تسمح هذه الطريقة بالتقاط غير متحيز للتعبير الجيني ميكروجليا على مستوى خلية واحدة، والتي يمكن أن تساعد في توضيح التغاير الجزيئي للميكروفليا في الدماغ السليم والمُرَض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يوفر إجراء مفصل لعزل سريع من microglia من مناطق الدماغ المختلفة ويبين كيفية توليد بكفاءة لعب قاعدة المكتبات RA6 خلية واحدة لتسلسل عميق. لبدء هذا الإجراء، إعداد جميع المخازن المؤقتة والحلول المطلوبة كما هو موضح في بروتوكول النص وتهدئة لهم على الجليد.
بعد القتل الرحيم وقطع رأس الماوس، استخدم مقص صغير لقطع فتح الجلد على الرأس لفضح الجمجمة تحتها. ثم، وقطع من خلال خياطة القوس، خياطة لامدويدال، وخياطة الإكلالي. استخدام ملقط لسحب قبالة كلا الجانبين من العظام الجدارية والعظام بين الزبقية دون إتلاف الأنسجة ونقل الدماغ بعناية إلى طبق بيتري تشريح تحتوي على A.Using شفرة ما قبل المبردة، وقطع الدماغ من خلال خط الوسط إلى نصفين.
استخدم عدد 55 ملقط لفصل المخيخ عن الفص القشري و جذع الدماغ. ثم، استخدام عدد 55 ملقط لتشريح بعناية من قرن آمون و المخطط من القشرة ونقل كل الأنسجة في طبق بيتري مجموعة منفصلة. أولاً، استخدم شفرة حلاقة لختم كل منطقة من مناطق الدماغ إلى قطع دقيقة أقل من ملليمتر مكعب واحد.
باستخدام ماصة ملليلتر واحد مع قطع طرف قبالة، ونقل قطع الأنسجة إلى المجانسات Dounce المبردة مسبقا. التجانس الأنسجة عن طريق التواء ببطء المكبس داخل وخارج التجانس Dounce لمدة ستة إلى 10 السكتات الدماغية الكاملة حتى لا توجد قطع مرئية موجودة. ثم، نقل الأنسجة المتفككة إلى أنابيب 50 ملليلتر من خلال 70 ميكرومتر مصافي.
شطف كل التجانس Dounce ومكبس مع ما مجموعه ستة ملليلتر من المتوسط البارد A ثم نقل الشطف إلى أنبوب 15 ملليلتر للطرد المركزي. نظام التعليق أحادي الخلية بالطرد المركزي بمعدل 400 مرة ز وبأربعون درجات مئوية لمدة خمس دقائق مع كسر في الخامسة. شطف عمود استنزاف كبير واحد وثلاثة أعمدة اختيار كبيرة في فاصل مغناطيسي مع ثلاثة ملليلترات من MCS.
عندما يكون الطرد المركزي لعينات الأنسجة كاملة، ماصة خارج والتخلص من السوبر دون إزعاج بيليه. إعادة بناء الخلايا في المخزن المؤقت MCS الذي يحتوي على مثبط RNase. إضافة 100 ميكرولترات من الخرز إزالة المايلين إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا إعادة تعليق من القشرة والمخيخ وإضافة 50 ميكرولترات من الخرز إزالة المايلين إلى كل من الأنابيب التي تحتوي على خلايا إعادة تعليق من قرن آمون وstriatum.
احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أضف MCS إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا القشرية ليصل حجمه إلى ملليلترين وإلى الأنابيب المتبقية لجلب كل وحدة من وحدات التخزين الخاصة بها إلى ملليلتر واحد. بمجرد أن تكون الأعمدة فارغة من المخزن المؤقت للشطف، قم بتحميل ميليلترين من الخلايا القشرية على عمود الاستنزاف الكبير و ملليلتر واحد من كل تعليق خلية أخرى على أعمدة تحديد كبيرة منفصلة.
بعد ذلك، قم بغسل أعمدة الاستنفاد الكبيرة بميليلتر واحد من المخزن المؤقت MCS وغسل كل عمود تحديد كبير مرتين باستخدام ملليلتر واحد من المخزن المؤقت MCS لكل غسل. تصفية الخلايا من خلال 35 كبسولات مصفاة ميكرولتر في أنابيب FACS مستديرة القاع. أجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب في 400 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ل بيليه الخلايا.
ثم، صب ببطء خارج ناظر وداب حافة الأنبوب على ورقة الأنسجة. إعادة تعليق الخلايا في كل أنبوب مع 300 ميكرولترات من العازلة FACS. أولا، إضافة خمسة microliters من مستقبلات FC الماوس كتلة الكاشف إلى كل أنبوب.
احتضان على الجليد لمدة خمس دقائق. ثم، إضافة ميكرولتر واحد من حجم CD45 PE سبعة وميكر واحد من CD11B BV421 إلى كل أنبوب. احتضان الأنابيب على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
بعد هذا، إضافة ملليلتر اثنين من المخزن المؤقت FACS لغسل. أجهزة الطرد المركزي في 400 مرة ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ل بيليه الخلايا. Resuspend الخلايا في كل أنبوب مع 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت FACS التي تحتوي على ميكرولتر واحد من مثبط RNase و 0.5 ميكرولترات من يوديد بروبديسيوم.
بعد إجراء FACS القياسية، فرز ميكروجليا حية واحدة مع فوهة 100 ميكرومتر في 96-جيدا لوحات PCR التي تحتوي على أربعة ميكرولترات من العازلة تحلل في كل بئر. دوامة وجيزة لوحات وتدور عليها باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء. تخزين لوحات في ناقص 80 درجة مئوية حتى إعداد المكتبة.
عندما تكون جاهزة للمتابعة، اذيب الصحن على الجليد. استخدام دورة حرارية لأداء النسخ الأول لتوليد cDNA وتضخيم cDNA مع إضافية exonuclease خطوة الهضم كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد ذلك، تنقية cDNA بإضافة 18 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي إلى كل بئر.
احتضان لوحة على موقف مغناطيسي لمدة خمس دقائق. ثم، إزالة نابيرات وغسل العينات مرتين مع الطازجة 80٪ الإيثانول باستخدام 80 ميكرولترات من الإيثانول في بئر لكل غسل. لتنفيذ tagmentation، واستخدام آلة الأنابيب نانولتر لخلط 0.4 ميكرولترات من كل عينة cDNA مع 1.2 ميكرولترات من الكواشف Tn5 tagmentation من عدة إعداد المكتبة في لوحة 384-جيدا في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
لإيقاف رد فعل الضم، أضف 0.4 ميكرولترات من عازلة التحييد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، في 384 فهارس و 1.2 ميكرولترات من PCR مختلطة للعينات وتضخيم المكتبات على النحو المبين في بروتوكول النص. تجمع جميع المكتبات الفردية من نفس لوحة 384-well معا واستخدام الخرز المغناطيسي لتنقية المكتبات المجمعة النهائي.
في هذه الدراسة، يتم عزل المايكجليا من القشرة، المخيخ، قرن آمون، و المخطط من نصف الكرة الدماغي للماوس البالغ. يتم فحص تعليق الخلية المعدة تحت المجهر باستخدام الأزرق trypan ومقياس للهيموسيت لتقدير العائد، ونجاعة الخلية، وفعالية إزالة المايلين قبل تنفيذ تلطيخ الأجسام المضادة. يجب أن يكون إجمالي عدد الخلايا في هذه المرحلة أكثر من 30،000 للقشرة وأكثر من 5،000 للأنسجة الأخرى.
أكثر من 90٪ من الخلايا يجب أن تكون قابلة للحياة مع حطام الميلين قليلاً. يتم استخدام جهاز FACS لفرز microglia ، والتي عادة ما تكون CD45 منخفضة وD11B إيجابية. وينبغي أن تولد العزلة الناجحة أكثر من 80٪ microglia من أصل جميع الخلايا الحية واحدة، على الأقل بالنسبة للأنسجة القشرية.
مرة واحدة يتم التقاط microglia الفردية في العازلة تحلل، يتم تحرير الجيش الملكي النيبالي وعكس في وقت لاحق نسخ إلى cDNA، والتي يتم تضخيمها بعد ذلك لمدة 23 دورة. كمنصة ككهربائية، محلل جزء ومجموعات أجزاء NGS عالية الحساسية توفر معلومات سريعة ودقيقة حول توزيع الحجم، فضلا عن كمية من جزيئات cDNA الموجودة في كل بئر من لوحة 96 جيدا. ويمكن استخدام عينات تظهر مسحة بين 500 و 5000 زوج من أزواج القاعدة، وهي فوق حد تركيز معين لصنع المكتبات.
يتم تسلسل العينات إلى عمق أكثر من مليون يقرأ الخام في الخلية الواحدة، مما يشبع قوة الكشف عن منهجية تسلسل الحمض النووي الريبي وحيد الخلية. مع رسم خرائط معدل من تقريبا 60٪ على 2,000 يمكن الكشف عن الجينات لكل خلية ميكروجليال. يتم استنساخ البيانات المنشورة سابقًا التي تم إنشاؤها من طريقة العزل هذه من تجارب مستقلة ، مما يدل على الحساسية للكشف عن الجينات المحددة microglia عبر السكان المتتابعين.
مع المعلومات من النسخ microglia واحد، يمكن للباحثين اكتشاف مجموعات الخلايا الفريدة في سياق مصلحتهم، ومواصلة دراسة الأهمية الوظيفية لهذه السكان المحددة حديثا.
