This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

הערה: הניסויים בוצעו בהתאם למדריך הקנדי לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים Laval Université ההגנה. הכנת 1. לדוגמא הערה: בדוגמא זו, השתמשנו המוח של עכבר ביום הלידה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהרדמת היפותרמיה בקרח כתוש במשך 3 עד 4 דקות לגורים, ואז לנתח את המוח במהירות אפשרית במדיום L15 קר כקרח. לבצע שלב זה תוך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח העברה גזור בהטבעת עובש (cf. רשימה של אמצעי) ולמלא עם תקשורת רקמה קפוא הטבעה מקפידה לכוון את הדגימה במיקום הרצוי. להקפיא דגימות מייד בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. לבצע שלב זה תוך 30 שניות. ניתן לאחסן דגימות כמה חודשים מבלי להתפשר על איכות RNA: הערה. </li></ol> 2. חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תעודת המקוריות קרום פינוקשקופיות זכוכית טד (cf. רשימה של חומר) עם פתרון טיהור RNAse פני השטח כדי לחסל כל זכר של RNAses. שטוף את השקופיות במי DEPC ולתת להם להתייבש. לחלופין, מגלשות לאפות הלילה ב 200 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הדגימות קפואות בcryostat ניקתה בעבר עם פתרון טיהור RNAse פני השטח. טמפרטורה שנקבעה cryostat הקאמרית ב -20 דגימות C ° ופרוסה בעובי 10 מיקרומטר. לאסוף חלקי רקמות בשקופיות הקרום מצופה ולתת להם להתייבש 10 דקות לפני הצביעה. לחלופין, חנות מחליקה ב -80 ° C עד צביעה. </li></ol> 3. הכנת פתרונות מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל הפתרונות רק לפני תחילת הניסוי, ולהשתמש במעכב RNAse בכל הפתרונות מכתים (פרט לפתרוני כביסה) כדי למנוע השפלה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון החיץ. השתמש באותו החיץ בכל הפתרונות (מורכב מפוספט שנאגרו מלוח RNAse חינם (PBS) בתוספת של BSA 1%,טריטון 0.2% ו -2% מעכב RNAse). עבור כל שקופית, להכין 400 μl של פתרון חיץ (200 μl לעיקרי ו -200 μl לנוגדנים משני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון מקבע: להשתמש באתנול 70% המשיך ב -20 ° C. שמור הליך קיבעון רקמות מינימאלי כדי למנוע ירידה דרסטית בתשואות הפקת RNA. הערה: לחלופין, להשתמש 95% אתנול פתרון בתוספת של 5% חומצה אצטית המשיך ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון הנוגדן הראשוני על ידי דילול הנוגדן הראשוני בפתרון החיץ. לתיוג נוירונים דופאמין, להשתמש נוגדן מיקוד hydroxylase טירוזין (TH, שיעור הגבלת אנזים לייצור דופמין). השתמש בריכוז גבוה של נוגדנים, כדי לפצות על זמן דגירה מהיר. השתמש נוגדן TH בדילול של 01:25. הערה: בפרוטוקול immunofluorescence נורמלי, נוגדן זה נותן איתות חזקה כאשר מודגרות לילה בדילול של 1: 1,000. בפרוטוקול זה, הוא משמש 40X תרכיזי יותראד בשל זמן דגירה הקצר. בשל הריכוז הגבוה של נוגדן המשמש לשיטה זו, לבצע immunostaining סטנדרטי במקביל על מנת לבדוק כל גידול בתיוג שאינו ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון נוגדנים משני על ידי דילול הנוגדנים משני בפתרון החיץ. השתמש נוגדנים משני biotinylated בריכוז של 1: 100. הערה: בדוגמא זו, השתמשנו נוגדני biotinylated נגד ארנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון avidin ביוטין המורכב (ABC) לצורך זיהוי של נוגדנים משני biotinylated. הפוך פתרון ABC על ידי הוספת המתחם והמתחם B בריכוז של 1: 2% מעכב RNAse 100 מדוללים בDEPC PBS בתוספת. הכן את 30 דקות המורכבות avidin-ביוטין לפני הוספתו לשקופיות. </li></ol> 4. מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר שקופיות אחד או שתיים בזמן מ-80 ° C על ידי מצליף אותם באוויר במהירות (או להשתמש במפוח אוויר). חלקי Surround עם הידרופוביעט ומחסום לתת יבש למשך כמה שניות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השקופיות בפתרון מקבע הקר ללא יותר מ 5 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לנער פעם אחת באוויר כדי להסיר את העודפים של פתרון מקבע אז, במהירות לטבול שקופיות בזמנים DEPC PBS 6-8 לשטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרור את השקופיות כדי להסיר את העודפים של DEPC PBS. ודא ששקפי הפשרת צעד אינו עולים על 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום על מגש נקי (קודם לכן בפתרון טיהור RNAse פני השטח כדי לחסל כל זכר של RNAses) ולשים 200 μl של פתרון הנוגדן הראשוני על כל שקופית (ארנב נגד TH) במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה וקפיציות שקופיות פעם אחת כדי להסיר את העודפים של DEPC PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 200 μl של פתרון נוגדנים משני על כל שקופית במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות 3 פעמים בDEPC PBS לשטיפה וקפיציות שקופיות כדי להסיר את עודף DEPC PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 200 μl של solu ABCtion על כל שקופית במשך 4 דקות בטמפרטורת חדר. טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה וקפיציות שקופיות כדי להסיר את DEPC עודף PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את DAB (diaminobenzidine 3,3) פתרון בדקות 4 של דגירה בפתרון ABC. השתמש בחומרים הכימיים המסופקים בערכה (קיט DAB Peroxidase מצע). לערבב 1 טיפה של חיץ סיפק, 1 טיפה של פתרון DAB ו1 טיפה של 30% H 2 O 2 ב2.5ml מים DEPC. מערבבים את הפתרון על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 196 μl של פתרון DAB ולהוסיף 4 μl (2%) של פתרון מעכב RNAse רק לפני הפצה בשקופיות. מגלשות מקום על מגש נקי (קודם לכן בפתרון טיהור RNAse משטח) ולשים 200 μl של פתרון DAB בשקופיות. הערה: פתרון DAB צריך להגיב within1 או 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים מחליק במהירות בDEPC PBS 3 פעמים לשטיפה ולשים שקופיות לכמה שניות באתנול מוחלט. ייבש את השקופיות על ידי מצליף אותם באוויר (או להשתמש במפוח אוויר). &lt;br /&gt; הערה: שקופיות ניתן לאחסן ב -80 ° C לשימוש עתידי או מעובד לLCM. </li></ol> Microdissection לכידה 5. לייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר שקופיות במהירות על ידי מצליף אותם באוויר (או להשתמש במפוח אוויר). ודא ששקפי הפשרת צעד אינו עולים על 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך LCM. מניחים את השקף מתחת למיקרוסקופ עם צד המדגם מול כובע צינור האיסוף. בחר את ההגדלה הטובה ביותר למדגם. התאם את המיקוד כדי לראות את התאים של עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את אזור החיתוך ולהתחיל לחתוך עם הלייזר. איסוף תאים או פיסת הרקמה בכובע צינור איסוף מלא 50 μl של חיץ תמוגה (מערכת חילוץ RNA) גזורים. ודא שהצעד של LCM אינו עולה על 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ RNA הכולל מהתאים מבודדים באמצעות ערכת חילוץ RNA (cf. רשימת חומרים). עקוב הפרוטוקול של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים שנאספו במשך 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס לlyse התאים. תנאי מוקדם עמודת טיהור RNA על ידי הוספת 250 μl של חיץ אוויר. עומס 50 μl של אתנול לתאי lysed. לטעון תאי lysed 100 μl על עמודת טיהור preconditioned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה העמודה ב16,000 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת חדר. לשטוף את העמודה פעמיים עם מאגרי כביסה. Elute בהיקף המינימלי המומלץ (11 μl) של המים RNase חינם (לא טופל DEPC כפי שעלול להפריע לbioanalyser). שמור 2 μl לאיכות בדיקה. הערה: כל הפתרונות לאספקת מים מסופקים בערכה. </li></ol></li></ol> 6. cDNA סינתזה וכמוני RT-PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך-לתמלל דגימות RNA מתאי דופאמין לייזר שנתפס לתוך ה- DNA משלים באמצעות transcriptase ההפוך ואוליגו (DT). עקוב הפרוטוקול של היצרן (cf. רשימה של חומר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 μl של cDNA להגברת qRT-PCR עם פריימרים גן ספציפי. מחשבה PCR להגדירctions ב -20 μl נפח עם תערובת תגובת ההתחלה חמה אחד מרכיבים לPCR כמותי כפי שהומלץ על ידי היצרן. לבצע כל תגובה בשלושת עותקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויים שתוארו כאן, להשתמש בזוגות פריימר הבאים: GAPDH-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / GAPDH-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); ה-F (5&#39;-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); Aadc-F (5&#39;- CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC -3 &#39;) / Aadc-R (5&#39;- GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG -3 &quot;). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הגברה RT-PCR באמצעות פרמטרי הרכיבה מהירים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ואחריו 45 מחזורים של 10 שניות 95 ° C, 10 שניות על 60 מעלות צלזיוס ו -10 שניות על 72 מעלות צלזיוס. לבצע ניתוח עקום התכה באמצעות הגדרת ברירת המחדל של המכשיר לdetermiהיווצרות מוצר הומוגני ne. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הנתונים באמצעות התוכנה מובנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את ערכי הביטוי של גני סמני DA Th וAadc עם הביטוי של שני גני התייחסות GAPDH וRpl13a להשיג רמות ביטוי היחסית כפי שתואר לעיל 14. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Chung, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+orthodenticle+homeobox+2+influences+axonal+projections+and+vulnerability+of+midbrain+dopaminergic+neurons.">The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons.</a> Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+in+translational+research:+theory,+technical+considerations,+and+future+applications.">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied immunohistochemistry &amp; molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).</li><li>Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+methods+and+applications.">Laser capture microdissection: methods and applications.</a> Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).</li><li>Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+technology.">Laser capture microdissection technology.</a> Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+pathology.">Laser capture microdissection in pathology.</a> Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).</li><li>Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+molecular+histology+to+study+glial+influence+on+neurodegenerative+disorders.+Focus+on+recent+developed+single+cell+laser+microdissection.">The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection.</a> Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).</li><li>Liu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+tissue+biorepository.">Laser capture microdissection in the tissue biorepository.</a> Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).</li><li>Baskin, D. G., Bastian, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-laser+capture+microdissection+of+rat+brain+neurons+for+real+time+quantitative+PCR.">Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR.</a> Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).</li><li>Brown, A. L., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+RNA+preservation+for+immunolabeling+and+laser+microdissection.">Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection.</a> RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).</li><li>Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purity+and+enrichment+of+laser-microdissected+midbrain+dopamine+neurons.">Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons.</a> BioMed research international. 2013, 747938 (2013).</li><li>Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IF-LCM:+laser+capture+microdissection+of+immunofluorescently+defined+cells+for+mRNA+analysis+rapid+communication.">IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication.</a> Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).</li><li>Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+rat+midbrain+dopamine+neurons:+implications+for+selective+vulnerability+in+parkinsonism.">Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism.</a> Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).</li><li>Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Endogenous+Serine/Threonine+Protein+Phosphatase+Inhibitor,+G-Substrate,+Reduces+Vulnerability+in+Models+of+Parkinson's+Disease.">An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease.</a> Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).</li><li>Pfaffl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Quantification+strategies+in+real-time.">Chapter 3, Quantification strategies in real-time.</a> AZ of quantitative PCR. , (2004).</li><li>Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+ultra-short+immunolabeling+method+for+high-quality+mRNA+preservation+in+laser+microdissection+and+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction).">Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction).</a> The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).</li><li>Podgorny&#301;, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+for+biology+and+medicine.">Laser microdissection for biology and medicine.</a> Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).</li><li>Vandewoestyne, M., ewoestyne &amp; Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).</li><li>Shapiro, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+proteomic+workflow+for+characterization+of+frozen+clinical+biopsies:+laser+capture+microdissection+coupled+with+label-free+mass+spectrometry.">A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry.</a> Journal of. 77, 433-4340 (2012).</li><li>Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era:+targeting+the+genetic+basis+of+cancer.">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

הנקודה של שיטה זו הקריטית ביותר מורכבת בתיוג תאים של עניין תוך מניעת השפלה RNA. כRNAses פעיל בתמיסות מימיות, הפחתת זמני דגירה משפרת שימור RNA 11,15. כל הפתרונות המשמשים צריכים להיות מטופל בDEPC כדי להשבית RNAses. כל החומרים והמשטחים צריכים להיות מטופלים עם פתרון טיהור RNAse פני...

המוח מורכב ממגוון גדול של סוגים שונים נוירון יוצרים רשתות מורכבות של. נוירונים אלה מאורגנים בקבוצות ותת-קבוצות שונות בהתאם לדפוס מורפולוגיה, הקישוריות וביטוי הגנים שלהם 1. הפיתוח של microarrays, הרצף של הדור הבא, וqRT-PCR הציעו את האפשרות להשוות פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות נוירונים בהקשרים ביולוגיים שונים 1,2. ניתוחים רגישים אלה דורשים זיהוי ובידוד המדויקים של סוגי תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA 2-4. טכניקת פלורסנט הופעלה תא מיון (FACS) כבר בשימוש נרחב לבודד את סוגי תאים ספציפיים המבוססים על סמנים על פני קרום תא ו / או מורפולוגיה. FACS דורש צעד ניתוק תא לפני המיון, שתוצאתה אובדן הרזולוציה מרחבית 5 מלא. תת-אוכלוסיות עצביות רבות נבדלות זו מזו על פי ההתפלגות האנטומי שלהם בהמוח אלקטרוני. microdissection ללכוד לייזר מיושם על חלקים במוח דקים מספק אפשרות מתאימה לבידוד ספציפי של תאים עם רזולוציה מרחבית גבוהה 6-8. מגבלה העיקרית של LCM הייתה הצורך לזהות תאים של עניין על פי קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי המהונדסים גנטי במודלים של בעלי חיים. הפיתוח של טכניקות חדשות לביצוע שיטות immunolabeling מהירות שהשתמרו שלמות RNA, בשילוב עם LCM, עכשיו מאפשר הבידוד של אוכלוסיות תאים להמשיך בניסויי פרופיל-גן. גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים 1,9-13. הנה, אנחנו מדגימים נוהל מפורט להשגת RNA באיכות גבוהה מקבוצת משנה ספציפית של תאים במבנה רקמה מורכב על ידי שילוב של immunolabeling מהיר עם LCM. אנו מראים כיצד לבצע שלבים קריטיים מפתח להשגת התאוששות RNA מקסימאלי ולהימנע משפלת RNA כפי שהוא עשוי sigהפרופיל של התבטאות הגנים השפעת nificantly. להפגנה של פרוטוקול זה, נוירונים דופאמין מהמוח תיכון עכבר יום אחד-עשר היו ממוקדים. ניתן immunolabeled נוירונים דופאמין באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (TH), אנזים שער הגבלה לסינתזת דופמין. בעקבות immunostaining TH, בודד או קבוצות של נוירונים דופאמין אז יכול להיות מבודדות באמצעות LCM. תאי microdissected נאספים במאגר תמוגה, ו- RNA מופק באמצעות ערכת בידוד RNA. איכות וכמות של RNA שחולץ נמדדות באמצעות bioanalyzer 5. ניתוח נוסף של ביטוי גנים באמצעות: רצף RNA, microarray, או qRT-PCR לאחר מכן ניתן לבצע 2,4,6. כדוגמא, שני שלבים qRT-PCR בא לידי הביטוי בתחומי דופאמין המבודד הלייזר שנתפס. כימות יחסי של רמות הביטוי של גני סמן נוירון שני דופאמין ממחיש את הסלקטיביות של פרוטוקול זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

microdissection ללכוד לייזר (LCM) מאפשר הבידוד של תאים ספציפיים מסעיפי רקמות דקים עם רזולוציה מרחבית גבוהה. LCM האפקטיבי דורש זיהוי מדויק של תת-אוכלוסיות תאים מרקמות הטרוגנית. זיהוי של תאים בעלי העניין לLCM מבוסס בדרך כלל על קריטריונים מורפולוגיים או על כתבי חלבון פלואורסצנטי. השילוב של LCM וimmunolabeling המהיר מציע אמצעים חלופיים ויעילים כדי להמחיש סוגי תאים מסוימים ולבודד אותם מרקמה הסובבת. RNA באיכות גבוהה אז יכול להיות שחולץ מאוכלוסיית תא טהורה ועיבוד נוסף ליישומים במורד הזרם, כולל RNA-רצף, microarray או qRT-PCR. גישה זו שבוצעה בעבר ותיארה בקצרה בכמה פרסומים. מטרתו של מאמר זה היא להמחיש כיצד לבצע immunolabeling המהיר של אוכלוסיית תא, תוך שמירה על שלמות RNA, ואיך לבודד תאים הספציפיים אלה באמצעות LCM. במסמך זה, אנו ממחישיםד הליך רב-שלבים זה על ידי immunolabeling ולכידת תאי דופאמין ברקמת מוח מעכברים ליום אחד-עשר. אנו מדגישים את שלבים קריטיים מפתח שראוי להתחשבות מיוחדת. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למגוון רחב של רקמות ותאים של עניין. חוקרים מתחומים שונים צפויים ליהנות מההפגנה של גישה זו.

הליך immunolabeling מהיר זו מאפשר הדמיה של תאים של עניין, תוך שמירה על שלמות RNA. איור 1 מדגים את השלבים של הכנת רקמה לפני מיצוי RNA. לאחר cryosectioning, נוירונים דופאמין מסומנים באמצעות נוגדן המכוון נגד hydroxylase טירוזין (נוירונים שכותרתו מופיעים בחום). בהתאם לשאלה הניסיונית, יכ...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling at JoVE.com

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Views.  Université Laval.  ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר. 

Video: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

הפקת RNA מן התאים Neuroprecursor שימוש Bio-Rad סך RNA Kit

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em&gt; דרוזופילה</em&gt; בידוד זקיק

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...