This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

وأجريت التجارب وفقا لدليل الكندية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة حماية الحيوان لافال جامعة: ملاحظة. التحضير 1. عينة ملاحظة: في هذا المثال، استخدمنا أدمغة فئران في يوم ما بعد الولادة 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام التخدير انخفاض حرارة الجسم في الثلج المجروش لمدة 3 إلى 4 دقائق لالجراء، ثم تشريح أدمغة في أسرع وقت ممكن في الجليد الباردة المتوسطة L15. تنفيذ هذه الخطوة ضمن 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تشريح أدمغة في تضمين العفن. (راجع. قائمة العتاد) وملء مع الأنسجة المجمدة تضمين وسائل الاعلام مع الحرص على توجيه العينة في الموضع المطلوب. تجميد العينات مباشرة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 ° C. تنفيذ هذه الخطوة في غضون 30 ثانية. ملاحظة: العينات ويمكن تخزين بضعة أشهر دون المساس بنوعية RNA. </li></ol> 2. باجتزاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الص الغشاءالشرائح الزجاجية تيد (راجع. قائمة المواد) مع حل ريبونوكلياز سطح تطهير للقضاء على أي أثر للRNAses. تغسل الشرائح في الماء DEPC والسماح لهم الجافة. بدلا من ذلك، والشرائح خبز بين عشية وضحاها في 200 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات المجمدة في ناظم البرد تنظيفها سابقا مع حل سطح ريبونوكلياز إزالة التلوث. ضبط درجة الحرارة الغرفة ناظم البرد في -20 ° C وشريحة العينات في 10 ميكرون سمك. جمع أقسام الأنسجة على الغشاء المغلفة الشرائح والسماح لهم الجاف 10 دقيقة قبل تلطيخ. بدلا من ذلك، والشرائح تخزينها في -80 درجة مئوية حتى تلطيخ. </li></ol> 3. إعداد حلول تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جميع الحلول فقط قبل بدء التجربة، واستخدام المانع ريبونوكلياز في جميع الحلول تلطيخ (باستثناء حلول الغسيل) لمنع تدهور الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل العازلة. استخدام نفس عازلة في جميع الحلول (التي تتألف من ريبونوكلياز خالية من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل من 1٪ BSA،0.2٪ تريتون و 2٪ ريبونوكلياز المانع). لكل شريحة، وإعداد 400 ميكرولتر من حل العازلة (200 ميكرولتر للالابتدائي و 200 ميكرولتر لالأجسام المضادة الثانوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل تثبيتي: استخدام 70٪ من الإيثانول أبقى في -20 ° C. إبقاء الأنسجة إجراء تثبيت الحد الأدنى لتجنب انخفاض حاد في محصول استخراج الحمض النووي الريبي. ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم 95٪ من محلول الإيثانول تستكمل من حامض الخليك 5٪ الاحتفاظ بها في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الأجسام المضادة الأولية عن طريق تمييع الأجسام المضادة الأولية في حل العازلة. لالخلايا العصبية الدوبامين وضع العلامات، واستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف هيدروكسيلاز التيروزين (TH، ومعدل الحد انزيم لإنتاج الدوبامين). استخدام تركيزات عالية من الأجسام المضادة للتعويض عن فترة حضانة سريع. استخدام TH الأجسام المضادة في التخفيف 1:25. ملاحظة: في بروتوكول المناعي الطبيعي، وهذا الجسم المضاد يعطي إشارة قوية عندما حضنت بين عشية وضحاها في التخفيف من 1: 1،000. في هذا البروتوكول، ويتم استخدامها 40X أكثر ويركزإد بسبب فترة حضانة قصيرة. نظرا لتركيز عال من الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الطريقة، إجراء المناعية القياسية بالتوازي من أجل التحقق من أي زيادة في وضع العلامات غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الضد الثانوية عن طريق تمييع الأجسام المضادة الثانوية في حل العازلة. استخدام الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز بتركيز 1: 100. ملاحظة: في هذا المثال، استخدمنا المعقدة البيروكسيديز الأضداد المضادة للأرنب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد معقدة (ABC) حل أفيدين البيوتين للكشف عن الأجسام المضادة الثانوية المعقدة البيروكسيديز. جعل حل ABC بإضافة مركب A و B المركب بتركيز 1: 100 المخفف في DEPC PBS تستكمل مع 2٪ ريبونوكلياز المانع. إعداد أفيدين-البيوتين معقد 30 دقيقة قبل إضافتها إلى الشرائح. </li></ol> 4. تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد واحدة أو شريحتين في الوقت من -80 ° C كتبها عبها بها في الهواء بسرعة (أو استخدام منفاخ الهواء). أقسام تحيط مع مسعورالقلم الحاجز والسماح جافة لعدد قليل من ثانية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرائح في حل تثبيتي البارد لمدة لا تزيد عن 5 دقائق عند -20 درجة مئوية. يهز مرة واحدة في الهواء لإزالة الفائض من حل تثبيتي ثم، وسرعان ما تراجع الشرائح في أوقات DEPC PBS 6-8 للغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفض الغبار الشرائح لإزالة الفائض من DEPC PBS. تأكد من أن الشرائح إزالة الجليد خطوة لا تتجاوز 5 دقائق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح على صينية نظيفة (سابقة التجهيز مع حل سطح ريبونوكلياز تطهير للقضاء على أي أثر للRNAses) ووضع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية على كل شريحة (أرنب مكافحة TH) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تراجع الشرائح بسرعة في DEPC PBS 3 مرات للغسيل ونفض الغبار الشرائح مرة واحدة لإزالة الزائدة من DEPC PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 200 ميكرولتر من الحل الضد الثانوية على كل شريحة لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تراجع الشرائح بسرعة 3 مرات في DEPC PBS للغسيل ونفض الغبار الشرائح لإزالة الفائض من DEPC PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 200 ميكرولتر من المحاليل ABCنشوئها على كل شريحة لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تراجع الشرائح بسرعة في DEPC PBS 3 مرات للغسيل ونفض الغبار الشرائح لإزالة DEPC الزائد PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل خلال دقيقة 4 من الحضانة في حل ABC على DAB (3،3 &#39;diaminobenzidine). استخدام الكواشف المنصوص عليها في عدة (DAB البيروكسيد الركيزة كيت). مزيج 1 قطرة من المقدمة العازلة، 1 قطرة من حل DAB و1 قطرة من 30٪ H 2 O 2 في 2.5ML من المياه DEPC. مزيج الحل بواسطة قلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 196 ميكرولتر من محلول DAB وإضافة 4 ميكرولتر (2٪) من ريبونوكلياز حل المانع فقط قبل أن ينتشر على الشرائح. مكان الشرائح على صينية نظيفة (سابقة التجهيز مع حل تطهير ريبونوكلياز السطح) وضعت 200 ميكرولتر من حل DAB على الشرائح. ملاحظة: حل DAB يجب أن تتفاعل within1 أو 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح بسرعة في DEPC PBS 3 مرات لغسل ووضع الشرائح لبضع ثوان في الايثانول المطلق. تجفيف الشرائح التي كتبها عبها بها في الهواء (أو استخدام منفاخ الهواء). &lt;ر /&gt; ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل أو المجهزة للLCM. </li></ol> 5. الليزر التقاط تسليخ مجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذويب الشرائح بسرعة عن طريق التحريك بها في الهواء (أو استخدام منفاخ الهواء). تأكد من أن الشرائح إزالة الجليد خطوة لا تتجاوز 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى LCM. ضع الشريحة تحت المجهر مع الجانب عينة التي تواجه غطاء أنبوب جمع. اختيار أفضل التكبير للعينة. ضبط التركيز لرؤية خلايا الفائدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد منطقة القطع والبدء في قطع مع الليزر. جمع الخلايا تشريح أو قطعة من الأنسجة في غطاء أنبوب جمع مليئة 50 ميكرولتر من تحلل العازلة (من RNA عدة الاستخراج). ضمان أن خطوة LCM لا تتجاوز 30 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من خلايا معزولة باستخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي (راجع. قائمة المواد). اتبع بروتوكول الشركة المصنعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا التي تم جمعها لمدة 30 دقيقة في 42 ° C لليز الخلايا. الشرط المسبق العمود تنقية RNA من خلال إضافة 250 ميكرولتر من تكييف العازلة. تحميل 50 ميكرولتر من الإيثانول إلى الخلايا هي lysed. تحميل 100 ميكرولتر من الخلايا هي lysed على عمود تنقية شروطا مسبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لعمود في 16،000 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل العمود مرتين مع غسل المخازن المؤقتة. أزل في حجم الموصى بها الحد الأدنى (11 ميكرولتر) خالية من ريبونوكلياز المياه (لا DEPC معاملة لأنها قد تتداخل مع bioanalyser). حافظ على 2 ميكرولتر لاختبار جودة. يتم توفير جميع الحلول والكواشف في عدة: ملاحظة. </li></ol></li></ol> 6. [كدنا] التجميعي والكمية RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس نسخ عينات من الحمض النووي الريبي ليزر القبض على خلايا الدوبامين في الحمض النووي مكملة باستخدام الناسخ العكسي وبنسبة ضئيلة (DT). اتبع بروتوكول الشركة المصنعة (راجع. قائمة المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1 ميكرولتر من [كدنا لQRT-PCR التضخيم مع الاشعال الجينات المحددة. إعداد الجرمية PCRctions في حجم 20 ميكرولتر مع الساخن مزيج رد فعل بدء مكون واحد لالكمي PCR على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. تنفيذ كل رد فعل في ثلاث نسخ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوصف التجارب هنا، استخدم أزواج التمهيدي التالية: GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;)؛ Rpl13a-F (5&#39;-ACA ACT دول مجلس التعاون الخليجي CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;)؛ ث-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / ث-R (5&#39;-غا AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;)؛ شركة العين للتوزيع-F (5&#39;- CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 &#39;) / شركة العين للتوزيع-R (5&#39;- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3&#39;). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الكمي RT-PCR التضخيم باستخدام المعلمات الدراجات السريعة التالية: 95 ° C لمدة 5 دقائق تليها 45 دورات من 10 ثانية 95 درجة مئوية، و 10 ثانية في 60 ° C و 10 ثانية في 72 ° C. لتحليل منحنى ذوبان باستخدام الإعداد الافتراضي للأداة لdetermiتشكيل المنتج متجانس شمال شرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات باستخدام برنامج المضمنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع قيم التعبير عن DA علامات الجينات ث وشركة العين للتوزيع مع التعبير عن اثنين من الجينات GAPDH إشارة وRpl13a للحصول على مستويات التعبير النسبية كما هو موضح سابقا 14. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+methods+and+applications.">Laser capture microdissection: methods and applications.</a> Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).</li><li>Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+technology.">Laser capture microdissection technology.</a> Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+molecular+histology+to+study+glial+influence+on+neurodegenerative+disorders.+Focus+on+recent+developed+single+cell+laser+microdissection.">The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection.</a> Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).</li><li>Liu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+tissue+biorepository.">Laser capture microdissection in the tissue biorepository.</a> Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).</li><li>Baskin, D. G., Bastian, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-laser+capture+microdissection+of+rat+brain+neurons+for+real+time+quantitative+PCR.">Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR.</a> Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).</li><li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection.">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).</li><li>Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purity+and+enrichment+of+laser-microdissected+midbrain+dopamine+neurons.">Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons.</a> BioMed research international. 2013, 747938 (2013).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+rat+midbrain+dopamine+neurons:+implications+for+selective+vulnerability+in+parkinsonism.">Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism.</a> Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).</li><li>Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Endogenous+Serine/Threonine+Protein+Phosphatase+Inhibitor,+G-Substrate,+Reduces+Vulnerability+in+Models+of+Parkinson's+Disease.">An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease.</a> Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).</li><li>Pfaffl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Quantification+strategies+in+real-time.">Chapter 3, Quantification strategies in real-time.</a> AZ of quantitative PCR. , (2004).</li><li>Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+ultra-short+immunolabeling+method+for+high-quality+mRNA+preservation+in+laser+microdissection+and+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction).">Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction).</a> The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).</li><li>Podgorny&#301;, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+for+biology+and+medicine.">Laser microdissection for biology and medicine.</a> Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).</li><li>Vandewoestyne, M., ewoestyne &amp; Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).</li><li>Shapiro, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+proteomic+workflow+for+characterization+of+frozen+clinical+biopsies:+laser+capture+microdissection+coupled+with+label-free+mass+spectrometry.">A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry.</a> Journal of. 77, 433-4340 (2012).</li><li>Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era:+targeting+the+genetic+basis+of+cancer.">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

النقطة الأكثر أهمية لهذا الأسلوب تتمثل في وصفها خلايا الفائدة في حين منع تدهور الحمض النووي الريبي. كما RNAses ينشطون في المحاليل المائية، وخفض مرات الحضانة يحسن الحفاظ RNA 11،15. يجب أن يعامل جميع الحلول المستخدمة مع DEPC لتعطيل RNAses. جميع المواد والأسطح تحتاج إلى أن تع...

يتكون الدماغ من مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا العصبية المختلفة وتشكيل شبكات معقدة. ويتم تنظيم هذه الخلايا العصبية في مجموعات متميزة والمجموعات الفرعية وفقا لمورفولوجيا والاتصال والتعبير الجيني نمطها 1. عرضت تطوير ميكروأرس، الجيل التالي من التسلسل، وQRT-PCR إمكانية للمقارنة ملامح التعبير الجيني للسكان الخلايا العصبية في سياقات البيولوجية المختلفة 1،2. هذه التحليلات حساسة تتطلب التحديد الدقيق وعزل أنواع الخلايا في المصالح مع الحفاظ على سلامة RNA 2-4. تم الفلورسنت تنشيط الخلايا الفرز (FACS) التقنية المستخدمة على نطاق واسع لعزل أنواع معينة من الخلايا على أساس علامات سطح الخلية و / أو التشكل. يتطلب FACS خطوة التفكك الخلية قبل الفرز، مما يؤدي الى فقدان كامل للقرار المكاني 5. العديد من مجموعات سكانية فرعية العصبية تتميز عن بعضها البعض وفقا للتوزيع تشريحي في عشرالبريد الدماغ. ملقط ليزر تطبيقها على أقسام الدماغ رقيقة يوفر خيارا مناسبا لعزل معينة من الخلايا لقرار مكانية عالية 6-8. وكان أحد أوجه القصور الرئيسية لLCM الحاجة إلى تحديد خلايا الفائدة على أساس معايير شكلية أو على صحفيين بروتين فلوري المعدلة وراثيا في النماذج الحيوانية. تطوير تقنيات جديدة لأداء الطرق السريعة التي immunolabeling الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، بالاشتراك مع LCM، يسمح الآن عزلة المجموعات السكانية الفرعية خلية المضي قدما في تجارب التنميط الجيني. وقد تم إجراء هذا النهج سابقا ووصف لفترة وجيزة في عدد قليل من المنشورات 1،9-13. هنا، علينا أن نظهر إجراء مفصل للحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي مجموعة فرعية معينة من الخلايا في بنية النسيج المعقد من خلال الجمع بين immunolabeling سريع مع LCM. وتبين لنا كيفية تنفيذ الخطوات الحاسمة الرئيسية للحصول على الانتعاش RNA القصوى وتجنب تدهور RNA لأنها قد سيجnificantly تأثير الجينات التعبير التنميط. للمظاهرة من هذا البروتوكول، تم استهداف الخلايا العصبية الدوبامين من المخ الأوسط الماوس عمره يوم واحد. الخلايا العصبية الدوبامين يمكن immunolabeled استخدام أجسام مضادة موجهة ضد هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، وإنزيم معدل الحد لتخليق الدوبامين. وبعد المناعية TH، فرد أو مجموعة من الخلايا العصبية الدوبامين ويمكن بعد ذلك تكون معزولة باستخدام LCM. يتم جمع خلايا Microdissected في المخزن المؤقت تحلل، ويتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طقم العزلة RNA. يتم قياس نوعية وكمية الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام bioanalyzer 5. المزيد من التحليل في التعبير الجيني باستخدام: RNA التسلسل، ميكروأري، أو QRT-PCR يمكن بعد ذلك أن يؤديها 2،4،6. وكمثال على ذلك، وأظهرت من خطوتين QRT-PCR على الليزر استولت على المجالات الدوبامين معزولة. الكمي النسبي لمستويات التعبير من اثنين من جينات الخلايا العصبية الدوبامين علامة يوضح الانتقائية من هذا البروتوكول.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

ملقط ليزر (LCM) يسمح للعزل خلايا معينة من أقسام الأنسجة رقيقة لقرار مكانية عالية. يتطلب LCM فعال التحديد الدقيق للخلايا القطعان من الأنسجة غير المتجانسة. عادة ما يستند تحديد الخلايا التي تهم LCM على معايير شكلية أو على صحفيين بروتين فلوري. الجمع بين LCM وimmunolabeling السريع يوفر وسيلة بديلة وفعالة لتصور أنواع معينة من الخلايا وعزلهم عن الأنسجة المحيطة. ويمكن بعد ذلك عالية الجودة RNA كنت استخرجت من السكان الخلية نقية ومواصلة تجهيزها لتطبيقات المصب، بما في ذلك RNA-التسلسل، ميكروأري أو QRT-PCR. وقد تم إجراء هذا النهج سابقا ووصف لفترة وجيزة في عدد قليل من المنشورات. والهدف من هذه المقالة هو لتوضيح كيفية تنفيذ immunolabeling السريع لسكان الخلية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، وكيفية عزل هذه الخلايا محددة باستخدام LCM. هنا، نحن لتوضيحد هذا الإجراء متعددة خطوة immunolabeling والتقاط الخلايا الدوبامين في أنسجة المخ من الفئران عمرها يوم واحد. نسلط الضوء على الخطوات الحاسمة الرئيسية التي تستحق اهتماما خاصا. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من الأنسجة والخلايا في المصالح. وسوف يقوم الباحثون من مختلف المجالات من المرجح أن تستفيد من المظاهرة لهذا النهج.

يسمح هذا الإجراء immunolabeling السريع التصور من خلايا الفائدة مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. الشكل 1 يوضح خطوات إعداد الأنسجة قبل استخراج الحمض النووي الريبي. بعد cryosectioning، وصفت الخلايا العصبية الدوبامين استخدام أجسام مضادة موجهة ضد هيدروكسيلاز التيروز...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling at JoVE.com

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

الجينات تحليل التعبير عن مجموعة فرعية من الخلايا في الأنسجة محددة يمثل تحديا كبيرا. توضح هذه المقالة كيفية عزل الحمض النووي الريبي مجموع عالية الجودة من السكان خلية معينة من خلال الجمع بين طريقة immunolabeling السريع مع ملقط ليزر.

عزل الحمض النووي الريبي من خلية مجموعات سكانية فرعية محددة عن طريق الليزر والتقاط تسليخ مجهري جنبا إلى جنب مع رابيد Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Views.  Université Laval.  الجينات تحليل التعبير عن مجموعة فرعية من الخلايا في الأنسجة محددة يمثل تحديا كبيرا. توضح هذه المقالة كيفية عزل الحمض النووي الريبي مجموع عالية الجودة من السكان خلية معينة من خلال الجمع بين طريقة immunolabeling السريع مع ملقط ليزر. 

Video: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

الليزر Microdissection القبض على أنسجة الثدييات

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

استخراج خلايا الحمض النووي الريبي من Neuroprecursor باستخدام بيو راد إجمالي RNA كيت

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

الأداة المساعدة لمرحلة محددة في منتصف إلى أواخر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; جريب عزل

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

عزل الحمض النووي الريبي من بنكرياس الفأر: A-ريبونوكلياز الأنسجة الغنية

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

ليزر التقاط ميكروديسيكشن من ميشوورك ترابيكولار نقية جداً من عيون الماوس لتحليل التعبير الجيني

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

دهن السريع الحبرية العزلة بروتوكول استخدام عدة عزل عضية الراسخة

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

بروتوكول إزالة الميكروسيرس من الليزر الذي ينتج RNA عالي الجودة من عظام الماوس الطازجة المجمدة

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...