تهدف طريقتنا إلى توليد خلايا سلف القلب الخاصة بمجال القلب من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس. يسمح خط الخلايا الجذعية هذا المراسل الميداني للقلب بإجراء دراسة عالية الإنتاجية للآليات الكامنة تحت أمراض القلب الخلقية ، مما يوفر نظامًا قابلًا للتلاعب الجيني والصيدلانية. هناك العديد من أمراض القلب الخلقية الخاصة بغرفة معينة.
من خلال تلخيص تكوين القلب في المختبر ، يسمح هذا البروتوكول بدراسة آلية المرض وتطوير العلاجات التجديدية المستقبلية. يمكن أن يوفر هذا البروتوكول نظرة ثاقبة حول كيفية تحديد الخلايا السلف القلبي من غرف مختلفة أثناء نمو القلب. تبدأ من خلال نمو الخلايا الجذعية الجنينية الماوس المعدلة وراثيا في 0.1٪ قارورة T25 المغلفة الجيلاتين في 2i المتوسطة.
عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء، وشطف الثقافات مع برنامج تلفزيوني وإضافة ملليلتر واحد من التربسين لكل قارورة لفك الثقافة في خلايا واحدة في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. عندما تكون الخلايا منفصلة، تحييد التفاعل مع أربعة ملليلتر 10 FBS في DMEM وفرز الخلايا بواسطة طريقة مناسبة. تمييع الخلايا إلى ما يقرب من ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الخمس لكل تركيز متوسط جديد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
ثم إعادة تثبيت بيليه في خمسة ملليلترات من 2I المتوسطة الطازجة لإعادة الطلاء على 0.1٪ جديد قوارير T25 المغلفة الجيلاتين. بالنسبة إلى جيل CPC من الخلايا اللولبية القلبية، قم بجمع 2.5 مرة 10 إلى ستة عينة الخلايا الجذعية الجنينية الماوس المتحولة المنفصلة عن طريق الطرد المركزي، وإعادة تعليق الخلايا في 25 ملليلتر من SFD المتوسطة. لوحة تعليق الخلية في واحد 150 في 25 ملليمتر لوحة معقمة للحضانة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
في نهاية الحضانة، وجمع الزى القلب في أنبوب مخروطي. رواسب spheroids عن طريق الطرد المركزي لتسهيل العزلة الانتقائية من الروبويدات وتجنب الخلايا الفردية. Resuspend spheroids في 25 ملليلتر من SFD المتوسطة الطازجة تستكمل مع نانوغرام واحد لكل ملليلتر من أكتيفين A و 1.5 نانوغرام لكل ملليلتر من البروتين مورفوجيني العظام أربعة.
إعادة النفخات مرة أخرى إلى لوحة الثقافة نفسها لاحتضان 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية. في اليوم التالي، تذكر كل من spheroids القلب عن طريق الطرد المركزي. Resuspend الهيئات الجنينية المتمايزة في 25 ملليلتر من SFD المتوسطة الطازجة للطلاء في مرفق منخفضة للغاية ، قارورة مربعة 75 سنتيمترا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة.
لعزل الحزب الشيوعى الصيني في مجال القلب باستخدام المراسلين الفلورسنت، وجمع الهيئات الجنينية عن طريق الطرد المركزي وفك الثقافات 3D مع ملليلتر واحد من التربسين في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. في نهاية الحضانة، اخلط جيدا عن طريق الأنابيب لفك الخلايا وتحييد التفاعل مع أربعة ملليلترات من 10٪ FBS في DMEM. تمرير الخليط على مصفاة 70 ميكرومتر لإزالة أي الهيئات الجنينية غير منفصلة، ورواسب الخلايا المصفاة عن طريق الطرد المركزي.
لفرز CPCs من خلال التعبير مراسل الفلورسنت، resuspend بيليه في حل FACS 500 ميكرولترتر وتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب البوليسترين جولة أسفل خمسة ملليلتر على الجليد. ثم فرز الخلايا لعزل RFP-وGFP-التعبير عن الخلايا بواسطة FACS، وجمع الخلايا في ملليلتر واحد من FBS. لعزل أول مقابل ثاني القلب مجال CPCs على أساس التعبير عن بروتين السطح Cxcr4, resuspend واحد الماوس الجنينية خلية جذعية RFP التعبير عن خلايا السلف القلب في 300 ميكرولترات من 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني تستكمل مع الفلوريسكين-مترافق-مضادة Cxcr4.
بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا ثلاث مرات في ملليلتر واحد إلى اثنين من الطازجة، وبرنامج تلفزيوني بارد في غسل. بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولترات من محلول FACS وتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب خمسة ملليلتر، مستديرة القاع. ثم فرز الخلايا من خلال التعبير Cxcr4 بهم، وجمع كل من السكان Cxcr4 إيجابية وسلبية في أنابيب الفردية التي تحتوي على ملليلتر واحد من FPS لكل أنبوب على الجليد.
لإعادة زراعة الخلايا السلف القلبية المعزولة في مجال القلب المعزولة في القلب ، قم بجمع الخلايا المخزّنة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في وسط SFD. ثم بذور ما يقرب من ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الأربع في بئر في 0.1٪ الجيلاتين المغلفة، 384-جيدا لوحة. إذا لوحظ موت الخلايا المتزايد بعد الفرز، أضف مثبطات روك 10 ميكرومولار لكل بئر.
وبعد يومين من الثقافة، ينبغي ملاحظة الضرب العفوي. لتحليل قدرة CPCs مطلي على التفريق إلى cardiomyocytes، وجمع الخلايا في اليوم 12 من التمايز مع التربسين، كما هو موضح، لعزل القلبية القلبية واحدة و resuspend الخلايا في 4٪ paraformaldehyde. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجمع الخلايا الثابتة عن طريق الطرد المركزي وغسل بيليه في برنامج تلفزيوني لإزالة مثبت الزائدة.
بعد ذلك، resuspend الخلايا في 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني، واحتضان نصف عينة الخلية مع الماوس المضادة لtroponin T الأجسام المضادة واستخدام النصف الآخر من العينة كتحكم سلبي. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني جديد وإعادة تعليق العينات في 10٪ FBS زائد برنامج تلفزيوني مكملة مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة. بعد حضانة أخرى لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني جديد في الغسيل و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتردات من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب لتحليلها على تدفق سايت عداد الخلايا.
بعد حوالي 132 ساعة من التمايز، يمكن الكشف عن tbx1-RFP وخلايا سلف القلب Hcn4-GFP عن طريق المجهر الفلوري. عموما، كل من GFP وRFP تظهر الخلايا تقريبا في نفس الوقت، واثنين من مجموعات الخلايا السلف تستمر في التوسع على مقربة وعادة في نمط تكميلي. ضبط تركيزات أكتيفين A والعظام البروتين مورفونيك أربعة سوف يغير النسب المئوية للخلايا السلف القلبية في مجال القلب الأول مقابل الثاني.
وبالمثل، باستخدام خط الخلايا الجذعية الجنينية الماوس مراسل RFP، بعد 132 ساعة من التمايز، RFP-إيجابية خلايا السلف القلب تظهر. بعد المناعة لCxcr4، RFP إيجابية، Cxcr4 إيجابية، وRFP إيجابية، يمكن عزل الخلايا السلبية Cxcr4. يؤكد الكبت المناعي لـ troponin T القلبي في اليوم 12 من التمايز أن خلايا حقل القلب الأول تتمايز بشكل رئيسي إلى الخلايا الفطرية.
وبالمثل، فإن الخلايا المشتقة من RFP-positive, Cxcr4-سالبة الخلايا السلف القلبية تؤدي إلى خلايا القلب في نسب أعلى بكثير مقارنة بالخلايا السلف القلبي الإيجابية واحدة Cxcr4. في بعض الأحيان، تفشل الخلايا الجذعية الجنينية الماوس للتمييز بكفاءة وتشكيل أعداد منخفضة جدا من خلايا سلف القلب حقل القلب محددة. توقيت, تركيز, واتساق إضافة السيتوكينات وعدد من الخلايا حاسمة لجيل ناجح من خلايا سلف القلب غرفة محددة.
بعد هذا الإجراء، يمكن للمحققين تحليل الخصائص الفسيولوجية لمختلف مجموعات الخلايا السلف القلبية للحصول على مزيد من التبصر في مواصفاتها ووظيفتها.
