We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.

تتفق كل من بروتوكولات للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان (CCAC) وكانت نفذت بموافقة من جامعة أوتاوا جنة رعاية الحيوان (بروتوكول BL-226). 1. الوقت التفاضلية تلطيخ التقنية: الخيطية Mitochondrion الغنية صبغ باث <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 ملم MitoTracker الأحمر حل الأسهم عن طريق إذابة 50 ميكروغرام في 94.0 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل (100٪ DMSO). حافظ على حل الأسهم في الظلام في -20 ° C عندما لا تكون قيد الاستعمال. تجنب دورات تجميد / الذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد صناديق مظلمة (3 - 6 مربعات) بحجم أقصى 600 مل. ملء الصناديق مع 400 مل من الماء نظام (الماء تقام عادة في الأسماك) ووضع حجر الهواء في كل مربع لتوفير مصدر من O 2. الحصول على ذهبية (30 - 40 جم) ووضعها في صناديق مع 400 مل من الماء والحجر الهواء. بعد 30 دقيقة، إضافة إلى الحبيبات الخيطية الغنية صبغ قابلة للحياة لانتاج تركيزات النهائي من 0.1 ميكرومتر و 0.01٪ DMSO. يستحم السمك لمدة 4 ساعاتص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت هذه هي الأسماك التحكم (أي، لا إزالة التعصيب)، بدوره على تدفق المياه الى صناديق، والسماح للصبغ لطرد واسترداد الأسماك للفترة من الوقت المخصص في البروتوكول. وعادة ما يتم انتشال الأسماك لمدة 3 - 5 ايام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة نقاهة الشروع في القسم 3: الوقت التفاضلية تلطيخ التقنية: المناعية. إذا كانت هذه الأسماك هي أن مزالة العصب المضي قدما إلى القسم 2: الكامل الثنائي الإجراءات إزالة التعصيب. </li></ol> 2. كامل الثنائي إزالة التعصيب الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على 1 زوج من مقص طالب Vannas الربيع (المنحني)، 1 زوج من نمط ملقط على التوالي القياسية، 1 زوج من نمط ملقط منحني القياسية، 2 أزواج من رقم 5 ملقط، 1 زوج من الكامشات الأنسجة، وكرات القطن الصغيرة (1 - 2 مم في القطر)، ومسحات القطن (Q نصائح أو ما يعادلها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير حمام الماء مخدر. لأول مرة، ويحل 10 غراما من بنزوكاين إلى الحجم النهائي من 100 ملمن 99٪ من الإيثانول لإعداد محلول المخزون. لإعداد حمام الماء مخدر، ويحل 15 مل من محلول المخزون بنزوكاين في 30 L من الماء نظام الهوائية في درجة الحرارة المطلوبة. تهوية المياه من خلال وضع حجر الهواء متصلة مضخة الهواء أو خط الهواء المركزي في خزان المياه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع السمك في حمام ماء مخدر (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة لم يعد التنفس، ضع السمك على طاولة الجراحة وتدخله كما هو موضح في الشكل 1B. القيام بذلك عن طريق إدخال أنبوب في تجويف لها الشدق لري الخياشيم مع الحل مخدر الهوائية. الري من الخياشيم يضمن أن يتم توفير السمك مع كمية كافية من O 2 والتخدير أثناء إجراء إزالة التعصيب. ضع السمك بحيث يتم إمالة الرأس إلى الأسفل قليلا. وهذا يسمح لتحسين فرص الوصول إلى المنطقة وراء الخيشومية قوس الرابع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بلطف الغطاء الخيشومي على التوالي ملقط نمط القياسيةووضع الكامشات الأنسجة بين الغطاء الخيشومي وداخل الرأس. فتح بعناية الكامشات الأنسجة للحفاظ على الغطاء الخيشومي بعيدا عن الرأس والحفاظ على الخياشيم عرضة للخطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الحل مخدر والري الخياشيم أثناء هذا الإجراء. ضع ضام يعالج المقبل في الرأس الذي يوفر الوصول إلى جميع الأقواس الخيشومية الأربعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ملقط نمط القياسية المنحنية بين القوس الخيشومية الرابع والجزء الخلفي من الرأس وبلطف فتح لهم لخلق التوتر في الرباط إرفاق الرابع القوس الخيشومية في الرأس. مع زوج من رقم 5 ملقط خلق فتحة صغيرة (2-3 ملم) من خلال ثقب ظهارة ربط نهاية الظهري من الأقواس الخيشومية إلى تجويف صادي. يجب الحرص على عدم ذهاب في عميق جدا لأن هناك خطر من إتلاف أحد الأوعية الدموية الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع كرة صغيرة من القطن عقده مع رقم 5 ملقط ببطء وبعناية توسيع شق لفضح التاسع (اللساني البلعومي) والعاشر (المبهم) الأعصاب. مجانا للالأعصاب من أي نوع من الأنسجة الضامة باستخدام رقم 5 ملقط، مع الأخذ مرة أخرى الحرص على عدم الإضرار الأوعية الدموية. ملاحظة: IX الخيشومي وX أعصاب ذهبية الراحة العميقة وراء الخيشومية قوس الرابع وهي في القرب من الأوعية الدموية الرئيسية التي تصب في الأقواس الخيشومية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم تحديد الأعصاب استخدام مقص الربيع منحنية لقطع بعناية الأعصاب في حين الضغط على شق مفتوح مع ملقط المنحنية شكل القياسية. بعد قطع الأعصاب، والتراجع بلطف ملقط منحنية. ليست هناك حاجة لإغلاق الجرح مع الغرز لأن ظهارة رقيقة جدا وشق يغلق عادة من تلقاء نفسها داخل 24 - 48 ساعة. إزالة ضام الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر نفس الإجراء على الجانب الآخر من الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل الري من الخياشيم من مخدر على المياه الغازية جديدة لاسترداد الأسماك من التخدير. مرة واحدة واستؤنفت الحركات وصادي نقل الأسماك في خزانات التجريبية لفترة نقاهة لمدة 24 ساعة على الأقل. </li><lط&gt; إجراء &quot;صورية&quot; الإجراء على مجموعة منفصلة من الأسماك. ينطوي على &quot;صورية&quot; إجراء ثقب ظهارة وراء الخيشومية قوس الرابع دون قطع الأعصاب. </li></ol> 3. الوقت التفاضلية تلطيخ التقنية: المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا، وإعداد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في الفوسفات 1X مخزنة المالحة (PBS (4)؛ ز PFA في 96 مل من PBS). PFA لا تذوب بسهولة في برنامج تلفزيوني في RT. حل الحرارة في حمام مائي بحل PFA. تنفيذ هذا في غطاء الدخان. مرة واحدة PFA في حل السماح لتبرد قبل الاستعمال. تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل الى 2 أسابيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل القتل الرحيم الأسماك واستخراج الأنسجة الخيشومية، ضع 3-4 مل من 4٪ PFA إلى قارورة التلألؤ ليصبح المجموع 8 قارورة التلألؤ (1 فيال في الخيشومية قوس). وبالإضافة إلى ذلك، واتخاذ صغيرة تزن قارب وملء مع برنامج تلفزيوني 1X. وسوف تستخدم هذه لغسل الأنسجة بعد أن تم رفعه إليها. إبقاء جميع الحلول على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد قابلة للحياة-الحبيبات الخيطية الغنية التعرض صبغالتجربة قد انتهت، الموت ببطء ذهبية عن طريق وضعه في حمام مائي مع جرعة زائدة من بنزوكاين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط حادة لرفع الغطاء الخيشومي على جانب واحد من الرأس ومقص منحني لقطع كل نهاية سلة الخيشومية الخيشومية. اختيار بعناية حتى الخياشيم من قبل rakers باستخدام ملقط حادة وانتشالهم من تجويف وصادي. يغسل فورا الخياشيم في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X لإزالة بنزوكاين الزائد والدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الخياشيم رفعه في قارورة منفصلة (قارورة لكل قوس الخيشومية) مملوءة 4٪ PFA وإصلاح O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التثبيت، وغسل PFA الزائد في 1X PBS ووضع الأنسجة في أنبوب رصاصة 2 مل مليئة 1.5 مل من 1٪ تريتون-X على شاكر لمدة 6 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. هذه الخطوة permeabilizes الأنسجة. إذا كان الخيشومية كله هو كبير جدا لوضع في أنبوب 2 مل ثم قطع الأنسجة إلى أقسام صغيرة بما يكفي لتناسب أنبوب مع الحرص على عدم تلف خيوط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التخفيفات الأجسام المضادة الأولية التي كتبها miشينغ 4 ميكرولتر من محلول المخزون من كل الأجسام المضادة الأولية (ما مجموعه 8 ميكرولتر) إلى 992 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. تأكد من أن NKA (تسميات خلايا NKA الغنية) و (العلامات الخلايا العصبية) 12 الزنك، وقد أثيرت الأجسام المضادة الأولية في نفس المضيف. وهذا أمر مهم إذا قرر الباحثون إلى تحديد أنواع فرعية محددة IC في نفس الوقت الذي سيكون لديهم لاستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية التي أثيرت في الأنواع المضيفة مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل تريتون-X وبدون غسل الأنسجة تضيف 1: 250 التخفيف (تمييع في برنامج تلفزيوني 1X) من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة NKA (α-5) للكشف عن خلايا NKA الغنية والأجسام المضادة الخلايا العصبية محدد الزرد (الزنك-12) للكشف عن الألياف العصبية (الأجسام المضادة الأولية)، واحتضان على شاكر لمدة 6 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الأجسام المضادة الأولية 3 مرات لمدة 3 دقائق لكل باستخدام برنامج تلفزيوني 1X. للقيام بذلك، وإزالة حل الأجسام المضادة الأولية من الأنبوب عن طريق شفط بها باستخدام ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجسام المضادة الثانوية في1: 200 التخفيف عن طريق خلط 5 ميكرولتر من الأسهم الضد الثانوية في 995 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X. تطبيق الضد الثانوية (اليكسا فلور 488)، واحتضان لمدة 6 ساعة عند RT أو O / N عند 4 درجات مئوية على شاكر. ملاحظة: MitoTracker الأحمر هو متحمس في ~ 594 نانومتر الطول الموجي وسوف يتألق الأحمر. والضد الثانوية التي هو متحمس في ~ 488 نانومتر الطول الموجي وتتفلور الأخضر يجب أن تستخدم لتسمية NKA والأجسام المضادة الأولية 12 الزنك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائد عن طريق غسل الأنسجة 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما (كما هو موضح في الخطوة 3.7). </li></ol> 4. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يغسل، تركيب الأنسجة على شريحة مقعرة لجبل بأكمله التصوير متحد البؤر الخلايا والألياف العصبية. لتركيب الأنسجة، ووضع لأول مرة في انخفاض (200 ميكرولتر) من برنامج تلفزيوني 1X على شريحة المجهر مسطحة. هذا يضمن أن الأنسجة لا يجفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل hemibranchs الخيشومية مع منحني مقص الدقيقة. ضع قطرة من برنامج تلفزيوني 1X وقطرة من وسائل الاعلام المتزايدة في شريحة مقعرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع hemibranchs فصل في الشريحة مقعرة مع الحافة الأمامية للخيوط التي تواجه صعودا، وتغطي مع انزلاق الغطاء. ربت على حواف الغطاء زلة مع طلاء الأظافر لمنع انزلاق الغطاء من التحرك وتشريد الأنسجة. السماح للأنسجة لتستقر في أسفل الشريحة المقعرة لمدة 10 - 15 دقيقة قبل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل قوس الخيشومية، حدد ستة خيوط الخيشومية عشوائيا للتصوير، وإنتاج ست صور في الخيشومية القوس. استخدام متحد البؤر المجهري التقليدي لصورة الأنسجة من خلال اتخاذ 1 - 3 ميكرون شرائح الضوئية. ملاحظة: أي خلايا موجودة مسبقا سوف يكون المسمى مع MitoTracker الأحمر وايجابية NKA سوف تظهر الصفراء فقط. الخلايا التي تبدو حمراء فقط هي المرحلية القائمة من قبل التي لا تحتوي على NKA. وأي خلية انتشرت حديثا إلا الإيجابي لNKA وستظهر الأخضر فقط. سوف تظهر الألياف العصبية أيضا الأخضر. </li></ol> 5. تحليل الصور لIonocyte الكمي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لEACح الخيشومية خيوط التي تم تصويرها، كميا المرحلية وتعصيب المرتبطة بالتنقل بين أقسام Z المكدس وإحصاء عدد رقائقي وfilamental المرحلية الحاضر وعما إذا كانت أو لم تكن متباينة حديثا، قبل القائمة، و / أو معصب . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المرحلية في خيوط أو في منطقة (مم 2) من خيوط. القيام بذلك عن طريق استخدام أدوات الرسم المرتبطة البرمجيات المستخدمة للحصول على صور لمخطط صفاحات من خيوط تشمل منطقة خيوط التي تم كميا المرحلية. معظم برامج التصوير متحد البؤر لديها خيار لحساب مساحة منطقة المبينة على الصورة. استخدام الخيار في برامج التصوير الذي يسمح لك أن تفعل هذا للحصول على المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم المرحلية عد من منطقة محسوبة من قبل البرنامج للحصول على قدر من المرحلية في وحدة المساحة (على سبيل المثال، في ملم 2). </li></ol>

<ol>
	<li>Katoh, F., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+transformation+and+long-term+replacement+of+branchial+chloride+cells+in+killifish+transferred+from+seawater+to+freshwater,+revealed+by+morphofunctional+observations+and+a+newly+established+'time-differential+double+fluorescent+staining'+technique.">Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established 'time-differential double fluorescent staining' technique.</a> J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).</li><li>Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+branchial+chloride+cells+and+gas+transfer+in+freshwater+fish.">Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).</li><li>Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+alters+the+respiratory+surface+area+of+crucian+carp+Carassius+carassius+and+goldfish+Carassius+auratus.">Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus.</a> J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).</li><li>Mitrovic, D., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+thermally+induced+gill+remodeling+on+ionocyte+distribution+and+branchial+chloride+fluxes+in+goldfish+(Carassius+auratus).">The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus).</a> J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).</li><li>Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoxia-induced+gill+remodelling+on+the+innervation+and+distribution+of+ionocytes+in+the+gill+of+goldfish,+Carassius+auratus.">Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus.</a> J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).</li><li>Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+soft-water+acclimation+on+gill+structure+in+the+rainbow+trout+Oncorhynchus+mykiss.">The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss.</a> Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).</li><li>Jonz, M. G., Nurse, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+mitochondria-rich+cells+and+associated+innervation+in+adult+and+developing+zebrafish.">Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).</li><li>Laurent, P., Hebibi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gill+morphometry+and+fish+osmoregulation.">Gill morphometry and fish osmoregulation.</a> Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).</li><li>Perry, S. F., Laurent, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptational+responses+of+rainbow+trout+to+lowered+external+NaCL+concentration:+contribution+of+the+branchial+chloride+cell.">Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell.</a> J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).</li><li>Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+fish+gill:+dominant+site+of+gas+exchange,+osmoregulation,+acid-base+regulation,+and+excretion+of+nitrogenous+waste.">The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste.</a> Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).</li><li>Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+fish+gills:+recent+progress+in+the+cellular+and+molecular+mechanisms.">Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Active+Uptake+of+Ions+into+Cells+and+Organisms.">The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).</li><li>Nilsson, G. E., Randall, D. J., Hoar, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+and+pharmacology+of+the+gills.">Innervation and pharmacology of the gills.</a> Fish Physiology. , 185-272 (1984).</li><li>Sundin, L., Nilsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branchial+innervation.">Branchial innervation.</a> J. Exp. Zool. 293 (3), 232-248 (2002).</li><li>Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+ionocytes+in+the+freshwater+fish+gill).">Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill).</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).</li><li>Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+Na+/K+-ATPase+in+the+gill+epithelium+of+rainbow+trout,+Oncorhynchus+mykiss.">Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss.</a> Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).</li><li>Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branchial+chloride+cell+proliferation+in+the+rainbow+trout,+Onchorhynchus+mykiss:+implications+for+gas+transfer.">Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer.</a> Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).</li><li>Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+gill+remodeling+on+transepithelial+sodium+fluxes+and+the+distribution+of+presumptive+sodium-transporting+ionocytes+in+goldfish+(Carassius+auratus).">The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus).</a> J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).</li><li>Chou, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypothermia+on+gene+expression+in+zebrafish+gills:+upregulation+in+differentiation+and+function+of+ionocytes+as+compensatory+responses.">Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses.</a> J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).</li><li>Kaneko, T., Katoh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+chloride+cells+in+killifish+Fundulus+heteroclitus,+a+euryhaline+teleost+with+seawater+preference.">Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference.</a> Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).</li><li>Ouattara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+gill+ionocyte+morphology+and+function+following+transfer+from+fresh+to+hypersaline+waters+in+the+tilapia+Sarotherodon+melanotheron.">Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron.</a> Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).</li><li>Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+branchial+chloride+cell+proliferation+on+respiratory+function+in+the+rainbow+trout,+Oncorhynchusmykiss.">The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss.</a> J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).</li><li>Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+gill+innervation+in+two+teleosts,+the+perch+and+the+trout.">Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout.</a> Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).</li><li>Jonz, M. G., Nurse, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+on+gill+innervation:+insights+from+a+model+vertebrate.">New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate.</a> J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).</li><li>Jonz, M. G., Zaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+control+of+the+gills.">Nervous control of the gills.</a> Acta Histochem. 111 (3), 207-216 (2009).</li><li>Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrabranchial+chemoreceptors+involved+in+respiratory+reflexes+in+the+neotropical+fish,+Colossoma+macropomum+(the+tambaqui).">Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui).</a> J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).</li><li>Hwang, P., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+fish+ion+regulation+and+mitochondrion-rich+cells.">New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> الساعة تقنية التفاضلية تلطيخ يمكن أن تكون أداة مفيدة لفهم التنظيم الديناميكي لامتصاص أيون ودراسة إعادة توزيع الزمني للالمرحلية في ظهائر الخيشومية. وعلى الرغم من إجراءات واضحة، وهناك عدد من النقاط الأساسية التي تعتبر حاسمة بالنسبة لنجاح الوقت تقنية التفاضلية تلطيخ. يجب أن تتعرض ذهبية لصبغ الحبيبات الخيطية الغنية للمرة المخصصة في البروتوكول. سوف تعرض أقصر يؤدي ذلك إلى ضعف الإقبال على صبغ من قبل خلايا الحبيبات الخيطية الغنية (أي ionocytes). أثناء التثبيت، يجب رفعه الأنسجة الخيشومية بسرعة وأبقى في الظلام لتجنب الصورة التبييض. يجب أن تتم معالجة الأنسجة للتصوير في حدود 2 أسابيع من التثبيت. خلال العصب إجراء باجتزاء الثنائي ضمان أن الأسماك هي الخدر بشكل جيد؛ يتم تحديد الأعصاب والأوعية الدموية بوضوح؛ وتستأنف الأسماك وظيفة وصادي كامل قبل أن يتم نقله إلى خزان الانتعاش. &quot;&gt; وتقدم بيئة FW السمك مع التحدي المزدوج للموازنة خسائر أيون سلبية وناضح مكاسب المياه 14. إن موازنة الخسائر أيون سلبية يحدث عن طريق امتصاص نشط من الملح عبر المرحلية التي تكون مترجمة إلى filamental وظهائر رقائقي حيث يمكن إجراء اتصال مباشر مع البيئة الخارجية 2،4،8،9،16. ومع ذلك، فإن موقع المرحلية على الخيشومية ليس جامدا. وعلى مدى العقود الثلاثة الماضية أظهرت عدد من الدراسات أن العديد من أنواع الأسماك FW، عندما واجه مع التحدي الأيونية و / أو درجة الحرارة، وإعادة توزيع الشهادات المرحلية خيشومي من خيوط أو قاعدة الصفيحة إلى المناطق الأكثر القاصي من الصفيحة 1،2،4،5،17-21. هذا إعادة توزيع قد يزيد من سماكة الصفيحة التي يمكن التنازل نقل الغاز (O 2، CO 2) عبر الظهارة الخيشومية واستخدمت 22. الباحثون تقنية اختلاف التوقيت تلطيخ وصفها في هذه المخطوطة لتتبع نقل وemergenc(ه) من المرحلية جديدة على ظهائر الخيشومية في ظل هذه الظروف التجريبية المختلفة (الشكل 1C) 1،4،5. الخياشيم، ويفترض المرحلية الخيشومية، ومعصب من قبل التاسع والعاشر الأعصاب القحفية 7،23-25. هذه الأعصاب تحمل كل من ناقل والمدخلات وارد من وإلى الخيشومية، على التوالي. وهي تقع في الجانب الظهري من الشدق وراء ال 4 الخيشومية القوس. سهولة الحصول على الأعصاب والسهولة التي يمكن أن يؤديها الإجراء إزالة التعصيب الثنائي هو نوع معين. في سمك السلمون المرقط، على سبيل المثال، وعلم التشريح وأشار وبالارض من الرأس يسمح للأعصاب للكذب في طائرة واحدة وراء ال 4 الخيشومية قوس تحت طبقة رقيقة من الأنسجة. وهذا يجعل الأعصاب وضوحا ويمكن الوصول إليها بسهولة للباحث لتنفيذ الإجراء إزالة التعصيب. في المقابل، ذهبية لها خطم أقصر ورأس مستدير. في التاسع والعاشر من الأعصاب القحفية ذهبية تكمن أعمق في سي الظهريةدي من تجويف بعد 4 تشرين الخيشومية قوس الاحتلال طائرات مختلفة. هذا التوجه يحد من سهولة الوصول إلى الأعصاب ويتطلب نهجا أكثر حذرا لتحديد وقطع الأعصاب المناسبة. والهدف من هذا الإجراء هو إزالة التعصيب لإزالة الحسي وارد وصادر المدخلات من وإلى الخيشومية، على التوالي. ويمكن أيضا إزالة التعصيب من الأقواس الخيشومية أن يقترن مع التجارب تدفق أيون باستخدام النظائر المشعة (على سبيل المثال، 22 نا). هذه التقنيات يمكن استخدامها جنبا إلى جنب لدراسة مساهمة المدخلات العصبي على حركة الأيونات عبر الظهارة الخيشومية. الحد أخرى إلى إجراء إزالة التعصيب هو عدم القدرة على التمييز بين الخلايا العصبية الحسية والحركية، وبالتالي عندما قطع العصب حزمة من الممكن أن كلا النوعين من تعصيب يتم إزالتها. قطع أي الخلايا العصبية الحركية قد تؤثر على الخيشومية والحركة وصادي من الأسماك. وهكذا عند تنفيذ التجارب إزالة التعصيب الخيشومية من المهم أيضا لمراقبة التهوية بعدوتعافى الأسماك من الإجراء لضمان أن هناك حركة الخيشومية كافية لكل من الغاز والتبادل الأيوني. البروتوكولات وصفها في هذه المخطوطات الحيوانات الكبار استخدام أبقت على ضوء 00:12: دورة الظلام وتغذية الكريات الغذائية التجارية. يمكن تعديل هذه الطرق في عدة طرق. أولا، فترة نقاهة بعد الحبيبات الخيطية الغنية التعرض صبغ يمكن تعديلها لمتطلبات بروتوكول الباحث (على سبيل المثال، 1، 3، 5، أو 14 يوما). وكانت أطول فترة من الانتعاش بعد التعرض للالحبيبات الخيطية الغنية صبغ في المختبر 14 يوما 4،5. لم يكن هناك انخفاض ملحوظ في كثافة مضان من صبغ الحبيبات الخيطية الغنية بعد 14 يوما من الانتعاش. ثانيا، استخدام الأجسام المضادة الأولية α-5 يقتصر على تحديد فقط الخلايا NKA الغنية ولا يميز بين أنواع فرعية مختلفة من المرحلية الخيشومية. لحسن الحظ، في ذهبية ثبت أن غالبية المرحلية على حد سواء mitochondrأيون الغنية (التسمية مع MitoTracker) وNKA الغنية (التسمية مع α-5) خلايا والتي قد لا يكون هذا هو الحال في جميع أنواع الأسماك 4،27. يمكن التجارب المستقبلية تركز على إثر إعادة توزيع الزمني لأنواع فرعية محددة IC باستخدام الأجسام المضادة الموجهة تحديدا ضد مجموعة متنوعة من القنوات والمضخات والمبادلات (على سبيل المثال، NHE، H + مضخة). وجدت دراسات سابقة أن غالبية ionocytes ملطخة-الحبيبات الخيطية الغنية صبغ المعرض NKA مناعية 4. يمكن الكشف عن تعصيب المرحلية باستخدام الأجسام المضادة الأولية ضد الخلايا العصبية محددة مستضد المستمدة من الزرد (الزنك، 12). في هذه الدراسة، α-5 و تم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية باستخدام نفس الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا فلور 488) لكل 12 الزنك. ويرجع هذا الحد على كل من الأجسام المضادة الأولية تثار في مجموعة الماوس والتغلب عليها حقيقة أن الخلايا NKA الغنية والخلايا العصبية يمكن تمييزها شكليا على الرغم من أنها يتألق نفس اللون. تلطيخ متسلسلمع الأجسام المضادة الثانوية المختلفة (على سبيل المثال، أول α-5 مع اليكسا فلور 488 ثم زد-12 مع اليكسا فلور 594) يمكن أن تستخدم أيضا للقضاء على مشكلة وجود كل علامات الاستشعاع نفس اللون. وأخيرا، يمكن تعديل البروتوكول باجتزاء العصبية ثنائي كامل لاستهداف الأعصاب إلى الأقواس الخيشومية محددة. على سبيل المثال، انتقائية باجتزاء العصبية يمكن أن يؤديها في أول قوس الخيشومية عن طريق فصل بلطف الأولى والثانية الأقواس الخيشومية لفضح الأعصاب مما يؤدي إلى أول قوس الخيشومية في نهاية الظهري للسلة الخيشومية (الشكل 2B-E). ويمكن أيضا أن تقنية اختلاف التوقيت تطبيقها على دراسة توزيع ionocytes في الأسماك الزرد اليرقات حيث تطوير والتحولات النقل أيون من الجلد إلى الخيشومية.

المرحلية هي وحدة وظيفية لتنظيم الأيونية في الأسماك وتوجد على أسطح الظهارية من خيوط الخيشومية وصفاحات 4،6-8،10. وعلى الرغم من مجموعة متنوعة من أنواع فرعية تم وصفها التي تمتلك ميزات فريدة من نوعها، وتتميز العديد من الشهادات المرحلية التي كتبها كثافة عالية من الميتوكوندريا (وبالتالي هي معروفة أيضا على أنها خلايا الحبيبات الخيطية الغنية) و / أو وفرة من انزيم نا + / K + أتباز (NKA). عادة، وهذه المرحلية المنزل مجموعة متنوعة من المضخات الأخرى، القنوات الأيونية والمبادلات المشاركة في تنظيم أيون (على سبيل المثال، نا + / H + مبادل، نا + / CL - شارك في نقل، H + مضخة) 2،10،11. إعادة توزيع وانتشار المرحلية كآلية تعويضية أمر أساسي للحفاظ على التوازن الأيوني خاصة خلال الضغط الأيونية (على سبيل المثال، والتعرض لسوء ايون المياه) 4،8،9. توضح هذه الدراسة وقت التفاضلي تلطيخ TECHNIكيو 1 لتحديد ionocytes انتشرت حديثا (المرحلية) في خياشيم الأسماك. ويقترن هذا الأسلوب مع إزالة التعصيب الثنائي كاملة من الأقواس الخيشومية. ذهبية (القشري)، والأنواع المستخدمة في هذه الدراسات، هي مناسبة تماما لدراسة تكاثر الخلايا الظهارية الخيشومية لأن لديهم قدرة ملحوظة لإعادة الهيكلية الخياشيم 2. يشير الخيشومية إعادة عرض لنمو أو تراجع من كتلة الخلية بين الصفاحات (ILCM) عندما السمك (حافظ عادة بسرعة 15 - 30 درجة مئوية) وتأقلم على المياه الباردة (&lt;15 ° C) أو نقص الأكسجين، على التوالي 3. وقد ركزت الدراسات السابقة باستخدام تقنية الزمن التفاضلية تلطيخ على ذهبية على إعادة التوزيع، وتعصيب انتشار المرحلية على الخيشومية في سياق الخيشومية إعادة عرض 4،5. Katoh وكانيكو 1 ضعت هذه التقنية الجديدة لدراسة التحول واستبدال المرحلية الخيشومية في أسماك الكيلي فيش (القوعاء heteroclitus) حوالةrred من مياه البحر (SW) على المياه العذبة (FW). في هذه الدراسة، ويتم التركيز على انتشار وتعصيب المرحلية في ذهبية تأقلم إلى 25 ° C. باستخدام تقنية الزمن التفاضلية تلطيخ أنه قد تبين أنه، في سياق إعادة عرض الخيشومية، ذهبية الحفاظ على عدد ثابت من المرحلية خلال التعرض ميتة والانتعاش normoxic لاحق، ومع ذلك، انخفضت النسبة المئوية للخلايا معصب طوال فترة الانتعاش normoxic 5. واقترح منذ أكثر من 70 عاما أن آليات امتصاص الأيونية في الأسماك هي تحت السيطرة العصبية 12. ومعصب على الخيشومية مكتملة العظام من الوجه (VII)، اللساني البلعومي (IX) والمبهم (X) الأعصاب يشار إليها أيضا باسم &quot;الأعصاب خيشومي&quot; 13،14. الدراسات التي Jonz وممرضة (2003) بشأن الزرد (دانيو rerio) الخيشومية تعصيب أظهر أن أصل تعصيب هو خارجي (خلايا الجسم من الألياف العصبية وخارجي لالخيشومية)، وكذلك جوهري (جسم الخلية منالألياف العصبية هو جوهري لالخيشومية). أظهر نفس الكتاب أيضا أن المرحلية خيشومي ومعصب خارجيا 7. في هذه الدراسة، تم استخدام تقنية التفاضلية الوقت تلطيخ جانب الكامل الخيشومية إزالة التعصيب الثنائي للتحقيق في انتشار المرحلية التي تفتقر إلى تعصيب خارجي في ذهبية. ويشير كامل الخيشومية إزالة التعصيب الثنائي لقطع الأعصاب القحفية التاسع والعاشر من هذين النهجين مجدية في ذهبية لأن حجمها كبير نسبيا (30-200 ز) يبسط العمليات الجراحية الدقيقة، ويتم تحديد ionocytes بسهولة باستخدام تقنيات المناعية النسيجية القياسية. في هذه الدراسة، تم تصور المرحلية باستخدام صبغة حيوية الحبيبات الخيطية محددة (على سبيل المثال، MitoTracker الأحمر) أو الأجسام المضادة الأولية ضد α-فرعية من نا + / K + -ATPase (α-5؛ دراسات الإنمائية بنك هجين، جامعة أيوا، أيوا سيتي IA). يوفر هذا البروتوكول على metho مباشرد من تصور وتحليل إعادة توزيع وانتشار المرحلية على الخيشومية الأسماك.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="736">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:235px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MitoTracker Red</td>
			<td style="width:235px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#945;-5 primary antibody</td>
			<td style="width:235px;">Develompental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:119px;">a5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">zn12 primary antibody</td>
			<td style="width:235px;">Develompental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:119px;">zn12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alexa Fluor 488 (anti mouse)</td>
			<td style="width:235px;">Life Technologies</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzocaine</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>E1501</td>
			<td>4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td>straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td>curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dumont No. 5 forceps</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue retractor</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>17009-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:235px;">Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H-1200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish

ionocytes الخيشومية (ICS) هي الوحدات الوظيفية لتنظيم الأيونية في الأسماك. في البالغين، وجدوا على filamental وظهائر رقائقي من الخيشومية حيث أيونات النقل مثل نا +، الكلورين - والكالسيوم 2+ عبر مجموعة متنوعة من القنوات الأيونية والمضخات والمبادلات. ومعصب على الخيشومية مكتملة العظام خارجيا من قبل الوجه (VI)، اللساني البلعومي (IX) والمبهم (X) الأعصاب. في التاسع والعاشر الأعصاب هي أيضا مصدر خارجي من الخيشومي IC تعصيب. هنا، يتم وصف اثنين من التقنيات المستخدمة لدراسة تعصيب، وانتشار وتوزيع المرحلية: وقت تقنية التفاضلية تلطيخ وتقنية الخيشومية إزالة التعصيب ثنائية كاملة. لفترة وجيزة، ويتعرض ذهبية لصبغة الحبيبات الخيطية محددة الحيوي (على سبيل المثال، MitoTracker الأحمر) التي تصف (مضان أحمر) المرحلية الموجودة مسبقا. سمح الأسماك إما لاسترداد لمدة 3 - 5 ايام أو خضع على الفور كامل الخيشومية إزالة التعصيب الثنائي. بعد 3-5 أيام من التعافي، وزويتم حصاد العلل وثابتة لالمناعية. ثم اتسخت الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية α-5 (الأهداف نا + / K + أتباز تحتوي على خلايا) بالتزامن مع الأجسام المضادة الثانوية التي تصم كل (كل من جديد وموجود مسبقا) المرحلية الأخضر. باستخدام التصوير متحد البؤر، وقد تبين أن المرحلية القائمة من قبل تظهر الصفراء (المسمى مع كل صبغة الحبيبات الخيطية محددة قابلة للحياة وα-5) والمرحلية الجديدة تظهر الخضراء (المسمى مع α-5 فقط). كلا تقنيات تستخدم جنبا إلى جنب يمكن تطبيقها على دراسة تعصيب، وانتشار وتوزيع الشهادات المرحلية على خيوط الخيشومية عندما تتعرض الأسماك للتحديات البيئية.

ويوضح الشكل 1 الجدول جراحة انشاء (الشكل 1A)، ووضع الأسماك أثناء الجراحة (الشكل 1B) وأهم الخطوات الثلاث للمرة التفاضلي تلطيخ تقنية (الشكل 1C). في الخطوة 1، يتم الاحتفاظ السمك لمدة 30 دقيقة في حمام مائي الهوائية بشكل جيد عند 25 درجة مئوية في الظلام. خلال فترة 30 دقيقة، ويمكن للباحث تحضير الصبغة قسامة-الحبيبات الخيطية الغنية في DMSO التي تضاف إلى الماء أثناء الخطوة 2 (الشكل 1C). فترة الحضانة في الخطوة 2 تسمح لامتصاص الصبغة-الحبيبات الخيطية الغنية من الماء في خلايا الحبيبات الخيطية الغنية (أي المرحلية). السمك يمكن بعد ذلك إما الخضوع لهذا الإجراء الكامل الثنائي إزالة التعصيب أو إجراء صورية التي يتم مخدرة الأسماك وأوصدة التلاعب بها ولكن تظل الأعصاب سليمة. وأنشئت في الخطوة 3 يمثل غرفة الإنعاش تزويد المياه المتدفقة للسمكة التي لديها الصناعات الاستخراجيةذر خضع لإزالة التعصيب ثنائي كامل أو &quot;صورية&quot; الإجراء. بعد فترة النقاهة، وكان الموت الرحيم الأسماك وتم رفعه الخياشيم والثابتة لالمناعية. ويصور التوزيع العام وتعصيب من ICS على خيوط الخيشومية من الأسماك التي خضعت ل&quot;صورية&quot; الإجراء في الشكل 2. المرحلية هي موجودة على ظهائر filamental وكذلك في القاعدة من المناطق بين الصفاحات. ويبين الشكل 2A المرحلية موجودة مسبقا وصفت مع الحبيبات الخيطية الغنية صبغ (أي وجود هذه الشهادات قبل أجريت إجراءات إزالة التعصيب / صورية). الشكل 2B يظهر الألياف العصبية التعصيب المرحلية الموجودة من قبل والتي شكلت حديثا (التي حددها NKA مناعية) من filamental و ظهائر رقائقي. وأخيرا، ودمج من الصورتين (الشكل 2C) يكشف بوضوح المرحلية القائمة من قبل (يبدو أصفر) والمرحلية جديدة (تظهر الخضراء).الشكل 2D هو الرسم البياني التمثيلي IC الكمي للخيوط مبين في الشكل 2A-C. على هذا خيط معين، يبدو أن هناك عدد أكبر من المرحلية انتشرت حديثا في ملم 2 من المرحلية الموجودة من قبل (N = 1). لإزالة مصدر تعصيب الخيشومي خارجي، قطعت التاسع والعاشر الأعصاب القحفية (تعصيب خارجي). ويبين الشكل 3A المنطقة الظهرية من تجويف وصادي بعد خيوط الخيشومية وأزيلت ظهائر التي تغطي الأعصاب لفضح التاسع والعاشر الأعصاب القحفية (المشار إليها مع الأرقام الرومانية) التي تمتد من اثنين من جذوع الأعصاب الرئيسية ليعصب كل الأقواس الأربعة (الشكل 3A)؛ يتم ترقيم الأقواس الخيشومية من 1 إلى 4. الشكل 3B-E توضيح إزالة التعصيب الانتقائي لأول قوس الخيشومية. ومعصب أول قوس الخيشومية من قبل كل من التاسع والعاشر الأعصاب القحفية (الشكل 3B) التي يمكن إزالتها دون التأثير على تعصيب إلى بقية سو الأقواس الخيشومية (الشكل 3C-E). النتائج الكاملة إزالة التعصيب الثنائية في الفقدان التدريجي للتعصيب خارجي للخيوط الخيشومية (أرقام 4A-C). الأسماك السيطرة المعرض لحزمة الأعصاب واضحة والتي تمتد على طول خيوط (الشكل 4A). أدى إزالة التعصيب ثنائي كامل في فقدان بعض من تعصيب خارجي بعد 2 أيام من الانتعاش (الشكل 4B). ولوحظ أيضا اختفاء تعصيب خارجي بعد 5 أيام من التعافي من إزالة التعصيب (الشكل 4C). أي تعصيب المتبقية لالمرحلية بعد 5 أيام من الانتعاش يفترض اشتق من الأعصاب مع أجسام الخلايا داخل خيوط الخيشومية (تعصيب ذاتي؛ الشكل 4C). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" width="600" /> ضبط الشكل 1. التجريبية تصل لهذا الإجراء إزالة التعصيب وتسلسل الخطوات المستخدمة فيالوقت تقنية التفاضلية تلطيخ. (A) طاولة جراحة التي أنشئت من أجل إجراء إزالة التعصيب تظهر الدبابات التخدير والإنعاش. (B) مثال على تنسيب من مخدرة والأسماك مدخل أنبوب. (C) الخطوات الرئيسية المستخدمة في الوقت تقنية التفاضلية تلطيخ. في الخطوة 1، يتم وضع الأسماك في درجة الحرارة للرقابة، ثابت حمام الماء الهوائية لمدة 30 دقيقة. يضاف صبغ الحبيبات الخيطية الغنية في الخطوة 2 إلى تركيز النهائي من 0.1 ميكرومتر ويسمح للأسماك ليستحم في الحل مدة لا تقل عن 4 ساعات. إعادة تشغيل تدفق المياه في الخطوة 3 وعند هذه النقطة الأسماك يخضع إما إزالة التعصيب الثنائي الكامل للالخيشومية أو جراحة صورية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg" width="600"<html> /&gt; الشكل 2. الميكروسكوب الخفيفة تمثل في الوقت تقنية التفاضلية تلطيخ في سمكة ذهبية (تأقلم إلى 25 ° C) بعد 2 أيام إزالة التعصيب ثنائي كامل. (A) توزيع ionocytes الموجودة مسبقا (المرحلية، السهام). على خيوط الخيشومية واحد هو كشف كل الحبيبات الخيطية الغنية صبغ تلطيخ (B) توزيع الشهادات المرحلية الأعصاب (الجديدة والموجودة من قبل) وخيشومي (السهام متقطع) والتي كشفت عنها تلطيخ مع α-5 والزنك، 12 الأجسام المضادة، على التوالي. وتبين الأسهم المرحلية (C) وتداخل (A) و (B) يميز المرحلية القائمة من قبل. (تظهر الأصفر، يدل على النصال) من المرحلية انتشرت حديثا (تظهر الخضراء، المشار إليها السهام). إدراج في (C) هو التكبير من قبل القائمة ionocyte معصب. (D) الرسم البياني الممثل من IC الكمي للخيوط هو موضح في لوحات (AC). N = شريط 1. مقياس في لوحة (C) هو 50 ميكرون وينطبق على جميع لوحات./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" width="700" /> الشكل 3. صور الممثل يصور مراحل مختلفة من تعصيب الخيشومية. عرض (A) الظهرية من الشدق تبين التاسع والعاشر الأعصاب القحفية التعصيب كل 4 الخيشومية الأقواس. يتم ترقيم الأقواس الخيشومية 1-4. يتم فصل خيوط الخيشومية والأنسجة التي تغطي أزيلت الأعصاب لتصور أفضل للتعصيب. (ب) شارع 1 و 2 الأقواس الخيشومية الثانية للكشف عن الجهاز الحسي وفروع التاسع والعاشر الأعصاب القحفية التعصيب الحادي الخيشومية 1 القوس. (CE) تسلسل الصور التي تبين إزالة التعصيب الانتقائي لل1 الحادي الخيشومية قوس بقطع فروع التاسع والعاشر الأعصاب القحفية. لإعادة التخطيطيعرض الخيشومية تعصيب من الأسماك مكتملة العظام، راجع الشكل 1 في Milsom وآخرون 26 خطوط بيضاء في الصور هي انعكاس الماء من أضواء المجهر؛ أنها لا تعرف أي هيكل الصرفي. شريط النطاق في لوحة (E) هو 4 ملم وينطبق على جميع لوحات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" width="700" /> كانت ملطخة الشكل 4. الميكروسكوب ضوء تصور التوزيع وتعصيب من ionocytes على خيوط واحد من 1 الحادي الخيشومية قوس سمكة ذهبية تأقلم إلى 25 درجة مئوية. Ionocytes (المشار إليها رؤساء السهم) مع الأجسام المضادة α-5 والأعصاب (المشار إليها بكانت ملطخة السهام ص) مع الأجسام المضادة الزنك-12. (A) جيل خيوط سمكة السيطرة يظهر حزمة الأعصاب المركزية التي تنشأ يفترض من التاسع والعاشر الأعصاب (تعصيب خارجي) مع رقائقي واسعة المتفرعة. ومعصب بعض ionocytes أشار أيضا (إدراج). (ب) الخيشومية خيوط بعد 2 أيام إزالة التعصيب ثنائي كامل. كان هناك انخفاض في حزمة الأعصاب المركزية في حين ظهر تعصيب رقائقي سليمة إلى حد كبير. (C) والخيشومية خيوط بعد 5 أيام إزالة التعصيب ثنائي كامل مما يدل على أن تعصيب خارجي كان غائبا إلى حد كبير. ويشير التحليل النوعي أن إزالة التعصيب الثنائي الكامل يسبب تدهور تعصيب خارجي الخيشومية مع الحفاظ على الأعصاب مع أجسام الخلايا داخل خيوط الخيشومية (تعصيب جوهري) إنشاء شبكة من الأعصاب من خلال خيوط وداخل الصفيحة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء</a>انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish at JoVE.com

A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

تقنية وقت التفاضلية تلطيخ جانب كامل الثنائي جيل إزالة التعصيب لدراسة Ionocytes في السمك

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

a-time-differential-staining-technique-coupled-with-full-bilateral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  University of Ottawa. This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation. 

Video: A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

التقاط إصلاح الأنسجة في الزرد اليرقات مع الوقت الفاصل بين Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

علاج المخدرات و<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من خلية بناء العظم، تآكل العظام Osteoclast التفاعلات في نموذج الميداكا السمك هشاشة العظام

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

تقنية زرع الثدي الثديية الرواية جديدة لتصور الجيل سفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

أسلوب الثقافة أورجانوتيبيك لدراسة تطوير الأنسجة الجنينية الدجاج

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

طريقة الثقافة المشتركة لدراسة النيرايت الناء في الاستجابة لإشارات اللب الأسنان باراكرين

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

نموذج دروسوفيليا لدراسة البوليسبليد الناجم عن الجروح

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from the presomitic mesoderm (PSM) as the tail end of the embryo elongates posteriorly. Somites form with regular periodicity and scale in size. Zebrafish is a popular model organism as it is genetically tractable and has transparent embryos that allow for live imaging. Nevertheless, during somitogenesis, fish embryos are wrapped around a large, rounding yolk. This geometry limits live imaging of PSM tissue in zebrafish embryos, particularly at higher resolutions that require a close objective working distance. Here, we present a flattened 3-D tissue culture method for live imaging of zebrafish tail explants. Tail explants mimic intact embryos by displaying a proportional slowdown of axis elongation and shortening of rostrocaudal somite lengths. We are further able to stall axis elongation speed through explant culture. This, for the first time, enables us to untangle the chemical input of signaling gradients from the mechanistic input of axial elongation. In future studies, this method can be combined with a microfluidic setup to allow time-controlled pharmaceutical perturbations or screening of vertebrate segmentation without any drug penetration concerns.

Here, we present the protocol for 3-D tissue culture of the zebrafish posterior body axis, enabling live study of vertebrate segmentation. This explant model provides control over axis elongation, alteration of morphogen sources, and subcellular resolution tissue-level live imaging.

ثقافة Explant الذيل ثلاثي الأبعاد لدراسة تجزئة الفقاريات في حمار وحشي

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...