1. التوصيات قبل بدء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تستخدم الأمنية الخاصة ملوثة الميكوبلازما لأنها لن تفرق بشكل صحيح إلى خلايا عقدة الجيوب الأنفية. اختبار لتلوث الميكوبلازما قبل البدء في البروتوكول. القيام بذلك باستخدام مجموعة PCR للالسريع، والكشف عن درجة عالية من الحساسية مسببة واتبع بروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل طبق بتري (الخطوة 2.3.4)، ومعطف واحد 10 سم صحن الثقافة 2 زنزانة مع معقمة 7 مل 0.1٪ الجيلاتين من الجلد أسماك المياه الباردة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. إزالة الجيلاتين والسماح للطبق الجافة تحت ظروف معقمة في مقعد العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل أن تتمكن من بدء تشغيل بروتوكول التمايز كنت في حاجة الى مضاعفة transfected الماوس مستقر ES خط الخلية استنساخ تحتوي على الميزات التالية: ط) التأسيسي الإفراط في التعبير عن TBX3 باستخدام ناقلات التعبير الثدييات. ب) إن الجينات المقاومة G418 تحت سيطرة Myh6-المروج 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب ك-زراعة الخلايا غير متمايزة الأمنية الخاصةد مع الخلايا المغذية المشع في ظل ظروف قياسية كما هو موضح 1. </li></ol> 2. التمايز الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يومين من التمايز - إزالة الأمنية الخاصة من الخلايا المغذية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة، وغسل الخلايا مع 10 مل الفوسفات مخزنة المالحة PBS، إضافة 7 مل كولاجيناز الرابع حل واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وضع مرشح 40 ميكرون العقيمة في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بعناية المستعمرات PSC (تجنب لإزالة الخلايا المغذية) من قبل pipetting الحل كولاجيناز صعودا وهبوطا 5 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى تصفية 40 ميكرون، وشطف الفلتر ثلاث مرات مع 8 مل PBS. بدوره حولها مرشح ووضعه رأسا على عقب في طبق بتري. إزالة المستعمرات خلية PSC من قبل pipetting 10 مل PBS إلى الجزء السفلي من مرشح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS، تعليق الخلايا في 1 مل Accutase وأناncubate عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل PBS، مزيج حل الخلية بواسطة pipetting انها صعودا وهبوطا 5 مرات وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS، تعليق الخلايا في 10 مل زراعة المتوسطة وتحديد عدد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 15،000 خلية / سم 2 على 75 سم 2 فلتر القارورة وزراعتها لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO2. بعد 2 أيام ينبغي أن تكون قارورة 50-70٪ متموجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 0 - بدء التمايز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 10 مل PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في برنامج تلفزيوني، إضافة 2 مل Accutase واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وضع مرشح 40 ميكرون العقيمة في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل PBS، ونقل تعليق خلية إلى 40 ميكرون فلتر، وشطف التصفية عن طريق إضافة 10 مل PBS وأجهزة الطرد المركزي من خلال تدفق لمدة 5 دقائق في 300 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا في 10 مل التمايز المتوسطة وتحديد عدد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع رانه الخلية تعليق مع التمايز المتوسط ​​إلى تركيز النهائي من 20،000 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 20 مل من الماء و 5 مل قطرة (HD) حل في طبق بيتري الدرجة الثانية لتجنب تجفيف التدريجي من ويي شنقا. ملاحظة: لكل 24 لوحة تحتوي أيضا iSABs (انظر القسم 2.8.6.4/2.8.7) تبدأ مع 16 أطباق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ما يصل الى 50 مل تعليق خلية في علبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره حولها غطاء طبق بتري. وضع 180 ويي تحتوي كل منها على 20 ميكرولتر (400 خلية / HD) تعليق الخلية على الغطاء باستخدام ماصة 12 قناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل بعناية حول الغطاء وضعه على طبق بيتري. ملاحظة: سرعة الدوران في المكان غطاء مهم جدا. إذا تم تشغيل الغطاء حول بطيئة جدا أو سريع جدا، والتوتر السطحي للتعليق الخلية ليست عالية بما فيه الكفاية للاحتفاظ قطرات شنقا على الغطاء. قبل محاولة إنتاج ويي لممارسة مرة الأولى الدوران في المكان الغطاء مع 20 قطرات ميكرولتر من المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة الخلايا لمدة 2 أيام في 37 ° C، 5٪ CO 2 إلى السماح لهم بتشكيل EBS. ملاحظة: مكان طبق بتري واحد مملوء بالماء في الجزء العلوي من كومة من 5 أطباق بتري. وإلا فإن HD في طبق بتري العلوي سوف تجف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل بعناية حول غطاء طبق بيتري من الدرجة الثانية ونقل EBS المستمدة من اثنين من أطباق بتري (360 EBS) إلى أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر 10 دقيقة للسماح للEBS تستقر في قاع الأنبوب (لا الطرد المركزي EBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح مثل كثير المتوسطة وقت ممكن، تعليق EBS في 10 مل التمايز المتوسطة ونقل تعليق إلى 10 سم طبق بتري. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2-6 تعليق الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة EBS في تعليق لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، وتغيير المتوسطة بعد 2 أيام. ملاحظة: حتى لو طبق بتري لا المغلفة (على العكس من طبق ثقافة الخلية) وEBS غالبا ما نعلق على السطح. السيطرة على أطباق بتري لEBS تعلق كل يوم، وإذا فصل ما يلزم من EBSمن على سطح الأرض من قبل pipetting لطيف. اختياري: يهز أطباق بتري بشكل مستمر خلال الفترة الثقافة تعليق. كن حذرا مع سرعة شاكر. ينبغي أن EBS لا تتراكم في منتصف ولا تطفو إلى حدود أطباق بتري. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل EBS من واحدة طبق بيتري لالجيلاتين واحد المغلفة صحن 10 سم ثقافة 2 الخلية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 7-12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا ينبغي أن تبدأ للفوز على بعد 8-12 أيام. تحقق لضرب بؤر الخلايا يوميا تحت المجهر. تبدأ الخلايا لتشكيل طبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة يوميا. ملاحظة: بعد تغيير المتوسطة، والخلايا تتطلب 3-4 ساعة لاستعادة والبدء في الضرب مرة أخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 12-15 اختيار الخلايا العقدية الجيوب الأنفية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة أيام بدأت خلايا الضرب (حوالي 12-15 يوم)، نضح 10 المتوسطة وماصة مل من المتوسط ​​التمايز الطازجة التي تحتوي على 400 ميكروغرام / مل G418 إلى الخلايا. </li></ol></li><lط&gt; بعد أربعة أيام من بداية التحديد فصل طبقة الخلايا. ملاحظة: من الممكن أن طبقة الخلايا يتم فصل بالفعل من على سطح الأرض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة بعناية دون الشفط طبقة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني وإزالة PBS بعناية دون الشفط طبقة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من كولاجيناز IV حل، ونقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج بقوة تعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يجب أن يحدث تعليق مجموعات صغيرة. إذا لا تزال هناك أجزاء كبيرة من طبقة اليسار، ثم كرر الخطوة 2.8.4 مرتين أخريين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PBS بعناية. ملاحظة: إذا iSABs هي أن تتولد المضي قدما في خطوة 2.8.7. إذا iSAB الجيوب الأنفية المستمدة الخلايا واحد العقدي هي أن تتولد على المضي قدما مع خطوة 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايافي 12 مل التمايز متوسطة تحتوي على 400 ميكروغرام / مل G418 والبذور منها في 6 آبار من الجيلاتين المغلفة 24 بئرا (2 مل / جيد). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جيل من الخلايا العقدية واحدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا من الخطوة 2.8.6 في 5 مل Accutase واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج بقوة تعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا في 12 مل التمايز المتوسطة التي تحتوي على 400 ميكروغرام / مل G418 والبذور منها في 6 آبار من الجيلاتين المغلفة 24 بئرا (2 مل / جيد). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2 بعد التفكك، نضح المتوسطة ويغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل التمايز المتوسطة / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 4-8 بعد التفكك، وتغيير المتوسطة كل الثانية يوم 2. في يوم 10 بعد iSABs استخدام التفكك أو iSAB الجيوب الأنفية المستمدة العقدي متاحة لمزيد من التحليل الخلايا واحد. </li></ol>

<ol>
	<li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2++channel+blockers.">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48 (3), 173-182 (1991).</li><li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MesP1+drives+vertebrate+cardiovascular+differentiation+through+Dkk-1-mediated+blockade+of+Wnt-signalling.">MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling.</a> Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).</li><li>David, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+programming+of+pluripotent+stem+cells+towards+distinct+cardiovascular+cell+types.">Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types.</a> Cardiovasc Res. 84 (2), 263-272 (2009).</li><li>Hoogaars, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx3+controls+the+sinoatrial+node+gene+program+and+imposes+pacemaker+function+on+the+atria.">Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria.</a> Genes Dev. 21 (9), 1098-1112 (2007).</li><li>Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+selected+cardiomyocytes+from+differentiating+embronic+stem+cells+form+stable+intracardiac+grafts.">Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts.</a> J Clin Invest. 98 (1), 216-224 (1996).</li><li>Marger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+activity+and+ionic+currents+in+mouse+atrioventricular+node+cells.">Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells.</a> Channels (Austin). 5 (3), 241-250 (2011).</li><li>Jung, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programming+and+isolation+of+highly+pure+physiologically+and+pharmacologically+functional+sinus-nodal+bodies+from+pluripotent+stem+cells).">Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells).</a> Stem cell reports. 2 (5), 592-605 (2014).</li><li>Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+differentiated+in+vitro+from+embryonic+stem+cells+developmentally+express+cardiac-specific+genes+and+ionic+currents.">Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents.</a> Circulation research. 75 (2), 233-244 (1994).</li><li>He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+develop+into+multiple+types+of+cardiac+myocytes:+action+potential+characterization.">Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization.</a> Circ Res. 93 (1), 32-39 (2003).</li><li>Yanagi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels+and+T-type+calcium+channels+confer+automaticity+of+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem cells. 25 (11), 2712-2719 (2007).</li><li>Barbuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+composition+and+functional+properties+of+f-channels+in+murine+embryonic+stem+cell-derived+pacemaker+cells.">Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 46 (3), 343-351 (2009).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes:+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents.">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H2006-H2017 (2011).</li><li>David, R., Franz, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+pluripotency+to+distinct+cardiomyocyte+subtypes.">From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes.</a> Physiology (Bethesda). 27 (3), 119-129 (2012).</li><li>Scavone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+CD166++precursors+develop+into+fully+functional+sinoatrial-like+cells).">Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells).</a> Circ Res. 113 (4), 389-398 (2013).</li><li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation+and+characterization+of+HCN4-positive+pacemaking+cells+derived+from+murine+embryonic+stem+cells+during+cardiac+differentiation.">Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation.</a> Pacing Clin Electrophysiol. 33 (33), 290-303 (2010).</li><li>Wiese, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+sinus+node+head+and+differentiation+of+sinus+node+myocardium+are+independently+regulated+by+Tbx18+and+Tbx3.">Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3.</a> Circ Res. 104 (3), 388-397 (2009).</li><li>Kleger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+calcium-activated+potassium+channels+induces+cardiogenesis+of+pluripotent+stem+cells+and+enrichment+of+pacemaker-like+cells.">Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells.</a> Circulation. 122 (18), 1823-1836 (2010).</li><li>Bakker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-box+transcription+factor+TBX3+reprogrammes+mature+cardiac+myocytes+into+pacemaker-like+cells.">T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells.</a> Cardiovasc Res. 94 (3), 439-449 (2012).</li><li>Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+quiescent+cardiomyocytes+to+pacemaker+cells+by+expression+of+Tbx18.">Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 54-62 (2013).</li><li>Johns, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+expression+of+a+voltage-gated+potassium+channel+in+vitro+(rat+cardiac+myocytes)+and+in+vivo+(rat+liver).+A+novel+strategy+for+modifying+excitability.">Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability.</a> J Clin Invest. 96 (2), 1152-1158 (1995).</li><li>Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+human+potassium+channel+suppresses+cardiac+hyperexcitability+in+rabbit+ventricular+myocytes.">Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes.</a> J Clin Invest. 103 (6), 889-896 (1999).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

القدرة على إنتاج الخلايا الجذعية المستمدة خلايا تنظيم ضربات القلب القلب قد تسمح إعادة تشكيل إيقاع القلب السليم بمعنى &quot;أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجية&quot;. وبالمثل، فإن اختبار المخدرات في المختبر تستفيد من توافرها. يمكن الأمنية الخاصة تؤدي إلى أي نوع من الخلايا ف?...

مصطلح &quot;متلازمة الجيوب الأنفية المرضى&quot; تلخص أمراض متعددة مما يؤدي إلى تدهور نظام تنظيم ضربات القلب القلب. وهي تتألف من المرضي، أعراض بطء القلب الجيبي، كتلة الجيبي الأذيني واعتقال الجيوب الأنفية وكذلك متلازمة عدم انتظام دقات القلب، بطء القلب. وبالتالي، غالبا ما يترافق من &quot;متلازمة العقدة الجيبية المريضة&quot; عن أمراض القلب التي العامة مثل مرض القلب الإقفاري، بعضلة القلب أو التهاب عضلة القلب. في الوقت الحاضر، وتعتمد الطرق العلاجية على زرع أجهزة ضبط نبضات القلب الكهربائية. ومع ذلك، وهذا يسير جنبا إلى جنب مع عدد من المخاطر مثل الالتهابات وفشل البطارية. وعموما، فإن نسبة حدوث مضاعفات لا يزال مرتفعا جدا في المرضى بعد زرع جهاز تنظيم ضربات القلب الاصطناعي و. وعلاوة على ذلك، خلافا لتنظيم ضربات القلب الذاتية، وهذه الأجهزة لا تستجيب لتحفيز الهرمون. وثمة بديل في المستقبل قد تعتمد على توفر &quot;أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجية&quot; التي يمكن أن تكون الأمنية الخاصةكمصدر الخلوي مناسبة والتي من شأنها أيضا أن تكون ذات قيمة للغاية لفي المختبر اختبار المخدرات. ومع ذلك، ومشكلة كبيرة تكمن في ظهور نادر جدا من الخلايا العقدية الجيوب الأنفية داخل هيئات مضغي الشكل (EBS) - وهذا عادة لا تتجاوز 0.5٪ ~ 1. سابقا، فقد تبين أن &quot;البرمجة إلى الأمام&quot; نحو فرعية cardiomyocyte محددة أمر ممكن التحقيق عبر overexpression من أوائل متميزة عوامل النسخ القلب والأوعية الدموية مثل عامل الأديم المتوسط ​​محددة-الخلفي 1 (MesP1) وNK2 النسخ ذات الصلة، موضع 5 (Nkx2.5) 2، 3. لالحجم العادي وظيفة العقدة الجيبية الأذينية (SAN)، وT-مربع عامل النسخ Tbx3 أمر بالغ الأهمية، وهو ما ثبت لبدء برنامج الجين تنظيم ضربات القلب والسيطرة على التفريق بين SAN 4. في حين أن هذا عزز ظهور خلايا تنظيم ضربات القلب وظيفية، والمحتوى لا يزال لم تتجاوز ~ 40٪ خلال كامل سكان الخلية cardiomyocytic. لذلك، تم إدخال خطوة اختيار المضادات الحيوية إضافي Myh6-المروج استنادا 5 من قبلنا. هذا يؤدي في النهاية إلى المجاميع cardiomyocyte بعد غير ملحوظة (&quot;الهيئات التي يسببها صينية الأذيني.&quot; iSABs &quot;) والتي تظهر زيادة شديدة الترددات الضرب (&gt; 400 نبضة في الدقيقة) في المختبر، للمرة الأولى تقارب تلك التي في القلب الفئران وقابلة للمقارنة لزراعتها في المختبر الجيوب الأنفية الخلايا العقدية معزولة من قلب الفئران 6. تحت الإدارة إيزوبرينالين تتحقق حتى الترددات الضرب من 550 نبضة في الدقيقة. والجدير بالذكر أن تتكون iSABs لأكثر من 80٪ خلايا عقدية وظيفية واضحة اعتبارا من الفسيولوجية واسعة يحلل 7. في الآونة الأخيرة، عدة نهج لتوليد الجيوب الأنفية الخلايا العقدية باستخدام برمجة المباشرة 19، السطح علامات 14 أو العلاج الدوائي مع جزيئات صغيرة وصفت 16،17. ومع ذلك، وأيا من هذه الطرق أدت إلى مثل هذه نقاء عالية من خلايا تنظيم ضربات القلب وينبض ترددات قريبة من الفئران انهالفن كما لوحظ في iSABs. وعلاوة على ذلك، في نموذج المجراة سابقا من المزروعة شرائح البطين الماوس الكبار التي فقدت النشاط الضرب العفوي بهم، وiSABs هي قادرة على الاندماج في نسيج شريحة، وبالتالي تبقى نشطة بشكل عفوي وبقوة سرعة شرائح القلب لتقلصات 7. ووصف بروتوكول مفصلة لتوليد هذه iSABs في هذه الورقة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:131px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s liquid medium with stable glutamine</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>FG 0465</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>FG 0435</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLS type IV, CLS IV</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>C4-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Non-essential amino acids</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>K 0293</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS Superior</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>S 0615</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L 0473</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A 2912</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile</td>
			<td>Brand</td>
			<td>703409</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accutase</td>
			<td>eBioscience,Inc.</td>
			<td>00-4555-56</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4861000155</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon Cell Strainer 40&#181;m</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P11-010</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri Dishes</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>663102</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS without Ca and Mg</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P30-3302</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leukemia inhibitory factor</td>
			<td>Phoenix Europe GmbH</td>
			<td>LIF-250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quadratic petri dishes</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PX67.1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>G7765</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>M3148&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-Thioglycerol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>M6145</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture flask</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture test plates (24 well)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of murine cardiac pacemaker cell aggregates based on es-cell-programming in combination with myh6-promoter-selection

ويستند العلاج من &quot;متلازمة الجيوب الأنفية المرضى&quot; على أجهزة ضبط نبضات القلب الاصطناعي. هذه تحمل مخاطر مثل فشل البطارية والالتهابات. وعلاوة على ذلك، فإنها تفتقر الاستجابة الهرمونات والإجراء العام هو مكثفة من حيث التكلفة. &quot;أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجية&quot; ولدت من شركات الأمن الخاصة قد يصبح بديلا، إلا أن المحتوى نموذجية من خلايا تنظيم ضربات القلب في الهيئات مضغي الشكل (EBS) منخفضة للغاية. بروتوكول صفها يجمع بين &quot;البرمجة إلى الأمام&quot; الأمنية الخاصة من الفئران عبر العقدة الجيب محفز TBX3 مع اختيار المضادات الحيوية Myh6-المروج مقرها. هذا ينتج المجاميع cardiomyocyte متسقة من&gt; 80٪ خلايا تنظيم ضربات القلب وظيفية من الناحية الفسيولوجية. هذه &quot;التي يسببها الجيبية الأذينية-الهيئات&quot; (&quot;iSABs&quot;) والتعاقد بشكل عفوي على ترددات بعد لم يتم الوصول إليها (400-500 نبضة في الدقيقة) المقابلة لخلايا عقدية المعزولة من قلوب الماوس، وتمكن من وتيرة عضلة القلب الفئران خارج الحي. باستخدام بروتوكول وصف الجيوب الأنفية نقية للغايةيمكن توليد الخلايا واحد العقدي الذي مثل يمكن استخدامها لاختبار المخدرات في المختبر. وعلاوة على ذلك، قد تصبح iSABs ولدت وفقا لهذا البروتوكول خطوة حاسمة نحو هندسة الأنسجة القلبية.

بروتوكول صفها يسمح جيل من iSABs مع تواتر الضرب من حوالي 450 نبضة في الدقيقة من شركات الأمن الخاصة (كما هو موضح في الفيلم) التي تقع بالقرب من وتيرة الضرب الماوس القلب. بعد تفكك iSABs (الخطوة 2.8.8) تظهر الخلايا واحد المرصودة شكل نموذجي للخلايا العقدة الجيب (خلايا المغزل والعنكبو?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection at JoVE.com

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج الوظيفية الجيوب الأنفية الأنسجة العقدية من الخلايا الجذعية المحفزة الفئران (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression بالإضافة إلى القلب-الميوسين الثقيلة سلسلة (Myh6) اختيار المضادات الحيوية المروج يؤدي إلى نقية للغاية المجاميع خلية تنظيم ضربات القلب. هذه &quot;التي يسببها الجيبية الأذينية-الهيئات&quot; (&quot;iSABs&quot;) تحتوي على أكثر من 80٪ خلايا تنظيم ضربات القلب، وتظهر زيادة معدلات عالية الضرب وقادرة على عضلة القلب وتيرة فيفو السابقين.

جيل من الفئران القلب منظم ضربات القلب المجاميع خلية استنادا ES-الخلوي البرمجة في الجمع مع Myh6-المروج-اختيار

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

generation-murine-cardiac-pacemaker-cell-aggregates-based-on-es-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.6K Views.  University of Rostock.  يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج الوظيفية الجيوب الأنفية الأنسجة العقدية من الخلايا الجذعية المحفزة الفئران (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression بالإضافة إلى القلب-الميوسين الثقيلة سلسلة (Myh6) اختيار المضادات الحيوية المروج يؤدي إلى نقية للغاية المجاميع خل...

Video: Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة وبناء التنموي سمية فحوصات للسلامة الكيميائية الفحص وبيولوجيا الأنظمة توليد البيانات

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation and cell fate specification using aggregates of mouse embryonic stem cells (mESCs) in suspension culture. Small numbers of mESCs are aggregated in basal medium for 48 hr in non-tissue-culture-treated, U-bottomed 96-well plates, after which they are competent to respond to experimental signals. Following treatment, these aggregates begin to show signs of polarized gene expression and gradually alter their morphology from a spherical mass of cells to an elongated, well organized structure in the absence of external asymmetry cues. These structures are not only able to display markers of the three germ layers, but actively display gastrulation-like movements, evidenced by a directional dislodgement of individual cells from the aggregate, which crucially occurs at one region of the elongated structure. This protocol provides a detailed method for the reproducible formation of these aggregates, their stimulation with signals such as Wnt/&#946;-Catenin activation and BMP inhibition and their analysis by single time-point or time-lapse fluorescent microscopy. In addition, we describe modifications to current whole-mount mouse embryo staining procedures for immunocytochemical analysis of specific markers within fixed aggregates. The changes in morphology, gene expression and length of the aggregates can be quantitatively measured, providing information on how signals can alter axial fates. It is envisaged that this system can be applied both to the study of early developmental events such as axial development and organization, and more broadly, the processes of self-organization and cellular decision-making. It may also provide a suitable niche for the generation of cell types present in the embryo that are unobtainable from conventional adherent culture such as spinal cord and motor neurones.

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

We have developed a protocol to generate aggregates of mouse embryonic stem cells that display self-organization, symmetry breaking and elongation paralleling axial development. This technique allows the study of axial developmental processes and the generation of cell types that are otherwise difficult to perform in monolayer culture.

جيل من مجاميع من الفأر الخلايا الجذعية الجنينية التي تظهر التماثل يكسر، الاستقطاب والسلوك الجماعي الناشئ<em&gt; في المختبر</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Conventional methods to initiate suspension aggregate based cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) are plagued with culture heterogeneity with respect to aggregate size and shape. Here, we describe a robust method for cardiac differentiation employing microwells to generate size-controlled hPSC aggregates cultured under cardiac-promoting conditions.

إجمالي الحجم الأمثل في Microwells لالقائم على تعليق القلب تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

تقنية زرع الثدي الثديية الرواية جديدة لتصور الجيل سفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

جيل من الأرغن مامري الفسيفساء عن طريق التربسينات التفاضلية

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

جيل من iPSC الإنسان القائم على الدم في الدماغ حاجز رقاقة

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...