نشكر Dibbits بيرت لتقديم المساعدة التقنية. وتربية الحيوان وعلم الجينوم الفريق ، جامعة فاغينينغين ، هولندا ، استضافت بسخاء لنا في المختبرات الخاصة بهم. وشكر العاملين في مرصد الطيور Ottenby ، السويد ، لمحاصرة وأخذ عينات من البط البري ، في Hellström ماغنوس وجه الخصوص ، ماركوس دانييلسون ، ماجنوسون كريستوفر اندرسون وستينا. نشكر Sanne سفينسون ، Qvist Jonatan ولكل أكسل Gjöres للتصوير في Ottenby وCamon مانو للتصوير في المختبر. قدم دانيال Bengtson صور بطة جميلة لجزء الفيديو من هذا المنشور. ، ومواد مجانية أخرى من المكتبة العامة في مركز السيطرة على الأمراض صورة الصحة (فيل <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> كانت تستخدم) : إن صورة مجهرية الإلكترون (رقم 280 ؛ التي كتبها الدكتور إرسكين بالمر) والتوضيح (رقم 11823 ؛ من قبل دوغلاس الأردن) من فيروس الانفلونزا. وقدم الدعم المالي من قبل KNJV (رويال هولندا جمعيه الصيادين) ، وزارة الزراعة الهولندية ، وFaunafonds ومؤسسة Stichting دي Eik صناديق (سواء في هولندا) ، ومجلس الأبحاث السويدي (منحة رقم 2007-20774) والمفوضية الأوروبية Newflubird في تأسيس المشروع. وكانت المواد الكيميائية العزلة RNA هدية سخية من Ambion ، وشركة ، وشركة رنا. هذه هي مساهمة رقم 245 من مرصد Ottenby الطيور.

1. اصطياد البط وينظف المذرقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فخ تجريب البط من جنس أنس (أو غيرها من الطيور) في قفص من خلال جذب لهم البط إغراء أو الطعام ، ووضعها في صناديق متن بطاقة فردية. يجب أن تبقى وسائل النقل في الوقت مربع إلى الحد الأدنى ، على سبيل المثال ، عن طريق تركيب محطة حقل على مسافة قصيرة إلى الفخ. قد تختلف الظروف اللوجستية في كل دراسة. مشورة وموافقة لجنة أخلاقيات الحيوان ذات الصلة يجب أن يكون سعى لكل جديد انشاء. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن تكون عينات صياد الطيور بالرصاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخذ من البط من مربع من خلال عقد اجنحته مشددة لجسمها. عينة اسقاط الطازجة ، والتي سوف تكون حاضرة في معظم الحالات ، مباشرة من الجزء السفلي من مربع. يلتقطها مع مسحة معقمة وسائل تطبيق اتفاقية التجارة الحرة إلى بطاقة Whatman. إذا لم يكن كذلك ، إجراء مسح لالمذرقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره البطة على ظهرها. هذا يسمح بالوصول إلى مجرور ويسهل أخذ العينات. مجرور هو بنية جاحظ تقع أسفل البطن ، على مقربة من قاعدة الذيل. يمكن لشخص من ذوي الخبرة والاستمرار عينة من الطيور في نفس الوقت ، وإلا شخص ثان يمكن أن تساعد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بلاستيكية معقمة بعناية الرايون المسحة (كوبان ، إيطاليا) 1 سم تقريبا واجري دوامة طيف من مجرور. لفة المسحة مع السوائل من مجرور على سطح بطاقة Whatman اتفاقية التجارة الحرة. بعد الإفراج قد تم تنفيذ عينات فورية من الحيوان هو مرغوب فيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف بطاقات اتفاقية التجارة الحرة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 ساعة ، ثم تخزين كل عينة على حدة في أكياس من ورق (مثل المغلفات). من الممكن تخزين في درجة حرارة الغرفة ، وربما مع حبات السيليكا في المناخات الرطبة. يمكن إرسال واستقبال المؤسسات ضباط السلامة الأحيائية تصريح لإرسال بطاقات اتفاقية التجارة الحرة عن طريق البريد العادي ، لأن العوامل الممرضة تصبح خاملة على اتصال مع سطح البطاقة اتفاقية التجارة الحرة. </li></ol> 2. عزل الحمض النووي الريبي الفيروسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج المواد بما في ذلك اتفاقية التجارة الحرة بطاقة البراز / المذرقية السائل. ثلاثة أقراص لكمة مع هاريس الناخس 2 ملم ومكان كل تلك في بئر لوحة ريبونوكلياز 96well الحرة. بين كل عينة جديدة ونظيفة والناخس بعناية مع الكحول ، ودقة مسح كيم (Kimtech). دائما استخدام الضوابط الإيجابية والسلبية. ويمكن لمراقبة إيجابية تتألف من سلالة المختبرات تطبيقها حديثا إلى بطاقة اتفاقية التجارة الحرة ، أو عينة الطبيعية التي تعرف أن تسفر عن نتيجة إيجابية. كما سيطرة سلبية ، لكمة من أصل أقراص من اتفاقية التجارة الحرة بطاقة فارغة. بالإضافة إلى ذلك ، يغادر آخر مجانا بشكل جيد لمكافحة PCR في وقت لاحق تجربتك (مع المياه كقالب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 70μl استخراج الحمض النووي الريبي حل سريع (Ambion) والحرارة الختم لوحة (AbGene الحرارية السدادة). احتضان 5 دقائق على لوحة شاكر في درجة حرارة الغرفة مع سرعة قرر أن لا يسبب امتداد (وهذا يعتمد على نموذج لوحة شاكر المستخدمة ؛ اختبار مقدما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل الفيروسي RNA العزلة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة مع MagMAX - 96 طقم العزل الفيروسي RNA (Ambion). في سطور : أضف 130μl أعد تحلل / حل ملزم (من مجموعة) إلى كل بئر. 50μl نقل المواد المستخرجة اتفاقية التجارة الحرة إلى كل بطاقة جيدا. هزة لوحة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20μl مزيج حبة أعدت (من مجموعة) لكل عينة وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. هزة على سرعة تحديد مدة 5 دقائق. وسوف تربط جزيئات الحمض النووي الريبي لحبات المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى لوحة مغناطيسي 96 - جيدا تقف لالتقاط الخرز. اعتمادا على نموذج من الوقوف المغناطيسية المستخدمة ، وهذا يمكن أن يستغرق أكثر من 5 دقائق. عندما تحولت الحل واضحة تماما ، وإزالة وتجاهل طاف. ثم إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات مرتين مع الحل (1) وتغسل بمحلول غسيل مرتين 2 (من المجموعة). لكل من خطوات غسل 4 إضافة 150μl الحل على استعداد لغسل كل عينة ، يهز لمدة 1 دقيقة على سرعة تحديد ، نقل إلى لوحة الحامل المغناطيسي ، والتقاط حبات لمدة 5 دقائق (أو حتى حل واضح تماما) ، وإزالة تجاهل طاف. ثم إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي ، إضافة محلول الغسيل المقبل ، وتنفيذ الخطوات غسل سابقا. بعد الخطوة غسل الماضي ، وإزالة ما يصل إلى حل غسل الممكن والهواء الجاف الخرز في درجة حرارة الغرفة في لوحة شاكر 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50μl العازلة للشطف (من المجموعة) للافراج عن الحمض النووي الريبي من الخرز ويهز لمدة 4 دقائق على لوحة شاكر. التقاط حبات كما هو موضح سابقا. وطاف الآن يحتوي على الحمض النووي الريبي المعزولة التي هي على استعداد لتقديم الطلبات النهائية. </li></ol> 3. RT - PCR من الجينات مصفوفة AIV تنفيذ عكس النسخ PCR (RT - PCR) مع نظام من خطوة واحدة RT - PCR الوصول (Promega) في 25 ميكرولتر ردود الفعل (معدلة من كراوس وآخرون Fouchier 18 و 22 آخرون.) : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Nuclease المياه مجانا </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 العازلة </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> M52C التمهيدي 22 (10 ميكرومتر) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> M253R التمهيدي 22 (10 ميكرومتر) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 ملم) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV عكس الناسخ (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> TFL بوليميريز (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> عينة الحمض النووي الريبي </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> PCR في ظروف thermocycler Biometra T1 هي : عكس النسخ الأولية من 45 دقيقة عند 45 درجة مئوية ، تليها تمسخ دقيقة 2 الأولية في 94 و 40 درجة مئوية دورات : 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة و 56 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 68 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. استطالة 7 دقائق إضافية عند 68 درجة مئوية يختتم التضخيم. 4. الكشف عن منظمة العفو الدولية إيجابية العينات وتنقية شظايا المستهدفة من جل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 2μl للمنتج PCR مختلطة مع 2μl صبغ التحميل 5X (BioRad) والمياه 6μl على agarose هلام ٪ 1 (روش) ملطخة بروميد إيثيديوم 1 ٪ (2.5μl في جل 100 مل) من أجل الفحص المسبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل هلام لمدة 1 ساعة على 120V ، جنبا إلى جنب مع الحمض النووي معيار الحجم (100 تحميل EZ BioRad غليان سلم) ، وتصور مع هلام نظام التوثيق. انظر على سبيل المثال في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار العينات مع شظايا تتضخم في نطاق الحجم المتوقع (ما بين 200 و 300 سنة مضت بي بي (تفتيت الهدف هو 244 سنة مضت). تحميل كامل حجم تفاعل PCR (التي هي 23μl ~ اليسار) من هؤلاء المرشحين مع 6μl صبغ التحميل 5X على 2 بروميد ٪ إيثيديوم agarose هلام ملون وتشغيله لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية (Bioblock العلمية) وتفقد البصر. انظر على سبيل المثال في الشكل 2. استئصال عصابات من الحجم الصحيح من هلام مع مشرط وضعها في أنابيب تفاعل الفرد 1.5 مل. تنقية شظايا من هلام ، على سبيل المثال مع Zymoclean جل DNA كيت الاسترداد (الإنزيم للبحوث). </li></ol> 5. التسلسل وتحديد المنتجات PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ سانجر تسلسل شظايا الهدف ، على سبيل المثال على التسلسل 3730 ABI ABI الشعري الكبير مع 3.1 صبغ الكيمياء التطبيقية (النظم البيولوجية). إعداد ردود الفعل التسلسل في وحدات التخزين التي تحتوي على 10-20 نانوغرام 10μl هلام تنقية قالب ، [كدنا] 1.75μl العازلة تخفيف 5X ، 0.5μl الكبير بريميكس V3.1 صبغ ، 1 التمهيدي قدما ميكرولتر (M52C 20 ، 10 مم) ، وddH2O. الشروط الدراجات هي : 1 تمسخ دقيقة الأولي ، تليها 25 دورة من 10 ثانية في 96 درجة مئوية ، و 5 درجات مئوية في ليالي 45 و 4 دقائق عند 60 درجة مئوية. تنقية وإعداد رد فعل التسلسل وفقا لبروتوكولات الاتصال الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد متواليات [كدنا] الناتجة ضد قواعد البيانات مثل النوكليوتيدات GenBank23 ، على سبيل المثال من خلال الأدوات القائمة على شبكة الإنترنت مثل الانفجار الذي وقع في المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI ، <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. ممثل النتائج : وأخذت عينات من البط البري (أنس platyrhynchos) في مرصد Ottenby الطيور في ديسمبر كانون الاول عام 2007. من كل البري أجري على عينة على بطاقة اتفاقية التجارة الحرة على النحو المبين في هذا البروتوكول. بعد الشحن ، وأبقي على بطاقات اتفاقية التجارة الحرة في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة سنتين. عزل اختبار بطاقة اتفاقية التجارة الحرة عينة من نفس المختبر في كراوس وآخرون تم تضمين 18 عاما السيطرة الإيجابية ، فضلا عن تسع عشرة أضعاف التخفيفات المتسلسلة منه. اثنان ضوابط السلبية ط) من استخراج بطاقة فارغة اتفاقية التجارة الحرة ، لمعرفة ما إذا كان هناك المرحل من الناخس ، والثاني) RT - PCR التفاعل الذي تم استخدامه في nuclease الماء الخالي كقالب ، لاختبار إذا حدث تلوث أثناء أو استعدادا للتفاعل PCR. وقد تم تحليل 84 عينة. يمكن العثور على صورة هلام المنتجات PCR من هذه العينات 84 في الشكل 1. ويمكن من عينات طبيعية يمكن ملاحظة العديد من العصابات غير محددة بسبب وجود الملوثات الميكروبية المختلفة في البراز. ومع ذلك ، فإن الهدف جزء من الزوج التمهيدي هو 244 سنة مضت فترة طويلة. تم تحميل كامل PCR للرد حجم مجموعة فرعية من العينات التي تنتج ما يقرب من شظايا في نطاق حجم الصحيح (بين 200 شركة بريتيش بتروليوم و BP 300) على هلام (الشكل 1). يمكن العثور على مثال على أي من العصابات وقطعت من هلام التكميلية في الشكل 1. بالإضافة إلى السيطرة الإيجابية ، واثنين من هذه العينات (69899 و69912) إيجابية من جانب بروتوكول جديد. وكشف البحث BLAST ضد قاعدة بيانات NCBI النوكليوتيدات هويتهم ومنظمة العفو الدولية الجينات مصفوفة (الشكل 3) ، في حين أن جميع الفرق الأخرى تشبه سلاسل الجرثومي الأكثر تطابقا ، أو لم تسفر عن تسلسل للقراءة على الإطلاق. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> الشكل 1. صورة هلام من الفحص الأولي للمنتجات PCR 2 منتج PCR ميكرولتر من السيطرة الإيجابية ، قتم تحميلها من التخفيفات يريال مراقبة إيجابية ، واثنين من عناصر التحكم السلبية و 84 عينات المذرقية. وتظهر العينات في 48 لوحة هلام العلوي ، وعينات من 48 لوحة في القاع. السهام الحمراء تشير الممرات هلام تستخدم لمدة 100 سنة مضت DNA معيار الحجم. التوضيح ، الدوائر الحمراء تبين الفرق في مجموعة والحجم المتوقع. دوائر زرقاء تشير إلى amplicon غير محددة (أعلى اليسار) أو الحرفية ديمر التمهيدي أقل من 100 سنة مضت في حجم (أسفل اليمين). <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> الشكل 2. وقد تم اختيار العينات مع عينات مختارة من شظايا في نطاق الحجم الصحيح. مع فرق ما بين 200 و 300 سنة مضت بي بي (BP تستهدف تفتيت 244). السهم الأخضر يشير إلى السيطرة الإيجابية ، السهمان الحمراء تشير العينات التي تم التأكد من أن تكون إيجابية AIV بمقارنة متواليات [كدنا] بهم إلى قاعدة بيانات NCBI النوكليوتيدات. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> الشكل 3. القبض على الشاشة من البحث BLAST ممثل في NCBI. كان هناك تساؤل واحد من [كدنا] تسلسل تم الحصول عليها من شظايا رفعه ضد قاعدة النوكليوتيدات على موقع NCBI. يتم التعرف بشكل صحيح على عينة جزء الجينات مصفوفة منظمة العفو الدولية. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">لعرض النسخة الكاملة الحجم لهذه الصورة ، انقر هنا.</a> <img alt="الشكل 1 التكميلية" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> S1 التكميلية الشكل. وقطعت عصابات من عينات مختارة من استئصاله هلام. أخذت هذه الصورة من هلام المبين في الشكل 1 بعد ما بين 200 مرشح العصابات وغليان 300 من غليان.

<ol>
	<li>Pulido, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+evolution+of+avian+migration.">The genetics and evolution of avian migration.</a> BioScience. 57, 165-174 (2007).</li><li>Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza:+An+ecological+and+evolutionary+perspective+for+waterbird+scientists.">Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists.</a> Waterbirds. 29, 243-257 (2006).</li><li>Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+virulence+of+the+1918+"Spanish"+influenza+virus.">The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus.</a> Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).</li><li>Butler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+flu+goes+global.">Swine flu goes global.</a> Nature. 458, 1082-1083 (2009).</li><li>Normile, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza.+Wild+birds+only+partly+to+blame+in+spreading+H5N1.">Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1.</a> Science. 312, 1451-14 (2006).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+global+H5N1+outbreaks+match+bird+migration+patterns.">Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns.</a> Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+the+spread+of+the+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+virus+in+wild+birds+in+Europe.">Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe.</a> Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+dissemination+of+H5N1+viruses+isolated+during+an+influenza+outbreak+in+migratory+waterfowl+in+Western+China.">Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China.</a> J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).</li><li>Gaidet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+viruses+in+water+birds.">Avian influenza viruses in water birds.</a> Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+in+migratory+birds+and+evidence+of+limited+intercontinental+virus+exchange.">Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange.</a> PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).</li><li>Parmley, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+bird+influenza+survey,+Canada,+2005.">Wild bird influenza survey, Canada, 2005.</a> Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).</li><li>Wallensten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+influenza+A+virus+in+migratory+waterfowl+in+northern+Europe.">Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).</li><li>Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+high-throughput+influenza+A+virus+surveillance+studies+of+wild+birds+by+use+of+molecular+diagnostic+tests.">Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).</li><li>Latorre-Margalef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+influenza+A+virus+infection+on+migrating+mallard+ducks.">Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).</li><li>Runstadler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RRT-PCR+analysis+and+virus+isolation+to+determine+the+prevalence+of+avian+influenza+virus+infections+in+ducks+at+Minto+Flats+State+Game+Refuge,+Alaska,+during+August+2005.">Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005.</a> Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).</li><li>Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+preservative+on+recoverable+RT-PCR+amplicon+length+from+influenza+A+virus+in+bird+feces.">Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces.</a> Avian Dis. 51, 965-968 (2007).</li><li>Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sample+type,+temperature+and+RNAlater+(TM)+on+the+stability+of+avian+influenza+virus+RNA.">The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA.</a> J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).</li><li>Kraus, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+surveillance:+On+the+usability+of+FTA+cards+to+solve+biosafety+and+transport+issues.">Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues.</a> Wildfowl. , 215-223 (2009).</li><li>Smith, L. M., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+archiving+and+processing+DNA+from+wildlife+samples+using+FTA+databasing+paper.">Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper.</a> BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).</li><li>Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+an+RNA+genome+from+databasing+paper+(FTA).">Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA).</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).</li><li>Rogers, C., Burgoyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+typing:+Storing+and+processing+of+stabilized+reference+bacteria+for+polymerase+chain+reaction+without+preparing+DNA+-+An+example+of+an+automatable+procedure.">Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure.</a> Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).</li><li>Fouchier, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+influenza+a+viruses+from+different+species+by+PCR+amplification+of+conserved+sequences+in+the+matrix+gene.">Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene.</a> J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).</li><li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Res. 38, 46-51 (2009).</li><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR.">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li><li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus.">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li></ol>

محاصرة والمناولة وأخذ عينات من الطيور تم القيام به بعد التشريعات الوطنية والتي وافق عليها المجلس السويدي للزراعة والأخلاق لجنة البحوث الحيوانية.

بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة إضافية لعينات البراز الشاشة أو ما شابه ذلك لوجود AIV. وقد صممت خصيصا لجعل جمع العينات سريعة وسهلة. هذا يجعل من الممكن للأشخاص أقل المدربين ، مثل الصيادين أو مديري الحياة البرية ، والمساهمة في مراقبة منظمة العفو الدولية. لا سلاسل باردة ينبغي أن تطبق ، على الرغم من تجميد العينات ويوصى حيثما أمكن ذلك. وبعد أيام قليلة من درجة حرارة الغرفة ، على سبيل المثال أثناء النقل إلى المختبر ، لم تكن مشكلة لجزيئات الحمض النووي الريبي على بطاقات اتفاقية التجارة الحرة ، وطالما بقيت هذه البطاقات الجافة. غيرها من نظم التخزين غير المبردة التي يتم تقييمها حاليا من قبل مجتمع البحوث ، مثل الكحول أو 15 أو 16 الجوانيدين ، تتطلب ترتيبات الشحن الخاصة بسبب طبيعتها الخطرة. في المقابل ، فإن الأسلوب بطاقة اتفاقية التجارة الحرة لا تتطلب النقل البحري للمواد الخطرة. ومع ذلك ، وسيلة أخرى للتخزين للاهتمام في هذا الصدد هو RNAlater ™ التي ليست خطرة ، إما 17. يمكن أن يتم تحليل العينات في المختبرات أي الجزيئية القياسية. ليس هناك حاجة إلى معدات خاصة بخلاف المعتاد لتفاعلات PCR وتسلسلها الشعري. ويمكن تنفيذ كافة الخطوات دون مستوى السلامة الحيوية لأن فعلا في جمع العينات والمعطل في العوامل المسببة للأمراض محتملة من النشاط المضاد للبكتيريا وفيروسات من بطاقة اتفاقية التجارة الحرة. لم تراع عبر تلوث واللاحقة عينات إيجابية كاذبة في تجاربنا مع عينات من الطيور البرية. ومع ذلك ، عند العمل مع RNA PCR وأنه من المستحسن دائما أن تولي اهتماما خاصا لتنظيف أماكن العمل وغرف منفصلة للخطوات السابقة واللاحقة PCR. العمل في غطاء الدخان يقلل من خطر تلوث الهباء الجوي في المختبر. Pipetting الاحتياجات التي يتعين الاضطلاع بها مع نصائح التصفية. من دراسة سابقة على عينات أخذت في وقت واحد من البط نفسه نحن نعرف أن ستة من عينات 84 كانت ايجابية من قبل الحقيقي التقليدية RT - PCR الأسلوب (24) والقيم ط الحقيقي من RT - PCR المعروفة. العينتين إيجابية الكشف عنها بواسطة القضاء لدينا وسيلة من البط التي كانت القيم ط &lt;30 (يشير إلى وجود نسبة عالية من الحمض النووي الريبي الفيروسي). وكان الأربعة الأخرى التي كانت إيجابية العينات مع بروتوكول القيم التقليدية لا يمكن ط&gt; 30 (أقل تركيزا) ، ويمكن الكشف عنها بواسطة بروتوكول لدينا. وكانت عينات من الفيروس فقط مع التتر ايجابية عالية نسبيا في مقايسة لدينا وأنه من المرجح أن حساسية الأسلوب هو مصدر عدم الكشف عن عينات إيجابية. كذلك ، كان حجم العينة في الدراسة الحالية منخفضة جدا ويمكن أن تكون طريقة تم تطويرها بالكامل وتقييمها إذا نفذت تجارب أكثر صرامة للرقابة والخروج. ومع ذلك ، إذا كان من هذه العينات التي تم جمعها من مناطق نائية ، فإن التحليل التقليدي لم يكن ممكنا على الإطلاق. بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذه النتائج الأولى تنبع من التجارب الرائدة التي تحتاج إلى مزيد من التحسين. فترة التخزين سنتين في الثلاجة العادية -20 درجة مئوية بعد جمع العينات ربما يؤثر أيضا على نوعية RNA الفيروسي. هذا التدهور RNA ممكن هو قضية هامة عند التعامل مع تخزين درجة حرارة الغرفة من الفيروسات المعطلة. العينات المخزنة في السوائل البديلة على النحو المذكور أعلاه تعاني من تدهور كبير مما يؤثر تحليل تمتد أطول من الجينوم الفيروسي 16. على الرغم من عدم اختباره في دراستنا ، فقد أثبتت اتفاقية التجارة الحرة لبطاقات تكون مناسبة تماما للحفاظ على سلامة جزيئات الحمض النووي الريبي RNA في النظم الأخرى التي هي مشابهة جدا لفيروسات أنفلونزا الطيور 25 و 26.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف أو صك </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> رايون البلاستيك الجاف المسحة </td><td> كوبان ، إيطاليا </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> اتفاقية التجارة الحرة بطاقة </td><td> Whatman </td><td></td><td> عدة خيارات </td></tr><tr><td> هاريس 2mm والصغرى لكمة مع حصيرة </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز مجانا وحة 96well </td><td> غرينر بيو واحد </td><td> 652290 </td><td> أو قابلة للمقارنة </td></tr><tr><td> كيم الدقة مناديل </td><td> Kimtech </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> حل سريع استخراج الحمض النووي الريبي </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX - 96 طقم العزل الفيروسي </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> خطوة واحدة الوصول RT - PCR النظام </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> أو قابلة للمقارنة </td></tr><tr><td> النائب Agarose </td><td> روش </td><td> 1388991001 </td><td> متعددة الأغراض agarose </td></tr><tr><td> 5X تحميل العازلة </td><td> BioRad </td><td></td><td> سلمت سلم مع الحمض النووي </td></tr><tr><td> تحميل EZ سلم غليان 100 </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> أو قابلة للمقارنة </td></tr><tr><td> إيثيديوم بروميد 1 ٪ </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> أو قابلة للمقارنة </td></tr><tr><td> رد فعل أنابيب 1.5ml </td><td> إيبندورف </td><td></td><td> أو قابلة للمقارنة </td></tr><tr><td> Zymoclean جل DNA الانتعاش طقم </td><td> الإنزيم بحوث </td><td> D4001 </td><td> أو قابلة للمقارنة </td></tr><tr><td> ABI كبيرة صبغة 3.1 الكيمياء </td><td> تطبيق النظم البيولوجية </td><td></td><td> أو قابلة للمقارنة </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

فيروسات أنفلونزا الطيور (AIVs) تصيب العديد من الثدييات ، بما في ذلك البشر 1. هذه AIVs متنوعة في مضيفيهم الطبيعية ، وإيواء ما يقرب من جميع الأنواع الفرعية ممكن الفيروسية 2. الأوبئة البشرية بانفلونزا الجذعية أصلا من AIVs 3. وأبلغ العديد من حالات الوفاة البشرية خلال تفشي فيروس H5N1 في السنوات الأخيرة. في الآونة الأخيرة ، سلالة جديدة تتعلق AIV اجتاحت البشر ، مما تسبب في (4) ، &quot;وباء انفلونزا الخنازير. على الرغم من أن تجارة البشر ونشاط النقل ويبدو أن المسؤولين عن انتشار سلالات شديدة العدوى 5 ، ويمكن أيضا نثر يمكن أن يعزى ذلك جزئيا إلى الطيور البرية 6 ، 7. ومع ذلك ، فإن الخزان الفعلي لجميع سلالات AIV والطيور البرية. في رد فعل على هذا ، وفي مواجهة الخسائر التجارية الشديدة في صناعة الدواجن ، وقد تم تنفيذ برامج للمراقبة واسعة على مستوى العالم لجمع معلومات عن البيئة من AIVs ، وتركيب أنظمة الإنذار المبكر للكشف عن بعض السلالات الشديدة الإمراض 8-12. الأساليب التقليدية تتطلب الفيروسي الفيروسات لتكون سليمة وزراعتها قبل التحليل. هذا يتطلب سلاسل باردة صارمة مع التجميد العميق والثقيلة إجراءات السلامة البيولوجية ليكون في المكان أثناء عملية النقل. ولذلك فإن المراقبة على المدى الطويل يقتصر عادة على محطات قليلة على مقربة من حقل مختبرات مجهزة تجهيزا جيدا. لا يمكن أخذ عينات المناطق النائية ما لم يتم تنفيذ إجراءات معقدة لوجستيا. وقد اعترفت هذه المشاكل 13 و 14 ، واستخدام التخزين والاستراتيجيات البديلة للنقل التحقيق (الكحول أو الجوانيدين) 15-17. مؤخرا ، قدمت كراوس وآخرون 18 وسيلة لجمع وتخزين ونقل عينات AIV ، استنادا إلى ورقة مرشح خاص. اتفاقية التجارة الحرة بين الحفاظ على بطاقات 19 RNA على أساس التخزين الجاف 20 وتجعل مسببات الأمراض غير نشط عند الاتصال 21. وأظهرت هذه الدراسة أنه يمكن استخدام بطاقات اتفاقية التجارة الحرة للكشف عن الحمض النووي الريبي في AIV عكس النسخ PCR والتي يمكن أن تكون متسلسلة والناتجة [كدنا] والجينات وتحديد الفيروس. في دراسة كراوس وآخرون (18). مختبر عزل من كان يستخدم AIV ، وجرى التعامل مع عينات بشكل فردي. في ملحق المعروضة هنا ، تم اختبار عينات البراز من الطيور البرية من فخ بطة في مرصد الطيور Ottenby (SE السويد) مباشرة لتوضيح جدوى الأساليب في الظروف الميدانية. اصطياد البط وجمع عينة من مسحات المذرقية يتجلى. البروتوكول الحالي يتضمن الارتقاء في التعامل مع تدفق العمل من أنبوب واحد لتصميم 96 - جيدا. وإن كانت أقل حساسية من الطرق التقليدية ، وطريقة تشفير البطاقات توفر تكملة ممتازة لمراقبة خطط كبيرة. أنها تسمح لجمع وتحليل عينات من أي مكان في العالم ، دون الحاجة إلى الحفاظ على سلسلة تبريد أو أنظمة السلامة فيما يتعلق شحن الكواشف الخطرة مثل الكحول أو الجوانيدين.

Watch this Scientific Journal Video about Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved at JoVE.com

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

جرى التحقق من طريقة للحفاظ على ، والكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبي ومن فيروسات أنفلونزا الطيور وباستخدام عينات البراز مدد الطبيعي من الطيور. يزيل هذا الأسلوب على ضرورة الحفاظ على سلسلة التبريد ومعالجة الفيروسات المعدية ويمكن تطبيقها في إعداد عالية الإنتاجية 96 - جيدا.

الطيور ترصد الأنفلونزا اتفاقية التجارة الحرة مع بطاقات : أساليب الميدانية ، الأحيائية ، وقضايا النقل محلولة

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K Views.  Wageningen University. جرى التحقق من طريقة للحفاظ على ، والكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبي ومن فيروسات أنفلونزا الطيور وباستخدام عينات البراز مدد الطبيعي من الطيور. يزيل هذا الأسلوب على ضرورة الحفاظ على سلسلة التبريد ومعالجة الفيروسات المعدية ويمكن تطبيقها في إعداد عالية الإنتاجية...

Video: Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

توليد المؤتلف فيروسات الأنفلونزا من الحمض النووي البلازميد

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

التشخيص السريع لفيروس انفلونزا الطيور في الطيور البرية : استخدام لPCR - RRT المحمولة والكواشف تجميد المجفف في الميدان

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

نماذج دورة حياة فيروس الايبولا تحت شروط السلامة الأحيائية المستوى 2 مع جزيئات تشبه الفيروسات يحتوي على Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.