المساعدة التقنية التي تقدمها Jaipreet Bharj. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الاتحاد الأوروبي FP7 (SYSCILIA -241955) والكلى الهولندي مؤسسة (CP11.18).

بيان الأخلاق: يتم تعريف الحيوان الصيانة، وتربية، والإجراءات والتي تسيطر عليها الحيوانات (إجراءات علمية) لعام 1986. وقد تم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات تحت الرخص التي تمنحها وزير الداخلية (PIL رقم 70/7892) في الامتثال البيولوجية المجموعة خدمات الإدارة واللجنة الأخلاقية الخدمات البيولوجية، SGUL، لندن، المملكة المتحدة. تم بذل كافة الجهود لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة وتحسين كل الإجراءات وتربية من أجل تقليل المعاناة وتعزيز الرفاه. 1. إعداد الآلات، مخدر، ونيون صبغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجتذب ممص مكروى والشعيرات الدموية معيار البورسليكات جدار (بدون خيوط) سحب الإبر من طول مناسب ل microinjection (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العفن الاغاروز عن التوجه للأجنة للحقن سهلة في التامور (الشكل 1B). الغراء ما يقرب من عشرة الزجاج المجهر SLايديس معا لتشكيل &quot;درج&quot; من الشرائح الإزاحة. للحصول على أفضل النتائج، استخدم قطرة من مجموعة السريع راتنجات الايبوكسي الغراء في وسط كل شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قسم من حوالي 78 ملم في الطول في منتصف الطريق من خلال اثنين من الماصات البلاستيكية 10 مل باستخدام مشرط ساخنة بنسن الموقد، وإزالة ماصة تنتهي حسب مقتضى الحال. نعلق وأقسام الغراء (راتنجات الايبوكسي) ماصة على الشرائح الزجاجية مكدسة لتوفير الاستقرار للسماح القالب الى الانخفاض الى 90 ملم طبق بتري. بذل كل جهد ممكن لضمان زوايا الشريحة محاذاة عمودية على الأرض طبق بتري. إتاحة الوقت الغراء لتعيين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلقي العفن في حل الاغاروز 2٪ مصنوعة في أسماك المياه (تم الحصول عليها من الحوض). صب الاغاروز إلى 90 مم طبق بتري ووضع القالب على رأس طبق بيتري مفتوحة، والسماح الشريحة مكدسة حواف لغمر في زاوية تحت سطح الاغاروز. تترك لتعيين على مقاعد البدلاء المختبر لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة يلقي الشرائح وتغطية الاغاروز-مطبوع الشريحة مع أسماك المياه العذبةتحتوي تريكين مخدر (راجع الخطوة 1.9) في نسبة 01:25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حلول رودامين ديكستران (RD) صباغة. في resuspend رودامين B 10،000 ميغاواط المسمى ديكستران في الماء عالى النقاء تعقيمها لجعل تركيز الأسهم من 50 ملغ / مل. ل microinjection، مما يخفف من الأسهم إلى التركيز النهائي من 5 ملغ / مل في تعقيمها الماء عالى النقاء. ملاحظة: تبدأ الخلايا الصباغية للتمييز في الزرد من 24 الإخصاب آخر ساعة (HPF)؛ هذه يمكن أن يحجب علامات الفلورسنت خلال الحصول على الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمنع تشكيل الخلايا الصباغية باستخدام N -Phenylthiourea (PTU)، الذي يمنع استحداث الميلانين عن طريق تثبيط التيروزينات. جعل 0.003٪ محلول المخزون من PTU عن طريق إذابة مسحوق PTU في مياه حوض السمك، حل الحرارة عند 60 درجة مئوية إلى ذوبان تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة الزرد في الميثيلين الأزرق الحل، للفطريات معتدل، لمنع تكاثر الفطريات وزيادة البقاء على قيد الحياة. إضافة 2 مل من محلول المخزون الميثيلين الأزرق، تحتوي على 0.1٪ الميثيلين الأزرق في شالمياه ltrapure، إلى 1 L من مياه حوض السمك واستخدام كوسط الجنين القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل 15 ملي تركيز الأسهم من تريكين الملح methanesulfonate / إيثيل 3-أمينوبنزوات وفقا للتعليمات في &#39;الزرد كتاب &quot;23. تخدير الأجنة وبالتالي يجمد لهم لتنفيذ الإجراء حقن مكروي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التخدير الأجنة، توجيههم، للتصوير باستخدام خصائص غير سامة وزجة من ميثيل. لجعل إعداد 200 مل من 3٪ ميثيل، هدئ 130 مل من الماء عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ومكان على الجليد. حرارة 70 مل من الماء إلى 80 درجة مئوية في كوب من الزجاج، إضافة 6 غرام من ميثيل، وتستنهض الهمم باستخدام قضيب الزجاج حتى يتم المبللة جميع الجزيئات وفرقت بالتساوي. يضاف الماء المثلج، وخلط، والسماح للإعداد لتبريد عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل aliquoting إلى 50 مل أنابيب. ملاحظة: تخفيض درجة حرارة يسمح للميثيل لتصبح قابلة للذوبان. فإن الحل يصبح أكثر سمكاكما هيدرات مسحوق. ويمكن تخزين 3٪ ميثيل دون نمو البكتيريا لفترات قصيرة من أسبوع في 4 درجات مئوية أو أكثر في -20 ° C. تأكد من وصلت ميثيل RT قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء حقن صبغة الفلورسنت في الزرد استخدام حقن مكروي القياسية انشاء (الشكل 1C). هذا يتكون من ضاغط الهواء متصلة نظام منظم الضغط الذي يغذي حامل ماصة على التوالي للاستخدام مع 1.0 الشعيرات الدموية قطرها الخارجي. يجب أن يضم حامل ماصة ضمن المدمجة 3 محاور السيطرة مياداة مجهرية MM33 المضمون إلى قاعدة لوحة الصلب من الوقوف المغناطيسي. يمكن تصور الأجنة، التلاعب وحقن باستخدام مجهر تشريح ستيريو. </li></ol> 2. الزرد تربية ومعالجات ما قبل الحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الزرد كما هو موضح سابقا 23. استخدام حوض للماء انشاء أن توفر المياه إعادة تدوير الموردة في درجة حرارة ثابتة من 28.5 ° C، مكيفة لدرجة الحموضة 6،8-7،2 والتوصيل من 450-550 ميكرو ثانية مع بيكربونات الصوديوم والفوري المحيط ملح البحر، على التوالي. استخدام wildtype أو خطوط الزرد المعدلة وراثيا بما يتناسب مع التجربة، والحفاظ على كثافة التخزين من 15 من الذكور و 15 من الإناث في 8 L دبابات. تعيين photocycle منشأة الأسماك إلى 14 ساعة من ضوء النهار بين 09:00 حتي 11:00. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يبدأ وضع البيض الزرد في بداية photocycle، عند تشغيل أضواء على في الصباح. لضمان أقصى قدر من البيض يمكن جمع من دون إزعاج الأسماك وتربية غمر الدبابات (التي تحتوي على إدراج عيون، المتاحة من المتخصصين الزرد) في خزانات الأسهم wildtype المساء قبل المجموعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم جمع، والسماح 30 - 40 دقيقة للأسماك لتفرخ، وبعد ذلك جمع وشطف البيض باستخدام مصفاة الشاي والمياه حوض السمك الطازج. إيداع البيض تنظيفها في 90 ملم طبق بتري تحتوي على المتوسط ​​الجنين واحتضان عند 28.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الأجنة مع PTU لمنع بميلانوسفر التكوين. في 8 HPF، ونقل الأجنة قابلة للحياة في الحد الأدنى من السائل إلى أطباق بتري الطازجة التي تحتوي على 1: 100 PTU إلى الجنين المتوسطة وزيادة احتضان عند 28.5 درجة مئوية حتى 72 HPF. ملاحظة: PTU يمكن أن يسبب تشوهات تنموية في حالة استخدامها في المراحل المبكرة لذلك ينبغي أن يقتصر على الرد على 8 مراحل HPF، ولكن يمكن علاجها في وقت متأخر من 24 HPF. بالإضافة متأخرة من PTU لا يمنع تماما تصبغ العين ولكن ناجحا بشكل عام وعرقلة تشكيل جذع الصباغية. </li></ol> 3. حقن مكروي ملاحظة: التامور يغلف القلب ولكن يتم فصل لحماية وسهولة حركة عضلة القلب عن طريق السوائل داخل تجويف التامور. والهدف من هذا الإجراء هو لحقن RD في تجويف التامور، وهذا يسمح لامتصاص السريع للصبغ لنظام الأوعية الدموية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبر الحمل مع 6 ميكرولتر - المخفف RD، وذلك باستخدام نصائح microloader وآمنة في حامل إبرة من مياداة مجهرية. كسر نهاية الإبرة باستخدام تيب غرامةملقط إد (الشكل 1A). نقل حل RD إلى رأس الإبرة من خلال تعظيم مدة النبضة إلى الإعداد دقيقة، يعود مرة أخرى الى ميللي ثانية مرة واحدة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ميكرومتر المرحلة، ومنظم ضغط، والتحسينات على طول طرف الإبرة (باستخدام ملقط) لضبط حجم القطيرات طرد إلى 100 ​​ميكرون في القطر، وهذا يعادل 0.5 حجم نيكولا لانغ (الشكل 2A). ملاحظة: عندما كسر الإبرة، ويجب الحرص على عدم كسر الكثير من إلا فإنه سوف يجعل معايرة حجم الحقن صعوبة. إذا لزم الأمر، مما كسر رأس الإبرة لزيادة حجم قطرة ومع ذلك، والحفاظ على سمك الإبرة التي تسمح بدخول التامور دون الانحناء المفرط أو تلف الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الحقن، تخدير الأجنة في المتوسط ​​الجنين تحتوي على تريكين. إعداد 2 × 35 مم أطباق بتري تحتوي على 5 مل المتوسطة الجنين، تسمية واحدة &quot;تريكين&quot; و &quot;استعادة&quot; الآخرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200ميكرولتر من الأسهم تريكين إلى الطبق المسمى بشكل مناسب. مرة واحدة على استعداد للحقن، حدد الجنين الفردي في 72 HPF ونقل في الحد الأدنى من السائل إلى طبق تريكين. مراقبة نشاط الجنين، اختبار هو تخدير الجنين ويجمد قبل الإثارة لطيف باستخدام طرف microloader اقتطاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجنين تخدير لحقن القالب وتوجيه الجنين داخل الحوض الصغير الاغاروز وبالتالي فإن الجانب الأيسر يكون مواجها لها، وتحديد المواقع القلب إلى اليسار من مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحقن RD في القلب، يخترق التامور مع الإبرة وحقن 1 NL من RD في تجويف التامور الجنين مخدرة (الشكل 2B، اللوحة اليمنى). سحب الإبرة بعد الحقن. نقل الأجنة المحقونة في الحد الأدنى من السائل إلى &quot;طبق الانتعاش&quot; ورصد لمدة 1 دقيقة. نقل الجنين الفردية إلى لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل المتوسطة الجنين العذبة (التي تحتوي على PTU) وتسمية مناسب. ملاحظة: إن التامور صعبة، ولكن هناك نقطة ضعف بارزة عند تقاطع حيث يلتقي التامور الأقواس البلعومية-ventro الذيلية وظهراني منقاري الكيس المحي (الشكل 2B رأس السهم). وينبغي توجيه الإبرة إلى هذا الأخدود. عندما الإبرة في مكان، وسوف الصنبور حازما من إصبع على رأس مياداة مجهرية تسهيل الدخول إلى جوف التامور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،2-3،6 لا يقل عن 10 الأجنة في المجموعة التجريبية، وضع كل السمك في بئر مستقل وفريد ​​labelto تصريح فرد التجريبية المتابعة. احتضان عند 28.5 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. </li></ol> 4. التصوير اكتساب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 3 آخر ساعة حقن (HPI) تخدير الأجنة كما هو موضح سابقا ونقل إلى طبق بيتري 35 ملم تحتوي على 3٪ ميثيل. دفع بلطف الأجنة في ميثيل وتوجيه بحيث يمكن تصوير الجانب الوحشي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة للجنين تحت الأشعة فوق البنفسجية، وذلك باستخدام فلتر لالتصور سو ينبعث الضوء في 570 نانومتر (الشكل 2C). بعد الحصول على الصور، والسماح للجنين لاستعادة قبل استبدال في المعين جيدا. الحصول على صور لجميع الأجنة المحقونة ومواصلة احتضان عند 28.5 درجة مئوية. ملاحظة: في هذا البروتوكول استخدمنا stereomicroscope الفلورسنت مع مجموعة مرشح TXR، وكاميرا DFC300FX وبرامج التطبيق المطلوب. تقديم مذكرة من إعدادات اكتساب الدقيقة لالتقاط صور لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 24 HPI، والحصول على جولة ثانية من الصور كما هو موضح أعلاه. مرة واحدة وقد تم الحصول على جميع الصور، سواء HPI 3 و 24 HPI، والتخلص من الأجنة إنسانية أو استخدام وسائل تجريبية أخرى مثل المناعية. </li></ol> تجهيز 5. صورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كثافة الفلورسنت من كل جنين المحقون في 3 و 24 HPI الفقر البشري، من خلال تحليل الصور باستخدام برنامج يماغيج NIH ل. لقياس كثافة الفلورسنت، وفتح صورة في يماغيج وتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في 100 بكسل 2 (تحرير → → اختيار التحديد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القلب في مركز العائد على الاستثمار (الشكل 2C)، تعيين القياسات لتشمل يعني مقياس الرمادية والمنطقة (تحليل قياسات → مجموعة)، نفذ القياس (قياس تحليل →). استكمال لكل مجموعة من الصور، في 3 HPI و 24 HPI، في الجنين ونقل متوسط ​​قيم مقياس الرمادية إلى جدول بيانات لمزيد من المعالجة. ملاحظة: اخترنا حجم العائد على الاستثمار الثابت 100 بكسل (2)، هذا يشمل قلوب الفردية بين الأجنة. وقد تم اختيار القلب لإجراء قياسات نظرا لحجمها الكبير يتيح موقع مناسب لقياس المحتوى الفلورسنت من الدم قبل الدخول في الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء التحليل الإحصائي باستخدام البرامج الإحصائية المناسبة. مقارنة المجموعات إحصائيا باستخدام اختبار t الطالب. </li></ol>

<ol>
	<li>Hentschel, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).</li><li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+zebrafish+kidney:+a+tale+of+two+tubes.">Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes.</a> Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).</li><li>Ma, M., Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged2a-notch+signaling+mediates+cell+fate+choice+in+the+zebrafish+pronephric+duct.">Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct.</a> PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).</li><li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros.">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).</li><li>Cardenas-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+CCDC28B+reveals+its+role+in+ciliogenesis+and+provides+insight+to+understand+its+modifier+effect+on+Bardet-Biedl+syndrome.">Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome.</a> Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).</li><li>Osborn, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+FTO+antagonises+Wnt+signaling+and+leads+to+developmental+defects+associated+with+ciliopathies.">Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies.</a> PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).</li><li>Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+body+stability+and+ciliogenesis+requires+the+conserved+component+Poc1.">Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1.</a> J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).</li><li>Tobin, J. L., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+renal+function+in+zebrafish+models+of+ciliopathies.">Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies.</a> Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).</li><li>Torres, V. E., Harris, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease:+the+last+3+years.">Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years.</a> Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).</li><li>Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+-+clinical+and+genetic+aspects.">Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects.</a> Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).</li><li>Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystic+kidney+disease.+1:+Identification+and+analysis+of+the+primary+defect.">Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect.</a> J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).</li><li>Reynolds, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+splicing+in+the+PKD2+gene+as+a+cause+of+polycystic+kidney+disease.">Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease.</a> J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).</li><li>Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-2+localizes+to+kidney+cilia+and+the+ciliary+level+is+elevated+in+orpk+mice+with+polycystic+kidney+disease.">Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease.</a> Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).</li><li>Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polycystic+kidney+disease+proteins,+polycystin-1,+polycystin-2,+polaris,+and+cystin,+are+co-localized+in+renal+cilia.">The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia.</a> J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).</li><li>Baker, K., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+cilia+in+disease:+the+human+ciliopathies.">Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies.</a> Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).</li><li>Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+and+signaling+pathways+in+mammalian+development,+health+and+disease.">Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease.</a> Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).</li><li>Hruscha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/Cas9+genome+editing+with+low+off-target+effects+in+zebrafish.">Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Eisen, J. S., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+morpholino+experiments:+don't+stop+making+antisense.">Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense.</a> Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).</li><li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish:+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration.">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bardet-Biedl+syndrome).">Bardet-Biedl syndrome).</a> Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).</li><li>Corbetta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+simple+kidney+cysts+in+patients+with+primary+hyperparathyroidism.">High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism.</a> J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).</li><li>Veleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+Bardet-Biedl+syndrome+gene+BBS9/PTHB1+leads+to+cilia+defects.">Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects.</a> PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).</li><li>Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).</li><li>Chang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permselectivity+of+the+glomerular+capillary+wall+to+macromolecules.+II.+Experimental+studies+in+rats+using+neutral+dextran.">Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran.</a> Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الزرد تقدم أداة قيمة لنموذج مرض وراثي البشري، فإن استخدامها كأداة العلمي لفي الجسم الحي الأبحاث مكنت الدراسات التفصيلية للانهيار الجيني للكثير من النظم البيولوجية، بما فيها الكلى. ومن المفهوم كثيرا الآن عن كيفية تطور الكلى الزرد ووظائفها. أوجه الشبه اللافتة ل?...

الكلى البشري يلعب دورا حاسما في تصفية النفايات الأيضية من الدم واستعادة المواد المذابة اللازمة للحفاظ على التوازن الخلوي. وهناك عدد من الأمراض الوراثية البشرية التي تسبب خلل في الكلى. المرض الكلوي ورثت الأكثر شيوعا هو مرض وراثي جسمي الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) التي تتميز تطوير السوائل تملأ الأكياس داخل الأنابيب الكلوية. الأضرار الناجمة عن تكون الكيسة يضر ظائف الكلى 10. ADPKD لديه قوع 1: 800-1: 1،000 والحسابات لمدة 8 - 10٪ من مرضى الفشل الكلوي في المرحلة النهائية (ESRF) 11. قد تورطت عدة جينات أن تسبب ADPKD بما في ذلك polycystin-1 (PKD1) و-2 (PKD2)، وهو ما يمثل حوالي 85٪ و 15٪ من الحالات على التوالي 12،13. وعلاوة على ذلك، والمنتجات الجين لPKD1 و-2 توطين إلى هدب وأساسية لتكون الأهداب 14،15. هناك الآن عائلة المعترف بها من الاضطرابات الجينية البشرية، والمعروفة باسموciliopathies، والتي تؤثر على وظيفة الأهداب ويؤدي في CKD 16. عدد متزايد من الأمراض الوراثية البشرية التي تؤثر على التنمية الهدبية وظيفة يستحوذ على اهتمام العالمية في هذا عضية أثرية مرة واحدة في الاعتبار. وهدب، نتوء الخلوي يشبه الشعر، وأثرى مع مستقبلات والقنوات الأيونية اللازمة لتنبيغ أحداث خلية يشير الرئيسية. يتكون هدب من الخيط المحوري القائم على أنيبيب، منظم عادة إلى تسع الحلل أنيبيب ترتيب شعاعيا مع أو بدون زوج المركزي من الأنابيب الدقيقة القميص. يحدد هيكل axonemal نوع وطريقة العمل الهدبي. الترتيب أنيبيب 9 ​​+ 2 يضفي حركية إلى هدب حيث يتم استغلاله في حركة السوائل عبر الأسطح الظهارية. التكوين 9 + 0 هو غير متحركة ولكن يعتقد أن وظيفة بشكل رئيسي في أحداث الإشارات الخلوية 17. وبصرف النظر عن CKD، عواقب ضعف الهدبية هي مجموعة من الخصائصميزات ciliopathy التي تشمل، والسمنة، وتنكس الشبكية، كثرة الأصابع، وضعف الادراك 16. ومع ذلك، CKD هو من بين الأكثر تضر نوعية حياة المريض، وبالتالي قوة دافعة رئيسية وراء تطوير الاقتضاء في النماذج الحية لالهدبية المتعلقة CKD. الزرد هو نموذج ممتاز لفهم مسببات مرض وراثي البشري. تطور سريع، وإنتاج عدد كبير من البيض والأنسجة شفافة، ونمو الرحم السابقين يسمح العمليات التنموية الزرد إلى أن تصور والأحداث البيولوجية التلاعب مع سهولة كبيرة. الجينات يمكن تعديلها وراثيا باستخدام النجاح الذي تحقق مؤخرا من أدوات التحرير الجينوم (كريسبر 18 و TALENS 19)، طرقت أسفل باستخدام العقاقير تكنولوجيا morpholino 20، أو ينظم دواء عن طريق إضافة مركبات لبيئتها المائية. في الواقع، الزرد توفر منصة للقيام البريدxperiments التي ليست متساهلة في النماذج الحيوانية الأخرى. في حين الزرد هي الفقاريات بسيطة نسبيا (مقارنة مع البشر) أنها تشترك في العديد من أجهزة الحفظ وظيفيا، والجينات، والعمليات يشير مشتركة مع البشر. على سبيل المثال، الكلى الزرد يشبه بشكل ملحوظ في البنية والوظيفة مقارنة مع 21،22 البشر. ولكن، خلافا الكلى الثدييات التي تطور من خلال سلسلة من المراحل، وتميز كل من الكلى أكثر تطورا (سليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية)، والزرد الجنينية يتطور إلا سليفة الكلوة، الشكل الأكثر غير ناضجة من الكلى. بينما الملايين من النيفرون يمكن العثور على تشكيل اللبنات في الكلى الثدييات، الجنين الزرد تمتلك اثنين فقط. وتنصهر الكبيبات، والتي تسمح للرشاحة الدم الأولي، في خط الوسط فقط بطني إلى الشريان الأورطي. مرشحات الدم خلال الكبيبات في الأنابيب سليفة الكلوة التي تعمل نحو caudally على طول المحور، التفجير قبل الخروج عبر مجرور. وتو سليفة الكلوةومهدبة bules بشكل كبير مع أهداب متحركة التي تبيحه لتدفق الترشيح نحو الخروج الذيلية 3،4. يحافظ هذا الهيكل سليفة الكلوة بسيط التوازن الزرد من خلال عدة أسابيع من نمو اليرقات حيث تطوير في نهاية المطاف إلى mesonephros بنية أكثر تعقيدا 21. ومع ذلك، فإن الزرد أبدا يطور الكلوة التالية 21. وعلى الرغم من الخصوصيات الزرد، ومجزأة وكليون الزرد مع ملامح التعبير الجيني مساوية لتلك التي لوحظت في الثدييات، وبالتالي يوفر منقطع النظير في نموذج الجسم الحي لتكون الكلية 3،22. عادة يتم اختبار المرضى لوظائف الكلى من خلال سلسلة من اختبارات الدم والبول. وعادة ما يتم تحليل الدم لمدة الأملاح الذائبة واليوريا والكرياتينين. مستويات عالية من اليوريا والكرياتينين وتركيز الملح غير طبيعية تدل على مشاكل في وظائف الكلى. تحليل البول باستخدام مقياس اللونية بالكشف عن مستويات غير طبيعية من البروتين، blooد، والقيح، والبكتيريا والحاضر السكر في عينات البول. هذه الاختبارات تتطلب عادة حوالي 30 مل من البول أو من 5 - 10 مل من الدم. فقد كان من الصعب ترجمة هذه الأنواع من المقايسات للمشاريع الصغيرة في الكائنات نموذج الجسم الحي، مثل الزرد، ويرجع ذلك أساسا إلى طبيعة مستحيلة لجمع الدم أو البول الكافي لإنجاز الفحص. هنا، نحن معالجة نقص الزرد اختبارات وظائف الكلى المناسبة ووصف تقنية مبتكرة لدراستها. عن طريق حقن صبغة الفلورسنت في مجرى الدم ونحن قادرون على رصد وتحديد فردي مع مرور الوقت الترشيح وإفراز النشاط الفلورسنت من الدم عن طريق الكلى. هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة تلف الكلى الناجمة عن المرض، ونحن نوفر مثال.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

يقدم الجنين الزرد نموذج لين العريكة لدراسة توالد ونموذج مرض وراثي البشري. وعلى الرغم من بساطتها النسبية، والكلى الزرد يتطور وظائف في تقريبا بنفس طريقة البشر. وهناك فرق كبير في بناء الكلى البشرية هو وجود الملايين من النيفرون مقارنة الزرد التي لديها اثنين فقط. ومع ذلك، وتبسيط مثل هذا النظام المعقد إلى وحدات وظيفية أساسية ساعدت فهمنا لكيفية تطور الكلى ويعمل. في الزرد، خط الوسط تقع الكبيبة هو المسؤول عن ترشيح الدم الأولي إلى قسمين الأنابيب سليفة الكلوة أن تتباعد لتشغيل ثنائيا أسفل محور الجنينية قبل التفجير لبعضها البعض في مجرور. يتم ملؤها الأنابيب سليفة الكلوة بشدة من أهداب متحركة تسهل حركة الترشيح على طول أنبوب صغير مجزأة، والسماح للتبادل مختلف المواد المذابة قبل أن تخرج في النهاية عن طريق مجرور 2-4. العديد من الجينات المسؤولة عن CKD، المؤتمر الوطني العراقيluding تلك المتعلقة تكون الأهداب، وقد درس في الزرد 5. ومع ذلك، تجذب أعدادا كبيرة وقد ظهر صعوبة في تقييم وظائف الكلى الزرد بعد التلاعب الجيني. المقايسات التقليدية لقياس خلل في الكلى في أثبتت البشر غير متعدية إلى الزرد، ويرجع ذلك أساسا إلى بيئتها المائية وحجم صغير. على سبيل المثال، فإنه من غير الممكن جسديا لاستخراج الدم من الجنينية نظمت الأسماك لتحليل اليوريا والكرياتينين المحتوى، كما أنها صغيرة للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، الزرد لا تنتج ما يكفي من البول لاختبار على بروتينية بسيطة &quot;مقياس&quot;، والتي غالبا ما يتم تنفيذ أثناء الفحوص الأولية المريض. نحن تصف فحص الفلورسنت التي تستخدم الشفافية البصرية من الزرد لمراقبة كميا إزالة صبغة الفلورسنت، مع مرور الوقت، من الأوعية الدموية والخروج من خلال الكلى، لإعطاء قراءة من وظيفة الكلى 1،6-9.

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي ciliopathy غير متجانسة نادر يصيب حوالي 1: 160،000 شخص في العالم 16. المرضى الحالي مع عدد من المشاكل المرتبطة بما الكلى المتعدد الكيسات، في وقت لاحق المرضى في كثير من الأحيان يتطلب الغسيل الكلوي أو زرع 24. ESRF هو السبب الأكثر شيوعا للوفاة في BBS...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay at JoVE.com

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

الزرد هو أداة شعبية لنموذج مرض الكلى المزمن (CKD). ومع ذلك، حجمها صغير يجعل من المستحيل لتقييم وظائف الكلى باستخدام الطرق التقليدية. نحن تصف الفلورسنت الكلى صبغ إزالة الفحص 1 التي تسمح التحليل الكمي وظائف الكلى الزرد في CKD.

تقييم الزرد وظائف الكلى باستخدام التخليص الفحص الفلورسنت

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  University College London.  الزرد هو أداة شعبية لنموذج مرض الكلى المزمن (CKD). ومع ذلك، حجمها صغير يجعل من المستحيل لتقييم وظائف الكلى باستخدام الطرق التقليدية. نحن تصف الفلورسنت الكلى صبغ إزالة الفحص 1 التي تسمح التحليل الكمي وظائف الكلى الزرد في CKD. 

Video: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

باستخدام optokinetic استجابة لدراسة وظيفة البصرية من الزرد

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

في الوريد من يرقات اسماك الزرد Microinjections لدراسة إصابة الكلى الحاد

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

تشريح الكلى اسماك الزرد الكبار

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

والفحص الفحص نيون لتحديد المغيرون من القنوات GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

صيانة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; عدد السكان قفص

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...