This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre th&#233;matique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Sant&#233; du Qu&#233;bec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.

NOTA: Los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía Canadiense para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Protección Animal Laval Universidad. 1. Preparación de muestras NOTA: En este ejemplo, hemos utilizado cerebros de ratones en el día postnatal 1. <ol><li> Utilice la anestesia hipotermia en hielo picado para 3 a 4 minutos para cachorros, luego diseccionar los cerebros lo más rápidamente posible en medio L15 helada. Realice este paso dentro de 2 min. </li><li> Transferencia diseccionado cerebros en la incrustación de molde (cf. Lista de material) y se llenan de medios tejido congelado incrustación teniendo cuidado de orientar la muestra en la posición deseada. Congelar las muestras inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Realice este paso dentro de 30 seg. NOTA: Las muestras se pueden almacenar unos meses sin comprometer la calidad del ARN. </li></ol> 2. Seccionamiento <ol><li> Coa membrana Treatted diapositivas de vidrio (cf. Lista de materiales) con solución descontaminante RNAsa superficie para eliminar cualquier rastro de RNAsas. Se lavan los portas en agua DEPC y déjelos secar. Alternativamente, las diapositivas de pasteles durante la noche a 200 ° C. </li><li> Transferir las muestras congeladas en un criostato previamente limpiado con una solución superficie RNAsa descontaminación. Establecer temperatura de la cámara criostato a -20 ° C y rebanada muestras a 10 micras de espesor. Recoger las secciones de tejido en los toboganes de membrana recubierto y dejar secar 10 min antes de la tinción. Alternativamente, la tienda se desliza a -80 ° C hasta que las manchas. </li></ol> 3. Preparación de las soluciones de tinción <ol><li> Preparar todas las soluciones justo antes del inicio del experimento, y el uso de inhibidor de RNasa en todas las soluciones de tinción (excepto para las soluciones de lavado) para evitar la degradación del ARN. </li><li> Preparar la solución tampón. Utilice el mismo tampón en todas las soluciones (compuesta por solución salina tamponada con fosfato libre de ARNasa (PBS), complementado de 1% de BSA,0,2% de Triton y el inhibidor de RNAsa 2%). Para cada diapositiva, preparar 400 l de solución tampón (200 l para el primario y 200 l para los anticuerpos secundarios). </li><li> Preparar la solución de fijación: utilizar etanol al 70% se mantuvo a -20 ° C. Mantenga procedimiento de fijación del tejido mínima para evitar una reducción drástica en el rendimiento de la extracción de ARN. NOTA: También puede utilizar una solución de etanol al 95% complementado de ácido acético al 5% se mantiene a -20 ° C. </li><li> Preparar la solución de anticuerpo primario por dilución del anticuerpo primario en la solución tampón. Para el etiquetado de las neuronas dopaminérgicas, utilizar un anticuerpo dirigido la tirosina hidroxilasa (TH, enzima limitante para la producción de dopamina). Utilice una alta concentración de anticuerpo para compensar el tiempo de incubación rápida. Use anticuerpo TH a una dilución 1:25. NOTA: En el protocolo normal de inmunofluorescencia, este anticuerpo da una señal fuerte cuando se incubó durante la noche a una dilución de 1: 1000. En este protocolo, se utiliza 40 veces más concentrated debido al tiempo de incubación corto. Debido a la alta concentración de anticuerpo usado para este método, realizar una inmunotinción estándar en paralelo a fin de verificar cualquier aumento en el etiquetado no específica. </li><li> Preparar la solución de anticuerpo secundario diluyendo el anticuerpo secundario en la solución tampón. Utilice un anticuerpo secundario biotinilado a una concentración de 1: 100. NOTA: En este ejemplo, se utilizó un anticuerpo biotinilado anti-conejo. </li><li> Preparar la solución de complejo de avidina-biotina (ABC) para la detección de anticuerpos secundarios biotinilados. Hacer solución ABC añadiendo el compuesto A y el compuesto B a una concentración de 1: 100 diluido en DEPC PBS suplementado con inhibidor de RNasa 2%. Preparar la avidina-biotina complejo 30 min antes de añadir a las diapositivas. </li></ol> 4. La tinción <ol><li> Descongelar una o dos diapositivas en el momento de -80 ° C con un movimiento rápido en el aire rápidamente (o utilizar un soplador de aire). Secciones de sonido envolvente con un hidrófobobarrera pluma y dejar secar durante unos pocos segundos. <ol><li> Colocar los portaobjetos en la solución fijadora en frío por no más de 5 minutos a -20 ° C. Agitar una vez en el aire para eliminar el exceso de solución de fijación entonces, rápidamente sumergir diapositivas en tiempos DEPC PBS 6-8 para el lavado. </li><li> Flick las diapositivas para eliminar el exceso de DEPC PBS. Asegúrese de que las diapositivas de descongelación paso no exceda 5 min. </li></ol></li><li> Colocar los portaobjetos en una bandeja limpia (pretratados con una solución de descontaminación superficie de ARNasa para eliminar cualquier rastro de ARNasas) y pusieron 200 l de la solución de anticuerpo primario en cada diapositiva (conejo anti-TH) durante 10 min a temperatura ambiente. Dip desliza rápidamente en DEPC PBS 3 veces para el lavado y la película de las diapositivas una vez para eliminar el exceso de DEPC PBS. </li><li> Ponga 200 l de la solución de anticuerpo secundario en cada portaobjetos durante 6 min a temperatura ambiente. Dip desliza rápidamente 3 veces en PBS DEPC para el lavado y la película de las diapositivas para eliminar el exceso de DEPC PBS. </li><li> Ponga 200 l de la solu ABCción en cada diapositiva durante 4 min a temperatura ambiente. Dip desliza rápidamente en DEPC PBS 3 veces para el lavado y la película de las diapositivas para eliminar el exceso DEPC PBS. </li><li> Preparar la solución durante el 4 minutos de incubación en la solución ABC DAB (3,3 &#39;diaminobencidina). Utilizar los reactivos incluidos en el kit (Kit DAB sustrato de peroxidasa). Mezcle 1 gota de tampón proporcionado, 1 gota de solución de DAB y 1 gota de 30% de H 2 O 2 en 2,5 ml de agua DEPC. Mezclar la solución invirtiendo. </li><li> Tomar 196 l de la solución DAB y añadir 4 l (2%) de solución de inhibidor de RNasa justo antes de la distribución en portaobjetos. Colocar los portaobjetos en una bandeja limpia (pretratados con una solución descontaminante RNAsa superficie) y pusieron los 200 l de solución de DAB en las diapositivas. NOTA: solución DAB debe reaccionar within1 o 2 min. </li><li> Dip desliza rápidamente en DEPC PBS 3 veces para lavar y poner las diapositivas durante unos segundos en etanol absoluto. Seque las diapositivas con un movimiento rápido en el aire (o utilice un soplador de aire). &lt;br /&gt; NOTA: Las diapositivas se pueden almacenar a -80 ° C para su uso futuro o procesado para LCM. </li></ol> Microdissection Capture 5. Láser <ol><li> Descongele las diapositivas rápidamente con un movimiento rápido en el aire (o utilice un soplador de aire). Asegúrese de que las diapositivas de descongelación paso no exceda 5 min. </li><li> Continúe con LCM. Colocar el portaobjetos bajo el microscopio con el lado de la muestra frente a la tapa del tubo recolector. Elija la mejor magnificación para la muestra. Ajuste el enfoque para ver las células de interés. <ol><li> Definir la zona de corte y empezar a cortar con el láser. Recoger las células o pieza de tejido en la tapa del tubo de recogida lleno de 50 l de tampón de lisis (del kit de extracción de ARN) disecados. Asegúrese de que el paso del LCM no exceda de 30 minutos. </li></ol></li><li> Extraer el ARN total de las células aisladas utilizando un kit de extracción de RNA (cf. Lista de materiales). Siga el protocolo del fabricante. <ol><li> Incubar las células recogidas durante 30 min a 42 ° C alisar las células. Pre-condición de la columna de purificación de ARN mediante la adición de 250 l de tampón de acondicionamiento. Cargar 50 l de etanol a las células lisadas. Cargue los 100 l de células lisadas en una columna de purificación previo de adaptación. </li><li> Centrifugar la columna a 16.000 xg durante 2 min a temperatura ambiente. Lavar la columna dos veces con tampones de lavado. Eluyen en el volumen mínimo recomendado (11 l) de RNasa libre de agua (no tratada con DEPC, ya que puede interferir con la Bioanalyser). Mantenga 2 l de calidad de la prueba. NOTA: Todas las soluciones y los reactivos se proporcionan en el kit. </li></ol></li></ol> 6. Síntesis de ADNc y RT-PCR cuantitativa <ol><li> Reverse-transcribir RNA de muestras de células dopaminérgicas láser capturado en ADN complementario usando la transcriptasa inversa y oligo (dT). Siga el protocolo del fabricante (cf. Lista de material). </li><li> Utilice 1 l de ADNc para la amplificación QRT-PCR con cebadores específicos de genes. Configure rea PCRcciones en volumen de 20 l con una mezcla de reacción de arranque en caliente de un solo componente para la PCR cuantitativa recomendada por el fabricante. Realizar cada reacción por triplicado. <ol><li> Para los experimentos descritos aquí, utilice los siguientes pares de cebadores: Gapdh-F (5&#39;-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3 &#39;) / Gapdh-R (5&#39;-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3&#39;); Rpl13a-F (5&#39;-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3 &#39;) / Rpl13a-R (5&#39;-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3&#39;); Th-F (5&#39;-TGG CAG AGG ATG TGT CTC -3 &#39;) / Th-R (5&#39;-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3&#39;); AADC-F (5&#39;-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC-3 &#39;) / AADC-I (5&#39;-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG-3&#39;). </li></ol></li><li> Realizar cuantitativa amplificación por RT-PCR utilizando los siguientes parámetros de los ciclos rápidos: 95 ° C durante 5 min seguido de 45 ciclos de 10 segundos a 95 ° C, 10 seg a 60 ° C y 10 seg a 72 ° C. Realizar un análisis de la curva de fusión utilizando la configuración predeterminada del instrumento para deterla formación de producto homogénea ne. </li><li> Analizar los datos utilizando el software incorporado. <ol><li> Normalizar los valores de expresión de genes marcadores DA Th y AADC con la expresión de los dos genes de referencia GAPDH y Rpl13a para obtener niveles relativos de expresión como se describió anteriormente 14. </li></ol></li></ol>

<ol>
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B., Endo, S., Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Endogenous+Serine/Threonine+Protein+Phosphatase+Inhibitor,+G-Substrate,+Reduces+Vulnerability+in+Models+of+Parkinson's+Disease.">An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson's Disease.</a> Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).</li><li>Pfaffl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Quantification+strategies+in+real-time.">Chapter 3, Quantification strategies in real-time.</a> AZ of quantitative PCR. , (2004).</li><li>Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+ultra-short+immunolabeling+method+for+high-quality+mRNA+preservation+in+laser+microdissection+and+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction).">Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction).</a> The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).</li><li>Podgorny&#301;, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+for+biology+and+medicine.">Laser microdissection for biology and medicine.</a> Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).</li><li>Vandewoestyne, M., ewoestyne &amp; Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).</li><li>Shapiro, J. 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T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+the+genomic+and+proteomic+era:+targeting+the+genetic+basis+of+cancer.">Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer.</a> International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El punto más crítico de este método consiste en etiquetar células de interés, mientras que la prevención de la degradación del ARN. Como ARNasas son activos en soluciones acuosas, la disminución de los tiempos de incubación mejora la conservación de ARN 11,15. Todas las soluciones utilizadas deben ser tratados con DEPC para inactivar RNAsas. Todos los materiales y superficies deben ser tratados con una solución de descontaminación ARNasa superficie para evitar la contaminación ARNasas. Finalmente...

El cerebro se compone de una gran variedad de diferentes tipos de neuronas que forman redes complejas. Estas neuronas se organizan en grupos distintos y subgrupos en función de su morfología, la conectividad y la expresión génica patrón 1. El desarrollo de microarrays, secuenciación de próxima generación, y QRT-PCR ofrecen la posibilidad de comparar los perfiles de expresión genética de poblaciones neuronales en diferentes contextos biológicos 1,2. Estos análisis sensibles requieren la identificación precisa y el aislamiento de los tipos de células de interés mientras se mantiene la integridad del ARN 2-4. Técnica fluorescente de células activadas (FACS) ha sido ampliamente usado para aislar determinados tipos de células basados ​​en marcadores y / o la morfología de la superficie celular. FACS requiere una etapa de disociación de células antes de la clasificación, lo que resulta en una pérdida completa de la resolución espacial 5. Muchos subpoblaciones neuronales se distinguen una de otra de acuerdo con su distribución anatómica en ºe cerebro. Microdisección de captura por láser aplicado en las secciones del cerebro delgadas proporciona una opción apropiada para el aislamiento específico de células con alta resolución espacial 6.8. Una limitación importante de LCM ha sido la necesidad de identificar las células de interés sobre la base de criterios morfológicos o en reporteros de proteínas fluorescentes de ingeniería genética en modelos animales. El desarrollo de nuevas técnicas para llevar a cabo los métodos de immunolabeling rápidas que conservan la integridad del ARN, en combinación con LCM, ahora permite el aislamiento de las subpoblaciones de células para proceder con los experimentos de genes de perfiles. Este enfoque se ha realizado anteriormente y descrito brevemente en pocas publicaciones 1,9-13. Aquí, nos demuestran un procedimiento detallado para obtener ARN de alta calidad a partir de un subconjunto específico de células en una estructura de tejido complejo combinando immunolabeling rápido con LCM. Mostramos cómo realizar los pasos críticos claves para obtener la recuperación de ARN máxima y evitar la degradación del ARN, ya que puede sigsignificativamente el perfil de expresión génica de impacto. Para la demostración de este protocolo, fueron blanco de las neuronas dopaminérgicas del cerebro medio de un día de edad de ratón. Las neuronas dopaminérgicas pueden ser immunolabeled usando un anticuerpo dirigido contra la tirosina hidroxilasa (TH), la enzima limitante de la velocidad para la síntesis de la dopamina. Siguiendo inmunotinción TH, individuo o grupos de neuronas dopaminérgicas entonces se puede aislar usando LCM. Microdissected células se recogen en el tampón de lisis, y se extrae el ARN usando un kit de aislamiento de ARN. Calidad y cantidad de ARN extraído se miden usando un bioanalizador 5. Un análisis más detallado de la expresión génica usando: secuenciación de RNA, microarrays, o QRT-PCR posteriormente se puede realizar 2,4,6. Como ejemplo, una de dos pasos QRT-PCR se demuestra en los dominios aislados dopaminérgicas láser capturado. Cuantificación relativa de los niveles de expresión de dos genes marcadores dopaminérgicos neurona ilustra la selectividad de este protocolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="895">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:420px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Membrane coated slides&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">11505158</td>
			<td>MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 &#181;m; 50 pcs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Surface RNAse decontamination solution</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">AM9780</td>
			<td>RNaseZap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Fixative</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>70% Ethanol kept at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-TH&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Pel-Freez</td>
			<td style="width:99px;">P40101</td>
			<td>&#160;1:25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse free buffer</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:148px;">Promega</td>
			<td style="width:99px;">N2615</td>
			<td>Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Anti-rabbit biotinylated</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">BA-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Vectastain Elite ABC kit Standard</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">PK-6100</td>
			<td>8&#181;l/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DAB Peroxidase Substrate Kit&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">RNA isolation kit</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">KIT0204</td>
			<td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">H2O2 30%</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">HC4060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Ethanol absolute</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Laser microdissection system</td>
			<td style="width:148px;">Leica microsystems</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Model AS-LMD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">DEPC</td>
			<td style="width:148px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:99px;">B22753-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Embedding mold&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:99px;">14702218311</td>
			<td>6x8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Hydrophobic barrier pen&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:99px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Frozen tissue embedding media</td>
			<td style="width:148px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:99px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Bioanalyzer chip</td>
			<td style="width:148px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:99px;">5067-1513</td>
			<td>RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Hot start reaction mix for quantitative PCR</td>
			<td style="width:148px;">Roche</td>
			<td style="width:99px;">6402712001</td>
			<td>Fast Start Essential DNA Green Master</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Reverse transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Life technologies</td>
			<td style="width:99px;">11752-050</td>
			<td>SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna isolation from cell specific subpopulations using laser-capture microdissection combined with rapid immunolabeling

Microdisección de captura por láser (LCM) permite el aislamiento de células específicas a partir de secciones de tejido delgadas con alta resolución espacial. LCM eficaz requiere la identificación precisa de las células subpoblaciones de un tejido heterogéneo. Identificación de células de interés para LCM generalmente se basa en criterios morfológicos o en los periodistas de proteínas fluorescentes. La combinación de LCM y immunolabeling rápida ofrece un medio alternativo y eficientes para visualizar determinados tipos de células y de aislarlos de los tejidos circundantes. ARN de alta calidad puede entonces ser extraído a partir de una población celular puro y se procesa adicionalmente para aplicaciones posteriores, incluyendo ARN de secuenciación, microarrays o QRT-PCR. Este enfoque se ha realizado anteriormente y descrito brevemente en algunas publicaciones. El objetivo de este artículo es ilustrar cómo realizar una rápida immunolabeling de una población celular mientras se mantiene la integridad del ARN, y la forma de aislar estas células específicas mediante LCM. En esto, ilustramosd este procedimiento multi-paso por inmunomarcaje y la captura de células dopaminérgicas en el tejido cerebral de los ratones de un día de edad. Destacamos pasos críticos clave que merecen una consideración especial. Este protocolo se puede adaptar a una variedad de tejidos y células de interés. Investigadores de diferentes ámbitos probablemente se beneficiarán de la manifestación de este enfoque.

Este procedimiento immunolabeling rápida permite la visualización de células de interés mientras se mantiene la integridad del ARN. La Figura 1 ilustra las etapas de preparación de tejido antes de la extracción de ARN. Después de cryosectioning, las neuronas dopaminérgicas están etiquetados utilizando un anticuerpo dirigido contra la tirosina hidroxilasa (neuronas marcadas aparecen en marrón). Dependiendo de la pregunta experimental, las células individuales o mayor región de interés se pue...

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RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

La expresión de genes de un subconjunto de células en un tejido específico representa un reto importante. En este artículo se describe cómo aislar el ARN total de alta calidad a partir de una población de células específicas mediante la combinación de un método immunolabeling rápida con láser captura microdissection.

Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

rna-isolation-from-cell-specific-subpopulations-using-laser-capture

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K vistas.  Université Laval.  La expresión de genes de un subconjunto de células en un tejido específico representa un reto importante. En este artículo se describe cómo aislar el ARN total de alta calidad a partir de una población de células específicas mediante la combinación de un método immunolabeling rápida con láser captura microdissection. 

Video: RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

Láser microdisección de captura de tejidos de mamíferos

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Investigación

Biología

RNA Extraction from Neuroprecursor Cells Using the Bio-Rad Total RNA Kit

La extracción de RNA a partir de células Neuroprecursor utilizando el kit de Bio-Rad ARN total

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This methods paper describes how to isolate mid-to-late stage follicles (Stage 10B-14) and utilize them to provide new insights into the molecular and morphologic events occurring during tight windows of developmental time. Isolated follicles can be used for a variety of experimental techniques, including in vitro development assays, live imaging, mRNA expression analysis and western blot analysis of proteins. Follicles at Stage 10B (S10B) or later will complete development in culture; this allows one to combine genetic or pharmacologic perturbations with in vitro development to define the effects of such manipulations on the processes occurring during specific periods of development. Additionally, because these follicles develop in culture, they are ideally suited for live imaging studies, which often reveal new mechanisms that mediate morphological events. Isolated follicles can also be used for molecular analyses. For example, changes in gene expression that result from genetic perturbations can be defined for specific developmental windows. Additionally, protein level, stability, and/or posttranslational modification state during a particular stage of follicle development can be examined through western blot analyses. Thus, stage-specific isolation of Drosophila follicles provides a rich source of information into widely conserved processes of development and morphogenesis.

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

Stage-specific isolation of mid-to-late Drosophila follicles is useful for a variety of purposes. Such follicles develop in culture, which allows for genetic and/or pharmacologic manipulations to be coupled with in vitro development assays and live imaging. Additionally, follicles can be used for molecular studies, such as isolating mRNA and protein.

La utilidad de la etapa específica-Mediados o finales<em&gt; Drosophila</em&gt; Aislamiento folículo

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Aislamiento de ARN de ratón Páncreas: Un tejido de ribonucleasa-rica

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

El aislamiento de regiones genómicas específicas e identificación de moléculas asociadas por enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Perfiles de celular-tipo-específico epigenoma

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral lipids encased by a monolayer of phospholipids and proteins. Hepatic LD lipids, such as ceramides, and proteins are implicated in several diseases that cause hepatic steatosis. Although previous methods have been established for LD isolation, they require a time-consuming preparation of reagents and are not designed for the isolation of multiple subcellular compartments. We sought to establish a new protocol to enable the isolation of LDs, endoplasmic reticulum (ER), and lysosomes from a single mouse liver.
Further, all reagents used in the protocol presented here are commercially available and require minimal reagent preparation without sacrificing LD purity. Here we present data comparing this new protocol to a standard sucrose gradient protocol, demonstrating comparable purity, morphology, and yield. Additionally, we can isolate ER and lysosomes using the same sample, providing detailed insight into the formation and intracellular flux of lipids and their associated proteins.

This protocol establishes a novel method of lipid droplet isolation and purification from mouse livers, using a well-established endoplasmic reticulum isolation kit.

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Un protocolo de microdisección de captura láser que produce ARN de alta calidad a partir de huesos de ratón congelados

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...