وأيد هذا العمل من خلال تمويل لRAW مما يلي: المعاهد الوطنية للصحة منح K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237. مسيرة الدايمات باسل أوكونور كاتب الباحث جائزة منحة # 5 FY12-75. بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية؛ وهدية سخية للجامعة نوتردام من إليزابيث ومايكل غالاغر نيابة عن غالاغر الأسرة لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر الموظفين من قسم العلوم البيولوجية على دعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاهية لدينا مستعمرة الزرد. أخيرا، نشكر أعضاء مختبر أبحاثنا على تعليقاتهم والمناقشات والرؤى عن هذا العمل.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هنا، التي وصفناها الأساليب التي تمكن التصور من مكونات قطاع كليون في الزرد الكبار. حقن تقارن ديكستران الفلورسنت يمكن وضع العلامات PCT تفضيلية بسبب خصائص التقامي هذه الخلايا نبيب الداني 30،38. هذه الطريقة لا يمكن أن يؤديها مع مرونة كبيرة بسبب وجود dextrans التي يمكن الحصول عليها مع سرب من تقارن الفلورسنت مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام dextrans يسين قابل للتثبيت هو وسيلة مريحة وخاصة لتسمية قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات، وليس مطلوبا من إجراءات وضع العلامات الثانوية. وهذا يتيح الكشف عن إشارة واضحة نسبيا ومتوافق مع العديد من العلامات الأخرى الفلورسنت، immunolabeling، واستخدام خطوط مراسل المعدلة وراثيا. وضع العلامات الفوسفاتيز القلوية يصادف أيضا نبيب الداني، مع تفاعل قوي في معاهدة التعاون بشأن البراءات وأضعف قليلا التفاعل في PST. أخيرا، وتلطيخ DBA يمكن وسم قطاعات أنبوب صغير البعيدة، والتي عرض الفصلaracteristic تشعبت التشكل. مختلف الجزيئات كتين، والتي هي بروتينات ملزمة السكر المنشأ nonimmune، وقد استخدمت على نطاق واسع للتمييز بين شرائح كليون الثدييات 47. ومن المثير للاهتمام أن DBA في الزرد يرتبط مع شرائح أنبوب صغير البعيدة، كما انها تستخدم للاحتفال القنوات جمع في الكلى الثدييات 47. أخذت معا، وهذه الأساليب يمكن استخدامها في تركيبات مختلفة لتوثيق تكوين الكلوي وظيفة. حيث أن جميع هذه الأساليب يمكن استخدامها في الأعمال التحضيرية الكلى كلها، لأنها توفر أدوات لتقييم هيكل كليون وظيفة في جميع أنحاء الجهاز دون الاعتماد كليا على استخدام المزيد من الوقت تستغرق وأساليب مملة، على سبيل المثال، العمل cryosection وimmunolabeling. ومع ذلك، فإن البقع الموضحة في هذه المقالة الأساليب هي قابلة للحياة في cryosection. تحليل عينات Cryosection يولد (مقارنة كله جبل) التي هي أكثر ملاءمة لالمناعية للكشف عن pepti محددةقصر، على الرغم بالطبع هذا النوع من التحليل يتطلب توافر الأجسام المضادة الأولية المناسبة. للأسف الحد رئيسي واحد في العمل مع نموذج حيواني الزرد يبقى توافر الفقراء من الأجسام المضادة. وهكذا تبقى WISH الأكثر استخداما، أي &quot;بأول ل،&quot; إجراء لتحليل التعبير الجيني. أتمنى باستخدام تفاعلات الركيزة BCIP، NBT، و / أو INT لإنتاج رواسب الأرجواني أو الأحمر غير متوافق مع تلطيخ الفلورسنت على cryosections. ويتمثل أحد الخيارات لاستدعاء استخدام الكشف WISH الفلورسنت، وهو الإجراء الذي تم الأمثل لعينات الجنينية الزرد، ويمكن أن تكون مصممة للاستخدام مع الكلى الكبار. وصف الأساليب في هذه المقالة الفيديو يجب أن تسمح لمزيد من التجارب مع تقنيات مثل WISH الفلورسنت في تركيبة مع خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي وصفت شرائح الفردية مع مراسل مثل EGFP أو mCherry. بدلا من ذلك، الأساليب المذكورة هنا قد يزيد عدد الجياعد يتم اختبارها في تركيبة مع الأصباغ الحيوية الأخرى، على سبيل المثال، يكتينس الأخرى. وبالتالي، يمكن الاحتجاج مزيد من التكيف وتوسيع الطرق الموضحة هنا لتناسب احتياجات الباحث عن كامل الاستعدادات جبل الكلى والتحليل. على هذا النحو، وهذه الأساليب لها إمكانات العامة للتنفيذ مع نموذج الزرد للدراسات تجديد الجارية، وكذلك في النمذجة مرض وراثي. هناك حاجة ملحة للبحث والعلاجات المبتكرة للالآلام الكلوية. الملايين من الناس يعانون من شكل ما من أشكال أمراض الكلى في كل عام أن ينتج عن أسباب خلقية، الحادة و / أو المزمنة. وعلاوة على ذلك، وانتشار أمراض الكلى في ارتفاع مستمر في جميع أنحاء العالم، مما يجعل هذه الأمراض مشكلة صحية عامة عالمية 14،15. تتوفر العلاجات مثل غسيل الكلى حيث تخدم آلة غسيل الكلى الخارجية لتخليص دم المريض من النفايات الأيضية إذا كلاهم ليست قادرة على أداء هذا الدور. للأسف، هذا التدخل له حدود، والعلاج الجارية ضرورية من أجل البقاء. وعلاوة على ذلك، سوف تحتاج في نهاية المطاف مرضى زرع الكلى، والذي يمكن أن يستغرق سنوات للحصول مرة واحدة يتم وضع المريض على قائمة الانتظار. حتى بعد الحصول على عملية زرع الكلى، العديد من المرضى يعانون من آثار سلبية نتيجة لهذا الإجراء، ويجب أن المعركة هذه الآثار لبقية حياتهم. هذه الصعوبات تظهر الحاجة جادة لتطوير علاجات جديدة لمساعدة إما منع أمراض الكلى أو ربما إلى زيادة تجديد الأنسجة 8،16،52،53. نظرا للقيود أخلاقية واضحة لاستخدام اختبار المواضيع الإنسان في المختبرات الطبية الحيوية، النماذج الحيوانية ضرورية لدراسة الأمراض التي تصيب البشر والتسبب لاختبار علاجات جديدة. نتيجة لتشابهه التشريحية والقرب التطوري، أصبح الماوس النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع من الأمراض التي تصيب البشر 45. ومع ذلك، هناك بعض القيود مع هذا الحيوان، امبعجز جي لتصور تطوير الجهاز في الجسم الحي والتطبيق العملي استكمال شاشات جينية واسعة النطاق. الزرد هي نموذج كائن ذات صلة ومفيدة لدراسة تطوير الجهاز والنمذجة من الأمراض التي تصيب البشر 45،46. في ما يخص الأمراض التي تصيب البشر، homologs الوظيفية في الزرد وجود ما يقرب من 70٪ من جميع الجينات البشرية 54،55. وقد أبرزت الأعمال الأخيرة فائدة الزرد لكثير من مجالات البحث 31،37،56 الكلى. وتشير الدراسات إلى التجديد والإصلاح في الزرد بعد AKI أن تجديد أنبوب صغير الظهارية وneonephrogenesis نوعان من العمليات التي تحدث وتتداخل في جميع أنحاء تجديد timecourse 30،37. وقد استخدمت استخدام المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد دعا جنتاميسين باعتبارها النموذج إصابة من خلالها لدراسة نتائج AKI في 29،30،37 الزرد الكبار. على مدى ما يقرب من أسبوعين من اصابة في الفترة التالية جنتاميسين، وtubul الدانيتجديد وفاق، وفي الوقت نفسه النيفرون جديدة تشكل في جميع أنحاء الجهاز 29،30،37. بشكل عام، فإن الآليات التي تنظم تجديد الظهارية لا تزال مثيرة للجدل. في واحدة آلية المقترحة من عملية الإصلاح، هناك حالة الإصابة الحادة الأولي تليها النزع من الخلايا الميتة في التجويف. بعد ذلك، هناك سلسلة من دي التمايز، والانتشار، وأحداث الهجرة، وبعد ذلك تفرق خلايا جديدة، إعادة إسكانها الغشاء القاعدي الجرحى واستعادة وظيفة إلى الموقع المصاب. بدلا من ذلك، واشارت دراسات أخرى أن الخلايا تنشأ من استبدال الخلايا الجذعية / السلف الموجودة داخل الأنابيب كليون. وفيما يتعلق بعملية neonephrogenesis في الزرد، وقد لوحظت المجاميع الخلوية التالي AKI بواسطة حقن جنتاميسين 29،30. هذه المجاميع تنضج لاحقا إلى النيفرون الجديدة التي راسيا في الأنابيب القائمة بالفعل 29،30. القاسم المشترك الذي يوحد كليون الظهارية تجديد وneonephrogenesis هو عامل الغموض الهائل من: في الوقت الحاضر هناك أضعافا مضاعفة المزيد من الأسئلة حول كيفية حدوث هذه المفاخر التجدد من هناك رؤى المتاحة. حتى الآن، ومع ذلك، العديد من خطوط مثيرة للأدلة تدعم فكرة أن الأبحاث تجديد الكلوي باستخدام الزرد يمكن أن توفر في الواقع رؤى المقارنة ذات الصلة في AKI الإنسان التي قد يكون لها أيضا متعدية المباشر المحتمل 56-58. الفحص الكيميائي لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تزيد من انتشار الخلايا الكلوية السلف في الجنين الزرد أدى مؤخرا إلى تحديد deacetylase هيستون المانع ميثيل 4- (phenylthio) -butanoate (m4PTB) 56،57. كشفت إدارة هذا المجمع ليرقات الزرد مع الناجم عن جنتاميسين AKI أن بقاء اليرقات وزادت وتعززت أن انتشار أنبوبي كلوي 56،58. عندما عولجت فئران مع المعتدل الناجم عن نقص التروية AKI مع m4PTB، وتسارع الانتعاش في مساعدينتقم مع انخفاض في كل من ضمور أنبوبي ودورة الخلية القبض على الخلايا المتكاثرة أنبوبي كلوي 58. وتشير هذه النتائج إلى أن مسارات طبيعية المسؤولة عن تطوير الكلى الزرد و / أو استجابة التجدد إلى AKI سيتم حفظها مع الثدييات 56. وهكذا، في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لندف بصرف النظر آليات تجديد وهما لتحديد مسارات الإشارات التي تشارك ويوفر لهم فهم التفاعلات الزرد واحد سيلة واعدة لتحقيق هذا الهدف المهم في مجال أمراض الكلى. أدوات مثل التسميات خلية كليون الموصوفة في هذا البروتوكول تمثل مجموعة من المقايسات التي يمكن استخدامها لتقييم تكوين الكلوي وظائف في نماذج AKI. علاوة على ذلك، يمكن تطبيقها لوصف النماذج المعدلة وراثيا من مرض في الكلى ويمكن أن توفر طرق لتحديد العلاجات الكيميائية قادرة على تعزيز استعادة هيكل كليون بعد سد الكلويالعمر.

الكلى هو الجهاز المعقد الذي يحقق العديد من الوظائف الفسيولوجية في الجسم. أهم وظيفة الكلى هي إفراز النفايات الأيضية، وتتشابك هذه المهمة بشكل وثيق مع الحفاظ على توازن السوائل. الكلى يؤدي هذه الوظائف من خلال تصفية الدم وتشكيل البول، في حين تنظم بالتزامن ضغط الدم، ومستويات المنحل بالكهرباء، والتوازن الحمضي القاعدي. الأنابيب الظهارية درجة عالية من التخصص ودعا النيفرون بمثابة وحدة وظيفية أساسية في الكلى 1،2. في الفقاريات الكبار، ويتم تنظيم النيفرون عادة في ترتيب ملفوف بإحكام المحيطة بها نظام الصرف الصحي المركزي، مما يسمح لكثير من الأنابيب لحزمة إلى الجهاز صغير إلى حد ما. على سبيل المثال، يمكن أن تحتوي كل كلية البشري أكثر من 1 مليون النيفرون 3. الثدييات الأخرى مثل الماوس تمتلك بناء على أمر من 8-10000 النيفرون في الكلى 4. درجة التعقيد الكلوي تختلف بين هذه الثدييات وغيرها من نبات أخضرebrates بسبب الاختلافات في إجمالي عدد كليون والتصميم المعماري في غضون الكلى. أنواع الفقاريات تشكل ما يصل الى ثلاثة هياكل الكلى المتعاقبة خلال التنمية، ويعرض كل شكل زيادة التعقيد فيما يتعلق الوقف كليون وترتيب: للسليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية. هيكل الكلوي الماضي ليتم الاحتفاظ بمثابة الكلى الكبار الجهاز، عادة mesonephros أو الكلوة التالية 2. كل شكل الكلى، ولكن لديه تكوين القائم على كليون 2. النيفرون هو العمود الفقري في الكلى وهو المسؤول عن ترشيح الدم جنبا إلى جنب مع إفراز الأيض واستيعابهم. النيفرون هي هياكل أنبوبية بسيطة تتألف من الخلايا الظهارية ولها تنظيم المجزأ، التي المنفصلة، ​​مجالات متخصصة للغاية من ظهائر متباينة أداء مهام محددة. في ترتيب تدفق الترشيح من خلال كليون، هناك عادة ثلاثة أجزاء رئيسية comprisالبريد لكل وحدة: (1) كرية الكلى، (2) مع أنبوب صغير القريبة والمتوسطة والبعيدة قطاعات، و (3) جمع القناة 1. نبيب الداني هو المسؤول عن استيعاب من المواد المذابة العضوية، وأهمها الجلوكوز والأحماض الأمينية 1. نبيب المتوسطة (أو حلقة من هنلي) هو موقع كبير من الملح والماء التنظيم 1. أخيرا، صقل من الملح والأيونات الأخرى يحدث في نبيب القاصي وجمع القناة ويتم تنظيم كبير من قبل نظام الغدد الصماء 1. من هناك، ويسافر الراشح من خلال الحالب والمثانة، والخروج في نهاية المطاف الجسم كمنتج النفايات 1. فقدان وظائف الكلى يمكن أن تنبع من العديد من الأسباب التي تمنع النشاط كليون العادي. يمكن أن تحدث هذه الأسباب أثناء التطور الكلى، مثل العيوب الخلقية التي تؤدي إلى تشوه من النيفرون 5، أو لأسباب من أنواع مختلفة من الإصابة (النابعة من كلا الوراثية وenvironmeأصول ntal). تصنف على نطاق واسع الإصابات المكتسبة وإصابة حادة في الكلى وكالة (آكي) أو إصابة الكلى المزمن (CKD). AKI ينطوي على خسارة مفاجئة من وظيفة الكلى، غالبا ما ينتج عن نقص التروية أو السم التعرض 6،7. في الثدييات، وإصلاح الظهارية كليون ممكن بعد مثل هذه الإصابات 8، وكثير من الناس تظهر الاستعادة الكاملة من وظيفة الكلى بعد AKI. ومع ذلك، يرتبط AKI أيضا مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات التي تم الإبلاغ عنها عبر واسع 30 - 70٪ النطاق الإصابة 6،7. CKD، في المقابل، ويرتبط مع الفقدان التدريجي لوظائف الكلى الناتج عن سنوات من الضرر لفترات طويلة، التي ترتبط عادة مع التليف 8،9. وعلاوة على ذلك، يوجد تفاعل بين AKI وCKD، وإما يمكن لأحد أن يهيئ الفرد للآخرين 10-12. على سبيل المثال، أولئك الذين عانوا من AKI هم أكثر عرضة للCKD وحتى الموت 13. الإصابة بأمراض الكلى، سواء في الولايات المتحدة وجميع أنحاء العالم، وقد بلغ epideومن المتوقع النسب وهيئة التصنيع العسكري في الارتفاع مع توسع-بالتالي السكان الذين تتراوح أعمارهم بين أن هناك حاجة متزايدة لتحديد التدخلات الطب التجديدي ل14،15 الكلى. على الرغم من معرفة أن المرضى AKI يمكن استرداد، منذ فترة طويلة يعتقد أن الكلى هو الجهاز دون صلاحيات التجدد الفطرية. تم عرض هذه النظرة التقليدية المعدلة بشكل كبير في السنوات الأخيرة 16. وقد أظهرت دراسات التحقيق الضرر الكلوي في الفئران والجرذان بعد AKI أن الخلايا الظهارية كليون أنبوب صغير يمكن أن تتكاثر وإعادة بناء النيفرون الوظيفية 17-20. على الرغم من أن الثدييات تمتلك هذه القدرة على التكيف لتجديد النيفرون، وهناك قيود ملحوظة والاستجابات غير القادرة على التأقلم يمكن أن تسبب التي تؤدي إلى التليف الكلوي وCKD 21. على سبيل المثال، أظهرت دراسة حديثة أن تكرار الاجتثاث الخلايا الظهارية في النيفرون الفئران ارتبط تجديد تقلص والنيفرون، مما يشير إلى تليف الكلى هفعصام محدودة تجديد عتبة 22. ليس هناك أدلة على أن البالغين الكلى الثدييات يشكل النيفرون جديدة لتحل محل تلك المفقودة أو التالفة، وبالتالي تدميرها يؤدي إلى عجز دائم 8،9 كليون. ومن المثير للاهتمام، وبعض الفقاريات لا تستجيب لAKI بواسطة ظهائر تجديد كليون وأيضا إنتاج النيفرون الجديدة، المشار إليها باسم عملية neonephrogenesis أو كليون neogenesis 23. Neonephrogenesis يحدث في الأسماك بعد التعرض للسموم أو بتر جزئي، وشملت نماذج إصابة تاريخيا ذهبية 24،25، البلطي 26، 27 تزلج، الميداكا 28، ومؤخرا، الزرد 29،30. من هذه، الزرد تقدم نموذجا قابلا للتطبيق الأبحاث الجينية لاكتشاف مسارات الخلوية والجزيئية المسؤولة عن تجديد الكلوي. في هذه المقالة الفيديو، ونحن لشرح كيفية تسمية قطاعات كليون في الزرد الكبار. علم التشريح كليون، وميزات الجزيئية،والخصائص الفنية ضرورية للدراسات المستقبلية الكلى ناجحة باستخدام الزرد. الكلى الزرد الكبار هو بنية mesonephros وبطبيعتها هي أقل تعقيدا من حيث عدد كليون وتنظيم من هيكل الكلوة التالية وجدت في الثدييات الكبار، avians، والزواحف 31. ومع ذلك، الزرد تنظيم قطاع كليون يماثل إلى الثدييات، وثقت لأول مرة في الكلى الجنينية استنادا إلى دراسات التعبير الجيني 31-35. النيفرون الجنين الزرد تحتوي على شرائح خطية نبيب التي تشمل نبيب الملتوية القريبة (PCT)، النبيبات الدانية على التوالي (PST)، البعيدة في وقت مبكر (DE)، والقاصي الراحل (DL) 31-35 (الشكل 1). النيفرون الزرد الكبار تمتلك قطاعات أنبوبي مماثلة 30،31،36،37 (الشكل 1). كما يمكن التعرف على معاهدة التعاون بشأن البراءات من قبل النمط الظاهري وظيفية: سوف الخلايا الظهارية في المعاهدة تتضمن مركبات ديكستران fluorescently المسمى (10-70 كيلو دالتون في حجم) موجودة فيالتداول، التي استخدمت في كل من الجنينية والكبار الكلى الزرد لتقييم امتصاص التقامي بواسطة هذه الخلايا نبيب الداني 38-41 (الشكل 1). فارق واحد في قطاعات كليون بين الزرد والثدييات هو أن الزرد تفتقر إلى أنبوب صغير وسيطة، أو حلقة من هنلي 30-37. لأن هذا جزء ظائف في الثدييات للحفاظ على المياه، والزرد هي أنواع المياه العذبة دون حاجة ملحة للتركيز البول، فإنه ليس من المستغرب أن الزرد تفتقر هذه الشريحة 32،33. وهكذا، فإن الحفاظ تكوين كليون العام إلى حد كبير بين الزرد والكلى الثدييات 32،33. وقد مكنت هذه التشابهات الزرد أن يكون أداة بحث فعالة للتحقيق وظائف الجينات وأعرب الكلوي خلال التنموية 32-35،42 تكون الكلية ونموذج العديد من أمراض الكلى 43،44، مما يضيف إلى قائمة كبيرة من الشروط البشرية التي يمكن أن تكون التحقيق باستخدامالزرد 45،46. اليوم، الكلى الزرد الكبار هو نموذج جذاب للدراسات المقارنة للتجديد الكلوي بسبب قابلية الإستطراق لها الجيني والحنك توسيع الموارد التكنولوجية المتاحة لاستجواب وظيفة الجين ومسارات الإشارات في هذا النوع. وقد استخدمت العديد من الدراسات وmesonephros الزرد للتحقيق في آليات تجديد بعد AKI 29،30،37. لمواصلة البحث AKI باستخدام الكلى الزرد الكبار، فمن الضروري أن يكون طرق رائعة لتسمية المناطق كليون مختلفة وأساليب لدراسة وظائف كليون. وقد تم تكييف عدة طرق للتحليل الكلى البالغين من بروتوكولات الكلى الجنينية. حقن داخل الصفاق من ديكستران fluorescently المسمى في الزرد الكبار تسميات ظهارة معاهدة التعاون بشأن البراءات في mesonephros النيفرون عبر الإلتقام 30، كما في الأجنة الزرد 38-41 (الشكل 1). وقد استخدم هذا الأسلوب لvisualizه عندما الأنابيب القريبة استعادة الممتلكات إمتصاص ثانية في أعقاب AKI، والتي تمكن من تقييم واحد استعادة وظيفة فسيولوجية 30 (الشكل 1). ميزة أخرى من كليون نبيب الداني هي أن الخلايا الظهارية في هذا القطاع تمتلك الحدود فرشاة 37 التي تظهر مستويات عالية من النشاط الذاتية الفوسفاتيز القلوية. وهكذا، فإن ظهارة القريبة يمكن أن تكون مترجمة بصريا في الكلى الكبار الزرد باستخدام تقنية القائم على مضان المعروفة باسم ELF- (انزيم المسمى الإسفار) 47 -97. هنا، نحن تصف كيفية تنفيذ المقايسات امتصاص الفلورسنت ديكستران 30،48 في الكلى الكبار الزرد، وذلك للحصول على التقييم الوظيفي للنبيب الداني ورسم خريطة للحجم وملامح هذه الشريحة أنبوب صغير. المقبل، ونحن تصف التقنيات لتسمية المناطق نبيب القريبة من كليون الكبار مع الفلورسنت الفوسفاتيز القلوية التسمية. الثالث، وتبين لنا لأول مرة أن rhodأمين الموسومة كتين Dolichos biflorus راصة (DBA)، والتي تم استخدامها كعلامة العامة للمجاري جمع في الكلى الثدييات 49، يصادف الأنابيب البعيدة للبالغين الكلى الزرد. كما DBA تبادلية لالفوسفاتيز القلوية تلطيخ، هذه التسميات توفر وسيلة للتمييز على نطاق واسع لعموم الداني مقابل تمتد لعموم البعيدة للكليون الكبار الزرد. من خلال تنفيذ هذه البقع الفلورية في كل من جبل بأكمله والمقاطع النسيجية ناظم البرد، فإننا ربط هذه التسميات مع مجالات التعبير عن الجينات نقل المذاب التي تنفرد بتحديد كل قطعة كليون. لذا يحتوي هذا البروتوكول أيضا دليل لإجراءات معالجة الأنسجة تعديل لأنسجة البالغين جبل بأكمله في الموقع التهجين (WISH) في التحليل القائم على موقعنا على الجنين بروتوكول WISH 50. يمكن استخدام هذه الإجراءات في توليفات مختلفة (الشكل 2) لتوثيق الصفات المورفولوجية والوظيفية سو الكبار النيفرون الكلى الزرد. وبالتالي، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها على الدراسات تجديد، وتوصيف المظهري من غيرها من النماذج مرض الكلى، وحتى تستخدم لدراسة تشكيل الكلى الكبار.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

وقد برز نموذج الزرد كنظام ذات الصلة لدراسة تطوير الكلى، وتجديد والمرض. كلا تتكون الكلى الزرد الجنينية والكبار من الوحدات الوظيفية المعروفة باسم النيفرون، والتي يتم حفظها للغاية مع الفقاريات الأخرى، بما في ذلك الثدييات. وقد أظهرت الأبحاث في الزرد مؤخرا أن اثنين من الظواهر المميزة ارشح بعد النيفرون الكبار تكبد الضرر: أولا، هناك تجديد قوي داخل النيفرون القائمة التي تحل محل الخلايا الظهارية أنبوب صغير تدميرها؛ الثانية، يتم إنتاج النيفرون جديدة كليا من الأسلاف الكلى في عملية تعرف باسم neonephrogenesis. في المقابل، البشر والثدييات الأخرى يبدو أن لديها سوى قدرة محدودة لكليون الظهارية التجدد. حتى الآن، الآليات المسؤولة عن هذه الظواهر تجديد الكلى لا تزال ضعيفة مفهومة. منذ الكلى الزرد الكبار على حد سواء الخضوع كليون الظهارية تجديد وneonephrogenesis، أنها توفر الفقرة التجريبية المتميزةdigm لدراسة هذه الأحداث. وعلاوة على ذلك، هناك مجموعة واسعة من الأدوات الوراثية والدوائية المتوفرة في نموذج الزرد التي يمكن استخدامها لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم تجديد الكلوي. واحد جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول مجموعة من تقنيات وضع العلامات التي يمكن استخدامها لقياس وظائف الكلى تكوين اختبار نفرون في الكلى الزرد الكبار. وهكذا، وهذه الأساليب قابلة للتطبيق على نطاق واسع على توصيف المظهري المستقبل الزرد نماذج الكبار إصابة الكلى، والتي تشمل ولكن لا تقتصر على الأنظمة التعرض nephrotoxicant أو الأساليب الوراثية لموت الخلايا المستهدفة مثل nitroreductase بوساطة تقنية الاجتثاث الخلية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الأساليب لدراسة الاضطرابات الوراثية في تشكيل الكلى الكبار ويمكن أن تطبق أيضا على تقييم الوضع الكلوي خلال النمذجة المرض المزمن.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

الكلى الكبار الزرد هو نظام ممتاز للتجديد وأمراض الكلى الدراسات. جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول عدة المنهجيات التي يمكن تنفيذها لتقييم تكوين كليون أنبوب صغير وتقييم استيعاب الكلوي.

تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.7K Views.  University of Notre Dame.  الكلى الكبار الزرد هو نظام ممتاز للتجديد وأمراض الكلى الدراسات. جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول عدة المنهجيات التي يمكن تنفيذها لتقييم تكوين كليون أنبوب صغير وتقييم استيعاب الكلوي. 

Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

تشريح هيئات من اسماك الزرد الكبار

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

حقن داخل الصفاق الى اسماك الزرد الكبار

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

تشريح الكلى اسماك الزرد الكبار

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

في Electroporation المجراة من Morpholinos في الكبار التجديد زعنفة الذيل الزرد

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

جمع الدم لتحليل الكيمياء الحيوية في الزرد الكبار

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging اسماك الزرد الكبار

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

تقييم الزرد وظائف الكلى باستخدام التخليص الفحص الفلورسنت

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...