنجاح في تحديد المكونات الرئيسية لنظام chemotaxis35،36،37، وكذلك الآلات الحركية نفسها38،39،40. 11- ومن المهم، أثناء استخدام البروتوكول 1، إدراج نسخ متماثلة مستق...

البكتيريا تستخدم العديد من الزوائد للحركة والتشتت في منافذها الإيكولوجية1. حركية Flagella يحركها هو أسرع من هذه، وتعزيز استعمار محلى مواتية استجابة للإشارات البيئية، والمساهمة بشكل كبير في القدرة المسببة للأمراض من بعض الأنواع2،3. يمكن للبكتيريا flagellated السباحة بشكل فردي في السائل السائبة، أو سرب كمجموعة على سطح شبه صلب4. يلتصق flagella خارج الخلية بمحركات دوارة مضمنة في الغشاء ويقودها ، والتي تسخر قوة تدرجات الأيونات لتوليد عزم الدوران الذي يسبب الدوران1،2،4،5،6،7،8. في الإشريكية القولونية، التي تعمل محركاتها بعزم دوران ثابت9، يمكن تصنيف إخراج المحرك من حيث سرعة الدوران وتبديل الدوار بين اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة (CCW) واتجاه عقارب الساعة (CW). يعزز دوران اتفاقية الأسلحة التقليدية تشكيل حزمة flagellar متماسكة تدفع الخلية إلى الأمام (تشغيل) ، في حين أن التبديل العابر في اتجاه الدوران (CW) يتسبب في تفكيك الحزمة إما جزئيا أو كليا10، والخلية لإعادة توجيه اتجاه السباحة (تعثر). E. القولونية تشغيل عادة لثانية واحدة وتعثر لمدة عشر من الثانية. يتم التحكم في تبديل تردد الدوار أو "التحيز المتعثر" من خلال نظام الإشارات chemotaxis ، حيث تكتشف مستقبلات الشيمورسيبتس العابرةmembrane الإشارات الكيميائية الخارجية وتنقلها عبر الفوسفوريلاي إلى محرك flagellar لتمديد الأشواط استجابة للمجذبات ، أو قمعها استجابة للمواد الكيميائية السامة11،12. يتم فحص حركة السباحة في أجار ناعم بنسبة 0.3٪.
أثناء يحتشدون، البكتيريا التنقل على سطح شبه صلب كمجموعة كثيفة، حيث حزم من البكتيريا تيار في حركة الدوامةالمستمرة 2،13،14،15. E. أسراب القولونية المعرض تغيير علم وظائف الأعضاء chemosensory (انخفاض التحيز تعثر), سرعات أعلى, وارتفاع التسامح مع مضادات الميكروبات على الخلايا السباحة في السائل السائب16,17. أسراب تختلف في نشرها لعدد كبير من الاستراتيجيات التي تساعد على الحركة، بما في ذلك إنتاج السطحي، فرط التضخم، وإطالة الخلية2. يحتشدون يقدم البكتيريا ميزة تنافسية في كل من الإيكولوجية والإعداداتالسريرية 18،19،20. هناك فئتان من البكتيريا يحتشدون: أسراب المعتدلة، والتي يمكن أن سرب فقط على وسائل الإعلام توطدت مع 0.5-0.8٪ أجار، وأسراب قوية، والتي يمكن التنقل عبر تركيزات أجار أعلى21.
توجد مجموعة متنوعة من المقايسات لاستجواب حركة السباحة وتنظيمها. عندما تضعفها الطفرات أو الظروف البيئية ، فإن الحركة نفسها تقدم مجموعة قوية لتحديد طفرات القامع لكسب الوظيفة. يمكن أن تكون هذه القامعات عودة حقيقية للطفرة الأصلية ، أو العودة الزائفة ، حيث تستعيد الطفرة الثانية الوظائف. ويمكن تحديد هذه المسوخ من خلال تسلسل الجينوم كله (WGS). البديل لاختيار القامع غير المتحيز هو استراتيجية الطفرات المستهدفة المتحيزة (على سبيل المثال ، تولد الطفرات PCR). وغالبا ما تسلط هذه المنهجيات الضوء على وظيفة جهاز الحركة أو تنظيمه البيئي. إذا كان الهدف هو دراسة الوظيفة الحركية ، فإن استعادة الحركة البرية كما تقاس بالنعومة قد لا تشير بالضرورة إلى استعادة إخراج المحرك البري. يمكن أن يكون المقايسة التي تربط الخلايا، والتي يتم فيها ربط الخلايا بسطح زجاجي بواسطة علم واحد ويتم رصد دوران جسم الخلية لاحقا، هي المقايسة الأولية للاختيار لتقييم السلوك الحركي. على الرغم من أن أكثر منهجيات متطورة متاحة الآن لرصد خصائص المحرك، المطلوبة عالية السرعة الكاميرا انشاء وتطبيق حزم البرمجيات لتحليل الحركة تحد من استخدامها على نطاق واسع22،23،24،25. يتطلب الفحص ربط الخلية فقط أن يتم قص flagella ، مما يسمح بتعلق خيوط قصيرة إلى شريحة زجاجية ، تليها تسجيل فيديو دوران جسم الخلية. على الرغم من أن السرعات الحركية المسجلة منخفضة في هذا المقايسة بسبب الحمل العالي الذي يمارسه جسم الخلية على flagellum ، إلا أن هذا الفحص ساهم مع ذلك في رؤى قيمة في الاستجابات الكيميائية26و27و28و29، ولا يزال أداة تحقيق صالحة كما هو موضح أدناه.
تشكل الحركة المحتشدة مجموعة مختلفة من التحديات للباحثين. اختيار القامع كسب وظيفة يعمل فقط في أسراب التي تنتج السطحي وفيرة وسرب بسهولة13. السطحية غير المنتجين مثل كولاي هي fastidious فيما يتعلق باختيار أجار، وتكوين وسائل الإعلام والرطوبة للبيئة2،13،14،21. وبمجرد تهيئة الظروف المحتشدة، فإن المقايسة17 لعبور الحدود هي منهجية مفيدة لاستجواب قدرة سرب على التنقل في ظروف جديدة/قاسية. على الرغم من أن البروتوكولات المعروضة أدناه تتعلق بالإشريكية القولونية، إلا أنه يمكن تكييفها بسهولة للتطبيق في الأنواع الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

الحركة أمر بالغ الأهمية لبقاء ونجاح العديد من الأنواع البكتيرية. توجد العديد من المنهجيات لاستغلال الحركة لفهم مسارات الإشارات ، لتوضيح وظيفة وتجميع أجزاء flagellar ، ودراسة وفهم أنماط الحركة. هنا نبين مجموعة من ثلاث من هذه المنهجيات. الحركة في أجار لينة هو الأقدم، وتقدم مجموعة قوية لعزل الطفرات القامع كسب الوظيفة في سلالات حركية ضعف، حيث يتم استعادة الحركة من خلال طفرة ثانية. ويمكن استخدام تقنية ربط الخلايا، التي استخدمت لأول مرة لإثبات الطبيعة الدوارة لمحرك flagellar، لتقييم تأثير تأثيرات الإشارات على سرعة المحرك وقدرته على تبديل الاتجاه الدوراني. أما المقايسة "العابرة للحدود" فهي أحدث عهدا، حيث يمكن تجهيز بكتيريا السباحة للانتقال إلى التحرك الجماعي كسرب. وتمثل هذه البروتوكولات مجتمعة نهجا منهجيا وقويا لتحديد مكونات آلية الحركة، وتوصيف دورها في مختلف جوانب السباحة والازحراب. ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة الحركة في الأنواع البكتيرية الأخرى.

تم تفصيل عزل الرجعيات الزائفة في سلالة الإشريكية القولونية التي تضعف حركتها بسبب المستويات العالية من جزيء الإشارات c-di-GMP ، في العمل الأخير من مختبرنا34. هذه السلالة (JP1442) تؤوي اثنين من الطفرات:Δ yhjH وΔ ycgR. YhjH هو فوسفوديستراز الأكثر نشاطا أن يحط ج دي GMP في الإشريك?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

تستخدم العديد من البكتيريا الحركة التي تحركها flagella للتنقل في بيئتها واستعمار المناطق المحيطة المواتية على حد سواء بشكل فردي وجماعي. يتضح هنا هو استخدام ثلاث طرق راسخة تستغل الحركة كأداة اختيار لتحديد المكونات / المسارات المساهمة في السباحة والحركة.

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K Views.  The University of Texas at Austin. تستخدم العديد من البكتيريا الحركة التي تحركها flagella للتنقل في بيئتها واستعمار المناطق المحيطة المواتية على حد سواء بشكل فردي وجماعي. يتضح هنا هو استخدام ثلاث طرق راسخة تستغل الحركة كأداة اختيار لتحديد المكونات / المسارات المساهمة في السباحة والحركة.

Video: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير<em&gt; الإشريكية القولونية</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في

تحديد بروتين في مجمعات

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent

الكشف عن لايف

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في

فوائد متعددة الأوجه من البروتين المشارك في التعبير

طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين