Name: microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

نعترف أعضاء المختبر Mably وStorer Narie للحصول على المساعدة التقنية ، وجمعية القلب الأمريكية (NCRP ساينتست التنمية 0635363N غرانت) والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد (المنحة SCCOR RFA HL02 - 027) للحصول على التمويل

الجزء 1 : إنتاج البيض ، وجمع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليلة قبل الحقن ، التي أنشئت في تربية الأسماك مع فواصل الدبابات في المكان. لزيادة إجمالي إنتاج البيض ، ويمكن تعيين ما يصل السمك في نسبة اثنين إلى واحد من الذكور الإناث إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي ، وبعد تشغيل أضواء الغرفة ، سحب فواصل من عدة دبابات والسماح لحوالي 20 دقيقة من وقت التزاوج دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مصفاة ، وجمع البيض من أقفاص التربية وشطف لهم المياه البيض. صب البيض في صحن بيتري البيض مع الماء وإزالة الأنقاض وبويضة غير مخصبة مع ماصة نقل. ويمكن تجميع الأسماك في خزانات أكبر لانتاج قذائف إضافية من البيض للحقن. ضبط توقيت جمع البيض للسماح للأرقام الحد الأقصى من البيض إلى أن يتم إنتاجها من دون السماح لهم بالمرور المرحلة خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان شريحة المجهر في غطاء المقلوب طبق بيتري 100mm. استخدام ماصة نقل إلى خط يصل البيض ضد الجانب من الشريحة التي تشكل عمود واحد. إزالة المياه الزائدة من البيض الشريحة بالضغط على Kimwipe ضد الجانب الآخر البيض. (الشكل 1A) </li></ol> الجزء 2 : سحب إبرة ، التحميل ، وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مجتذب micropipette ، سحب الزجاج OD 1.0mm الشعرية إلى قسمين الإبر وتخزينها في طبق بتري 150mm عن طريق وضع المعجون على سلالم سخيفة. يمكن سحب الإبر مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Backload الإبرة مع 3 ميكرولتر من مواد الحقن باستخدام ماصة microloader. يهز بلعة نحو غيض الإبرة حتى هناك فقاعات قليلة أو معدومة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مصدر الهواء وmicroinjector. ادخال الإبرة في microinjector وضمان ختم ضيقة داخل السكن. تأكد من أن micromanipulator في موقف مناسب للسماح لمجموعة واسعة من الحركة والتكيف. جلب رأس الإبرة في الطائرة من عرض من المجهر ، وارتفاع قبالة المرحلة ، والتركيز على أنحف منطقة الحافة. استخدام زوج من الملقط حادة لقرصة قبالة الإبرة في النقطة التي يترك إبرة ضيقة بما يكفي لاختراق المشيماء وصفار البيض ولكن لا تزال قادرة على إيصال حجم حبة متسقة. ويمكن استخدام قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر لحساب حجم كل حقنة. عندما يحقن في النفط ، مع حبة قطره 0.1 ملم تحتوي على 500 من المواد PL الحقن (1B الشكل) ، وتستخدم عادة حقن كميات من 500 أو PL 1nL. كساد على دواسة القدم ورصد حجم حبة في حين خفضت الإبرة وضبط ضغط الحقن حسب الحاجة. وحقن كميات مثالية ملء ما يقرب من 10 ٪ من حجم البيضة. نوعية رأس إبرة أمر حاسم لتخفيف كل من الحقن والجودة والاتساق في النتائج. </li></ol> الجزء 3 : حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان أجنة لم تتطور في المرحلة الماضية أربعة الخلية. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون الأجنة في مرحلة واحدة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض الإبرة في اتجاه العمود من البيض ، وعقد الطبق في مكان مع يدك المعاكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخترق سطح المشيماء وأدخل صفار بضربة واحدة على نحو سلس في حين يراقب عن أي تكسير أو تمزق في كيس المح. حقن مواد الحقن في صفار (الشكل 1C). تجنب فقاعات الهواء عن طريق الحقن أو تمتد صفار إما أن تكون قاتلة للجنين. تعمل باستمرار على الخط ، وضبط الضغط حسب الحاجة للحفاظ على حجم حبة ومتسقة ، وذلك باستخدام ماصة الحافة ، إزالة البيض التي تبدو غير مخصبة أو دمرت خلال عملية الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من عمود من البيض ، واستخدام تيار من الماء البيض لطيف لنقل البيض حقنها طبق بيتري نظيفة. كرر حسب الضرورة. تبقي عدة أجنة uninjected كمجموعة تحكم. في نهاية يوم واحد ، وإزالة أجنة ميتة وسجل عدد من الأجنة المحقونة. استبدال الماء في طبق البيض دوريا لتقليل فرصة الإصابة. </li></ol> الجزء 4 : نتائج الممثل اعتمادا على ما يجري حقن ، قد الأجنة البقاء بسعر أقل من إخوانهم uninjected. لحسن الحظ ، فإنه من السهل على ضخ كميات هائلة منه ، لذلك هذا نادرا ما يمثل مشكلة. فمن الطبيعي أن تظهر لmorphants التنمية تأخر قليلا. لتوضيح نتائج microinjection ، استخدمنا هذا البروتوكول لمعالجة مستويات البروتين القلب من الزجاج (حج). حج هو بروتين عبر الغشاء اللازمة للتنمية القلب العادي. في غيابها ، مع قلوب الأجنة تطوير مساحات تدفق العملاقة والغرف 1. حقن نحن اثنان morpholinos لم يسبق وصفه ضد حج ، وheg_e3i3_egfr1 heg_e4i4_egfr2 ، عند تركيز 500 ميكرومتر. في آخر أيام 2 الإخصاب ، والضوابط الأخوة uninjected تبدو طبيعية ، كما هو متوقع (2A الرقم وباء). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 وذمة الدماغ (الشكل 2C). على الرغم من أن قلوب معظم هذه morphants غيرت التشكل ، والغرف الخاصة بهم الحجم عادة (الشكل 2D). حقن الأجنةبعيوب المعرض heg_e4i4_egfr2 القلب متغير. بعض تبدو طبيعية ، في حين أن البعض الآخر تدفق مساحات كبيرة ومتوسطة الأذينين الموسع (2E الرقم وF). ومتحولة حج ، كما ذكرت سابقا 1 ، لديها الجهاز بشكل كبير وتوسيع تدفق الأذين (الشكل 2G و H). نحن أيضا حقن الأجنة wildtype مرنا مع 400 نانوغرام / ميكرولتر مستنسخة من كامل طول حج [كدنا]. بينما تسيطر uninjected تتطور بشكل طبيعي (الشكل 3A وباء) والأجنة حقنوا حج مرنا المعرض تشكيلة واسعة من الظواهر تتراوح ما بين ظهور wildtype لتصقلب شديد ، وتقصير من محور الجسم الرئيسي ، تنخر في الرأس والجسم ، وعيوب خط الوسط (الشكل 3C ودال). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="" /> تصطف الشكل 1. الأجنة ليتم حقنه ضد شريحة المجهر في طبق بيتري (A). ويتحدد حجم الحقن عن طريق حقن في الزيوت المعدنية وضعت على ميكرون. وحدة تخزين حقن 500 رر ، التي يشيع استخدامها ، التي يبلغ قطرها 0.1 ملم (B). فورا بعد الحقن ، وmorpholino مرنا أو مرئيا كبقعة تلم في صفار (C). <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="" /> الشكل 2. وفي آخر أيام 2 الإخصاب والأجنة uninjected ليس لديهم عيوب جسيمة (A) أو النمط الظاهري القلب (B). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 morpholino وذمة الدماغ (C ، السهم) ولكن عادة حجرات القلب الحجم (D). بعض الأجنة حقنوا heg_e4i4_egfr2 morpholino ومساحات تدفق الموسع والأذينين (E ، F). حج والمسوخ مساحات تدفق الموسع بشدة والأذينين (G ، H). (أ) و (C) ، (E) ، و (G) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) ، (D) ، (F) و (ه) هي الصور 20X مدينة دبي للإنترنت. ردهة = ، فإنه = تدفق المسالك. <img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="" /> الشكل 3. وفي 24 التسميد آخر ساعة ، uninjected اجنة لديها طويل ، مستقيم الجسم مع عدم وجود عيوب أو نخر خط الوسط (أ) و عينان محددة بوضوح مع الأنبوب العصبي بينهما (B). بعض الأجنة حقنوا مرنا حج ، في المقابل ، يحمل محور الجسم تقصير ، نخر ، somites شوه (C) ، وتصقلب (D). (أ) و (ج) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) و (D) والصور 20X مدينة دبي للإنترنت.

<ol>
	<li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish.">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li></ol>

واحدة من نقاط القوة في النظام النموذجي الزرد هو السهولة التي يمكن أن تضاف إلى المنتجات جين معين أو التخلص من الجنين قبل microinjection. لoverexpress بتواجد مطلق بروتين خاص ، ترميز مرنا يحقن في صفار في المرحلة 1 - الخلية. خلال نمو الجنين في وقت لاحق ، يتم توزيع الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء الحي وترجمتها. على العكس ، من أجل القضاء على بروتين خاص ، تستخدم morpholinos. Morpholinos هي [أليغنوكليوتيد] الاصطناعية المصممة التكامل مع العقاقير لالرناوات محددة. مثل mRNAs ، يتم حقن morpholinos في صفار في المرحلة 1 - الخلية. داخل الجنين أنها تربط الرناوات هدفهم ، ومنع الترجمة. التعديل الرئيسي الذي يحتاج الى بذل كل morpholino مرنا أو هو تركيز المادة المحقونة. قد عالية للغاية من تركيز إما morpholino مرنا أو غير محددة تسبب التسمم ، في حين يجب أن يتم اختبار كل morpholino تجريبيا لتحديد تركيز على النحو الأمثل ، وعادة تركيزات morpholino بين 200 ميكرومتر و500 ميكرومتر نهدم نشاط الجينات على نحو فعال دون أن تسبب تشوهات غير محددة. الحجم الدقيق لفتح إبرة ليست حاسمة. ويمكن ضمن مجموعة من الأحجام الإبرة ، وضغط الحقن والحقن يمكن ضبط الوقت لانتاج بلعة من حجم الصحيح. Morpholinos لها تطبيقات عديدة ، بما في ذلك تشريح وظيفي من المجالات داخل البروتين. عندما صمم لهدف محدد ، اكسون إنترون التقاطعات ، وسوف morpholinos منع الربط من حدوث هناك. درسنا آثار اثنين من morpholinos التي تربط بين اكسون - إنترون تقاطعات مرنا في حج من قبل. وheg_e3i3_egfr1 morpholino يربط بين مفترق اكسون 3 و 3 إنترون ، ومنع من الربط آلات دمج اكسون 3 في النصوص الناضجة. وبالمثل heg_e4i4_egfr2 morpholino يزيل اكسون 4. كلا exons متماثلة 3 و 4 التي تحتوي على ترميز EGF المجالات مثل تكرار. بعض الأجنة حقنوا نسخة مظهرية معتدلة heg_e4i4_egfr2 ومتحولة ، وسوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من التجارب على فهم دور حج اكسون 4 في التنمية القلب. من المدهش ، مع حقن الأجنة heg_e3i3_egfr1 وذمة الدماغ ، وهي ميزة لا ينظر في حج المسوخ. هذا قد يكون راجعا إلى قدرة morpholinos ربط النصوص الأم التي لن تتأثر في لاقحي المسوخ.

<table><tbody><tr><td>Microinjector</td><td>Tool</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Tool</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>Needle Puller</td><td>Tool</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Pipettes</td><td>Tool</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>Tool</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function

واحدة من مزايا دراسة الزرد هو سهولة وسرعة معالجة مستويات البروتين في الجنين. يمكن إضافة Morpholinos ، والتي هي [أليغنوكليوتيد] الاصطناعية مع التكامل العقاقير لالرناوات المستهدفة ، إلى جنين للحد من التعبير عن الجينات منتج معين. على العكس ، يمكن إضافة إلى معالجة مرنا الجنين لزيادة مستويات منتج الجين. السيارة إما لإضافة أو مرنا morpholino إلى الجنين microinjection. Microinjection غير فعالة وسريعة ، مما يسمح للحقن مئات من الأجنة في الساعة. هذا الفيديو يبين كل الخطوات التي تنطوي عليها microinjection. باختصار ، يتم جمع البيض على الفور بعد أن وضعت واصطف ضد شريحة المجهر في طبق بتري. المقبل ، ويرتبط إبرة رفيعة ذات الرؤوس محملة مواد الحقن لmicroinjector ومصدر الهواء ، ويتم ضبط الضوابط microinjector لإنتاج وحدة حقن مرغوب فيه. وأخيرا ، انخفضت الإبرة في صفار الجنين ويطرد morpholino أو مرنا.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function at JoVE.com

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

هذا الفيديو يبين كيف يمكن حقنها أو morpholino مرنا في الأجنة الزرد في مرحلة واحدة الخلية إلى نقصان أو زيادة مستوى المنتجات جين معين خلال التطور اللاحق.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Research

JoVE Journal

Biology

77.4K Views.  Harvard Medical School. هذا الفيديو يبين كيف يمكن حقنها أو morpholino مرنا في الأجنة الزرد في مرحلة واحدة الخلية إلى نقصان أو زيادة مستوى المنتجات جين معين خلال التطور اللاحق.

Video: Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Neuroscience

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Developmental Biology

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

<meta charset="utf8"></head><body>تصميم وحقن دقيق لقليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المورفولينو و mRNA في أجنة أسماك الزرد لتوضيح وظيفة جينية محددة في نمو القلب

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

تصميم وحقن دقيق لقليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المورفولينو و mRNA في أجنة أسماك الزرد لتوضيح وظيفة جينية محددة في نمو القلب

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

بروتوكول فعال لتقييم تعديل نشاط ERK في نماذج متلازمة نونان المبكرة لأسماك الزرد عبر الفحص المجهري الحي FRET والتألق المناعي

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Biochemistry

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

ارتفاع القرار جبل بأكمله<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين داخل الأجنة الزرد لدراسة التعبير الجيني وظيفة

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التوسيم وخلايا الدماغ المؤخر التصوير في اسماك الزرد

Microbead زرع الأجنة الزرد

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

المجهرية من التعبير الجيني في الدماغ اسماك الزرد الكبار عن طريق حقن مكروي Cerebroventricular [أليغنوكليوتيد] Morpholino

تصميم وحقن دقيق لقليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المورفولينو و mRNA في أجنة أسماك الزرد لتوضيح وظيفة جينية محددة في نمو القلب

تصميم وحقن دقيق لقليل النوكليوتيدات المضادة للمعنى المورفولينو و mRNA في أجنة أسماك الزرد لتوضيح وظيفة جينية محددة في نمو القلب

يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

بروتوكول فعال لتقييم تعديل نشاط ERK في نماذج متلازمة نونان المبكرة لأسماك الزرد عبر الفحص المجهري الحي FRET والتألق المناعي

ارتفاع القرار جبل بأكمله