We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.

Ambos os protocolos conformados com as diretrizes do Conselho Canadense de Atenção Animal (CCAC) e foram realizadas com a aprovação da Universidade do Comitê Animal Care Ottawa (Protocolo BL-226). 1. Tempo de coloração diferencial Técnica: Mitochondrion-rico Dye Bath <ol><li> Preparar uma solução-mãe de MitoTracker Red mM através da dissolução de 50 ug em 94,0 mL de dimetilsulfóxido (DMSO a 100%). Mantenha a solução estoque no escuro a -20 ° C quando não em uso. Evitar ciclos de congelamento / descongelamento. </li><li> Prepare caixas escuras (3-6 caixas) com um volume máximo de 600 ml. Preencha as caixas com 400 ml de água do sistema (água, os peixes são normalmente realizada em) e coloque uma pedra de ar em cada caixa para proporcionar uma fonte de O 2. Obter peixinho (30 - 40 g) e colocá-los nas caixas com 400 ml de água e uma pedra de ar. Após 30 min, adicionar o corante rico em mitocôndria viável para se obter concentrações finais de 0,1 ^ M e 0,01% de DMSO. Banhe os peixes para 4 hr. <ol><li> Se estes são os peixes de controle (ou seja, sem a desnervação), ligar o fluxo de água para as caixas, permitir que o corante para lavar e recuperar o peixe para o período de tempo previsto no protocolo. Os peixes são tipicamente recuperado para 3-5 dias. </li></ol></li><li> Após o período de recuperação prossiga para a Secção 3: Técnica tempo de coloração diferencial: Imunohistoquímica. Se esses peixes devem ser desnervado vá para a Seção 2: Completa Processo denervação Bilateral. </li></ol> 2. completa Bilateral Procedimento denervação <ol><li> Obter um par de estudantes tesoura primavera Vannas (curvas), 1 par de fórceps retas padrão standard, 1 par de fórceps curvas padrão standard, 2 pares de No. 5 fórceps, 1 par de afastador de tecidos, pequenas bolas de algodão (1 - 2 mm de diâmetro) e cotonetes (Q dicas ou equivalente). </li><li> Prepare o banho de água anestésico. Em primeiro lugar, dissolve-se 10 g de benzocaína para um volume final de 100 mlde 99% de etanol para preparar uma solução estoque. Para preparar o banho de água anestésico, dissolver 15 ml da solução de estoque benzocaína em 30 L de água do sistema arejada à temperatura requerida. Arejar a água, colocando um ar-pedra conectado a uma bomba de ar ou uma linha central de ar no reservatório de água. <ol><li> Coloque o peixe na água do banho anestésico (Figura 1A). </li><li> Uma vez que a respiração cessa, coloque o peixe sobre uma mesa de cirurgia e entubar-lo como mostrado na Figura 1B. Faça isso através da inserção de um tubo em sua cavidade bucal para irrigar as brânquias com solução anestésica aerado. Irrigação das brânquias garante que o peixe é fornecido com uma quantidade suficiente de O 2 e anestésico durante o procedimento de desnervação. Coloque o peixe de modo que a cabeça está inclinada levemente para baixo. Isto permite um melhor acesso ao espaço atrás do quarto arco branquial. </li></ol></li><li> Levante cuidadosamente o opérculo com a pinça padrão standard retase colocar os afastadores de tecido entre o opérculo e o interior da cabeça. Abra cuidadosamente os afastadores de tecido para manter o opérculo longe da cabeça e manter as brânquias expostas. </li><li> Certifique-se de que a solução anestésica é irrigar as brânquias durante este procedimento. Descanse o afastador lida ao lado da cabeça que dá acesso a todos os quatro arcos de emalhar. </li><li> Coloque a pinça padrão standard curvas entre o quarto arco branquial e parte de trás da cabeça e gentilmente abri-los para criar uma tensão no ligamento prender o quarto arco branquial na cabeça. Com um par de fórceps No. 5 criar uma pequena abertura (2-3 mm), perfurando o epitélio a ligação da extremidade dorsal dos arcos de emalhar para a cavidade do opérculo. Tenha cuidado para não ir muito fundo, porque há o risco de danificar um grande vaso sanguíneo. </li><li> Com uma bola de algodão pequeno realizada com No. 5 fórceps devagar e com cuidado expandir a incisão para expor a IX (glossofaríngeo) e X (vago) nervos. Livrenervos de qualquer tecido conjuntivo usando o No. 5 fórceps, novamente tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos. NOTA: O IX branquial e X nervos do peixinho descanso profundo por trás do quarto arco branquial e estão em proximidade com os grandes vasos sanguíneos que alimentam os arcos de emalhar. </li><li> Uma vez que os nervos foram identificados Use a tesoura primavera curvas para cortar cuidadosamente os nervos enquanto segura a incisão aberta com as curvas forceps forma padrão. Depois de cortar os nervos, retrair delicadamente as pinças curvas. Não há necessidade de fechar a incisão com suturas porque o epitélio é muito fina e a incisão normalmente fecha por si própria dentro de 24 - 48 h. Remover afastador de tecido. </li><li> Repetir o mesmo procedimento no outro lado da cabeça. </li><li> Alterne a irrigação das brânquias de anestésico a água gasosa fresca para recuperar o peixe da anestesia. Uma vez que os movimentos operculares retomaram mover o peixe em tanques experimentais para se recuperar por pelo menos 24 horas. </li><li&gt; Executar um procedimento de &quot;farsa&quot; em um conjunto separado de peixe. O procedimento de &quot;sham&quot; envolve a perfuração do epitélio atrás do quarto arco branquial, sem cortar os nervos. </li></ol> 3. Tempo de coloração diferencial Técnica: Imunohistoquímica <ol><li> Em primeiro lugar, preparar 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x tampão fosfato salino (PBS; 4 g PFA em 96 ml de PBS). O PFA não se dissolvem facilmente em PBS à temperatura ambiente. Solução de calor em banho-maria para dissolver PFA. Realize esta em um exaustor. Uma vez PFA está em solução deixe esfriar antes de usar. Armazenar a 4 ° C por até 2 semanas. </li><li> Antes da eutanásia de peixe e extraindo o tecido branquial, coloque 3 - 4 ml de PFA a 4% para um frasco de cintilação para um total de 8 frascos de cintilação (1 frasco) por arco branquial. Além disso, tomar um pequeno barco pesar e preenchê-lo com 1x PBS. Isto irá ser utilizado para lavar o tecido depois de ter sido excisada. Mantenha todas as soluções em gelo. </li><li> Após a exposição de corante rico em mitocôndrias viávelexperimento terminou, eutanásia do peixinho, colocando-o em banho-maria com uma overdose de benzocaína. </li><li> Use uma pinça rombas para levantar o opérculo de um lado da cabeça e tesoura curva para cortar cada extremidade do cesto branquial branquial. Com cuidado, pegue as brânquias pelos rakers usando uma pinça sem corte e levantá-los para fora da cavidade opercular. Lavar imediatamente as brânquias no gelo frio 1x PBS para remover o excesso de benzocaína e sangue. </li><li> Coloque as brânquias excisadas em frascos separados (um frasco para cada arco branquial) cheios de 4% PFA e corrigir O / N a 4 ° C. </li><li> Após a fixação, lavar o excesso de PFA em PBS 1X e colocar o tecido num tubo de bala 2 ml cheia com 1,5 ml de 1% de Triton-X num agitador durante 6 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. Este passo permeabiliza o tecido. Se toda a guelra é grande demais para colocar em um tubo de 2 ml, em seguida, cortar o tecido em seções pequenas o suficiente para caber o tubo tomando cuidado para não danificar os filamentos. <ol><li> Prepare as diluições de anticorpos primários por mixing 4 mL da solução stock de cada anticorpo primário (total de 8 ul) em 992 ul de 1x PBS. Certifique-se de que a NKA (etiquetas células NKA-ricos) e Zn-12 (etiquetas neurônios) anticorpos primários foram levantadas no mesmo host. Isto é importante se os pesquisadores decidir identificar subtipos IC específicas, ao mesmo tempo em que eles vão ter que usar anticorpos primários e secundários criados em uma espécie hospedeira diferentes. </li><li> Remover a solução de Triton-X e lavagem do tecido, sem adicionar um 1: 250 de diluição (dilua em PBS 1x) de um anticorpo monoclonal de NKA (α-5) para detectar as células-NKA ricas e um anticorpo específico neuronal peixe-zebra (zn-12) para detectar as fibras nervosas (anticorpos primários) e incubar num agitador durante 6 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavar o anticorpo primário 3 vezes durante 3 minutos cada uma usando PBS 1x. Para fazer isso, remover a solução de anticorpo primário a partir do tubo de aspiração para fora usando uma pipeta. </li><li> Prepare o anticorpo secundário, a um1: 200 de diluição por mistura de 5 uL de anticorpo secundário estoque em 995 ul de 1x PBS. Aplicar anticorpo secundário (com Alexa Fluor 488) e incuba-se durante 6 h à TA ou O / N a 4 ° C num agitador. NOTA: MitoTracker Red está animado com a ~ 594 nm de comprimento de onda e fluorescência vermelha. Um anticorpo secundário que está animado com a ~ 488 nm de comprimento de onda e verde fluorescente deve ser usado para rotular NKA e Zn-12 anticorpos primários. </li><li> Remover o excesso de anticorpo secundário por lavagem do tecido 3 vezes durante 5 minutos cada (como descrito no passo 3.7). </li></ol> 4. Criação de Imagens <ol><li> Após as lavagens, montar o tecido sobre uma lâmina côncava para toda montar imagem confocal de células e fibras nervosas. Para montar o tecido, primeiro colocá-lo em uma gota (200 ul) de 1x PBS numa lâmina de microscópio plana. Isso garante que o tecido não desidratar. </li><li> Separe os hemibranchs emalhar com o micro-tesoura curva. Coloque uma gota de 1x PBS e uma gota de meio de montagem em um slide côncava. </li><li> Coloque as hemibranchs separados no slide côncavo com a borda do filamento voltada para cima e cubra com uma tampa de deslizamento. Umedeça as bordas da lamínula com unha polonês, a fim de evitar que a tampa de deslizamento de mover-se ao redor e deslocar o tecido. Permitir que o tecido se depositem no fundo da corrediça côncava para 10 - 15 minutos antes da imagiologia. </li><li> Para cada arco branquial, selecione seis filamentos de emalhar de forma aleatória para geração de imagens, produzindo seis imagens por arco branquial. Use microscopia confocal convencional para a imagem do tecido, tendo 1 - 3 mm fatias ópticos. NOTA: Todas as células pré-existentes serão marcados com MitoTracker Red e positivo para NKA aparecerá apenas amarelo. As células que só aparecem em vermelho são ICs pré-existentes que não contêm NKA. Qualquer célula recém-proliferaram só será positivo para NKA e aparece apenas verde. As fibras nervosas também aparecerá verde. </li></ol> 5. Análise de Imagem para Ionocyte Quantificação <ol><li> Para each filamento branquial, que foi fotografada, quantificar os ICs e inervação associado percorrendo as seções da pilha Z e contando o número de ICs lamelar e filamentosa presente e se ou não eles são recém-diferenciadas, pré-existente e / ou inervado . </li><li> Quantificar os ICs por filamento ou por área (mm 2) de filamento. Faça isso usando as ferramentas de desenho associados ao software usado para adquirir as imagens para delinear as lamelas do filamento, incluindo a área do filamento em que os ICs foram quantificados. A maioria dos programas de software de imagem confocal tem a opção de calcular a área de uma região delimitada na imagem. Use a opção no software de imagem que permite que você faça isso para adquirir a área. </li><li> Dividir os CIs contados por a área calculada pelo software para obter uma medida de CIs por unidade de área (por exemplo, por 2 mm). </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> O tempo de técnica de coloração diferencial pode ser uma ferramenta útil para compreender a regulação dinâmica de absorção de íons e examinar a redistribuição temporal dos ICs no epitélio branquial. Embora um procedimento simples, existem um número de pontos-chave que são cruciais para o sucesso da técnica de coloração diferencial de tempo. O peixinho deve ser exposto ao corante rico em mitocôndrias para o tempo previsto no protocolo. Exposições mais curtas irá resultar em má absorção do corante pelas células ricas em mitocôndria (ou seja, ionocytes). Durante a fixação, o tecido deve ser brânquia rapidamente excisado e mantidas no escuro para evitar branqueamento foto. O tecido deve ser processado para a imagem latente dentro de 2 semanas de fixação. Durante o procedimento de secção do nervo bilateral garantir que o peixe é bem anestesiado; os nervos e vasos sanguíneos são claramente identificados; e os peixes retoma função opercular completo antes de ser movido para um tanque de recuperação. &quot;&gt; O ambiente FW apresenta peixe com o duplo desafio de equilibrar as perdas de iões de passivos e ganho de água osmótica 14. O equilíbrio de perdas de íons passiva ocorre através da captação ativa de sal entre os ICs que estão localizadas ao filamentosa e epitélios lamelar onde podem fazer contacto directo com o ambiente externo 2,4,8,9,16. No entanto, a localização dos componentes no brânquia não é estática. Ao longo das últimas três décadas um número de estudos demonstraram que várias espécies de peixes FW, quando confrontados com um desafio iónica e / ou temperatura, redistribuir CIs branquiais do filamento ou base da lamela para as regiões mais afastadas da lamela 1,2,4,5,17-21. Tal redistribuição pode aumentar a espessura das lamelas que pode comprometer a transferência de gás (O 2, CO 2) através do epitélio branquial 22. Os pesquisadores usaram a técnica de coloração diferencial de tempo descrito neste manuscrito para acompanhar a deslocalização e emergence de novos ICs no epitélio branquial, nas condições experimentais diferentes (Figura 1C) 1,4,5. As brânquias e, presumivelmente, os ICs branquial, são inervados pelos IX e X nervos cranianos 7,23-25. Esses nervos transportar tanto eferente e inputs aferentes de e para o Gill, respectivamente. Eles estão localizados no lado dorsal da cavidade bucal por trás do 4º arco branquial. A acessibilidade dos nervos e a facilidade com que o procedimento de desnervação bilateral pode ser realizada é específico da espécie. Em trutas, por exemplo, a anatomia pontiagudo e achatada da cabeça permite que os nervos se encontram num plano atrás do 4º arco branquial sob uma fina camada de tecido. Isso faz com que os nervos visível e de fácil acesso ao pesquisador para realizar o procedimento de desnervação. Em contraste, o peixe dourado tem um focinho mais curto e uma cabeça mais redonda. Os IX e X nervos cranianos de peixinho mentir mais fundo no si dorsalde da cavidade após a 4ª arco branquial ocupando diferentes planos. Esta orientação limita a facilidade de acesso para os nervos e requer uma abordagem mais cuidadosa para identificar e cortar os nervos apropriados. O objectivo do processo é o de remover a desnervação aferente e eferente sensorial entrada e a partir da guelra, respectivamente. A desnervação dos arcos de brânquia também pode ser acoplado com experiências de fluxo de iões utilizando radioisótopos (por exemplo, 22 Na). Estas técnicas podem ser utilizadas em conjunto para estudar a contribuição de entrada nervoso em movimento de iões através do epitélio branquial. Outra limitação com o processo desnervação é a incapacidade de distinguir entre os neurónios sensoriais e motoras, assim quando cortando o feixe de nervos, é possível que ambos os tipos de inervação estão a ser removido. Cortando qualquer neurônios motores podem afetar a guelra e movimento opercular do peixe. Assim, quando a realização de experimentos de denervação de emalhar é importante para monitorar também a ventilação após apeixe tem recuperado do procedimento para garantir que há um movimento de emalhar suficiente para gás e de troca iônica. Os protocolos descritos neste uso animais adultos manuscrito conservado em um 0:12 luz: ciclo escuro e pelotas de alimentos comerciais alimentados. Estes métodos podem ser modificados de várias maneiras. Em primeiro lugar, o período de recuperação após a exposição corante rico em mitocôndria pode ser ajustado para as exigências do protocolo do pesquisador (por exemplo, 1, 3, 5, ou 14 dias). O mais longo período de recuperação após a exposição corante rico em mitocôndrias no laboratório foi 14 dias 4,5. Não houve uma diminuição significativa na intensidade da fluorescência do corante rico em mitocôndria após 14 dias de recuperação. Em segundo lugar, a utilização de 5 a α-anticorpo primário está limitado a apenas a identificação de células NKA-rico e não distingue entre os diferentes subtipos de CIs branquiais. Felizmente, em peixinho foi estabelecido que a maioria dos ICs são ambos mitochondrion-rico (etiqueta com MitoTracker) e NKA-rich (etiqueta com α-5) células que podem não ser o caso em todas as espécies de peixes 4,27. Experimentos futuros podem se concentrar em seguir a redistribuição temporal do IC subtipos específicos usando anticorpos dirigidos especificamente contra uma variedade de canais, bombas e trocadores (por exemplo, NHE, H + bomba). Estudos anteriores descobriram que a maioria dos ionocytes corados com rico em mitocôndrias corante exposição NKA immunoreactivity 4. Inervação dos CIs pode ser detectada utilizando um anticorpo primário contra o antigénio específico de neurónios derivados de peixe-zebra (zn-12). Neste estudo, α-5 e anticorpos primários foram detectados utilizando o mesmo anticorpo secundário (com Alexa Fluor 488) para ambas 12-zn. Esta limitação é devido a ambos os anticorpos primários ter sido criado num ratinho hospedeiro e é superado pelo fato de que as células-NKA ricas e os neurónios podem ser distinguido morfologicamente mesmo que fluorescem a mesma cor. Pela coloração seqüencialcom diferentes anticorpos secundários (por exemplo, primeiro α-5 com Alexa Fluor 488, em seguida, zn-12 com Alexa Fluor 594) também pode ser usado para eliminar o problema de ter ambos os marcadores fluorescentes da mesma cor. Por fim, o protocolo de secção do nervo bilateral completa pode ser modificado para atingir nervos para arcos de brânquia específicos. Por exemplo, a secção do nervo selectiva pode ser realizada no primeiro arco branquial, separando suavemente os primeiro e segundo arcos de emalhar para expor os nervos que levam ao primeiro arco branquial no final dorsal do carrinho guelras (Figura 2B-E). A técnica de tempo diferencial também pode ser aplicado para estudar a distribuição de ionocytes em peixes-zebra de larvas de peixe como elas se desenvolvem e transições de transporte de iões a partir da pele para o branquial.

ICs são a unidade funcional para regulação iônica em peixes e são encontradas nas superfícies epiteliais dos filamentos de emalhar e lamelas 4,6-8,10. Embora uma variedade de subtipos foram descritos que possuem características únicas, muitos dos CIs são caracterizados por uma alta densidade de mitocôndrias (assim, eles são também conhecidos como células ricas em mitocôndria) e / ou uma abundância da enzima Na + / K + ATPase (NKA). Tipicamente, estes CIs casa uma variedade de outras bombas, permutadores de iões e canais envolvidos na regulação de iões (por exemplo, Na + / H +, Na + / Cl - o co-transportador, bomba H +) 2,10,11. A redistribuição e proliferação de ICs como um mecanismo compensatório é central para a manutenção da homeostase de íons particularmente durante o estresse iônico (por exemplo, a exposição à água ion-pobre) 4,8,9. Este estudo descreve um tempo de coloração diferencial techniQue um para identificar ionocytes recém proliferaram (ICs) nas brânquias dos peixes. Esta técnica é acoplado com uma desnervação completa bilateral dos arcos branquiais. Goldfish (Carassius auratus), as espécies utilizadas nestes estudos, é bem adequado para estudar a proliferação de células epiteliais de emalhar, porque eles têm uma notável capacidade de remodelar estruturalmente suas brânquias 2. Gill refere-se a remodelação do crescimento ou de retracção de uma massa celular interlamelar (ILCM) quando o peixe (normalmente mantida entre 15 - 30 ° C) são aclimatados a água fria (&lt;15 ° C) ou hipoxia, respectivamente 3. Estudos anteriores utilizando a técnica de coloração diferencial tempo em peixe têm-se centrado na redistribuição, inervação e proliferação de componentes no brânquia no contexto da brânquia remodelação 4,5. Katoh e Kaneko 1 desenvolveu esta nova técnica para estudar a transformação e substituição de ICs branquial em killifish (heteroclitus Fundulus) transferred da água do mar (SW) para água fresca (FW). Neste estudo, o foco é sobre a proliferação e inervação dos ICs em peixinho aclimatados a 25 ° C. Usando a técnica de coloração diferencial de tempo, foi demonstrado que, no contexto da remodelação branquial, peixinho manter um número constante de CIs durante a exposição hipóxica e subsequente recuperação normóxico, no entanto, a percentagem de células inervados diminuiu ao longo do período de recuperação de 5 normóxicas. Propôs-se mais de 70 anos atrás, que os mecanismos de captação iônicos em peixes estão sob controle neural 12. O Gill teleost é inervado pelo facial (VII), glossofaríngeo (IX) e vago (X), os nervos também referidos como os &quot;nervos&quot; branchial 13,14. Estudos realizados por Jonz e Nurse (2003) no peixe-zebra (Danio rerio) inervação Gill mostrou que a origem da inervação é extrínseca (corpo celular da fibra nervosa é extrínseca ao Gill), bem como intrínseca (corpo celularfibra nervosa é intrínseco à Gill). Os mesmos autores também demonstraram que ICs branquiais são extrinsecamente inervados 7. Neste estudo, o tempo de técnica de coloração diferencial acoplado com total denervação Gill bilateral foi utilizado para investigar a proliferação de ICs falta inervação extrínseca em peixinho. Completa desnervação Gill bilateral refere-se a cortar os nervos cranianos IX e X. Essas duas abordagens são viáveis ​​em peixinho porque seu tamanho relativamente grande (30-200 g) simplifica os procedimentos cirúrgicos delicados, e ionocytes são prontamente identificados utilizando técnicas imuno-histoquímica padrão. No presente estudo, CIs foram visualizadas utilizando um corante vital específicos de mitocôndria (por exemplo, MitoTracker Red) ou um anticorpo primário contra o α-subunidade de Na + / K + -ATPase (α-5; Developmental Studies Hybridoma Bank, Universidade de Iowa, Iowa City IA). Este protocolo prevê um meto simplesd de visualizar e analisar a redistribuição e proliferação de ICs na guelra de peixe.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="736">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:235px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MitoTracker Red</td>
			<td style="width:235px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#945;-5 primary antibody</td>
			<td style="width:235px;">Develompental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:119px;">a5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">zn12 primary antibody</td>
			<td style="width:235px;">Develompental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:119px;">zn12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alexa Fluor 488 (anti mouse)</td>
			<td style="width:235px;">Life Technologies</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzocaine</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>E1501</td>
			<td>4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td>straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td>curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dumont No. 5 forceps</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue retractor</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>17009-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:235px;">Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H-1200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish

Ionocytes branquial (ICs) são as unidades funcionais para regulação iônica em peixes. Em adultos, eles são encontrados na filamentosa e epitélios lamelar das brânquias, onde elas íons de transporte, tais como Na +, Cl - e Ca 2+ através de uma variedade de canais iônicos, bombas e trocadores. O Gill teleost é extrinsecamente inervados pelo facial (VI), glossofaríngeo (IX) e vago (X) nervos. Os nervos IX e X também são a fonte extrínseca de branchial inervação IC. Aqui, duas das técnicas utilizadas para estudar a inervação, proliferação e distribuição de CIs são descritos: a técnica de coloração diferencial de tempo e uma técnica de emalhar desnervação completa bilateral. Resumidamente, peixinho são expostos a um corante específico da mitocôndria vital (por exemplo, MitoTracker Red) que rotula (fluorescência vermelha) CIs pré-existente. Peixes ou foram deixadas recuperar durante 3 - 5 dias, ou imediatamente submetido a uma desnervação brânquia bilateral completa. Depois de 3-5 dias de recuperação, o gmales são colhidas e fixadas para imuno-histoquímica. O tecido é então coradas com um α-5 (anticorpo primário alvos de Na + / K + ATPase que contenha células) em conjunto com um anticorpo secundário que rotula todas (tanto novo e pré-existente) CIs verde. Usando imagem confocal, demonstrou-se que ICs pré-existentes aparecem amarelo (rotulados com tanto um corante específico da mitocôndria viável e α-5) novos ICs e aparecem verde (com apenas α-5). Ambas as técnicas utilizadas em conjunto pode ser aplicado para estudar a inervação, proliferação e distribuição dos componentes no filamento de guelra em que os peixes são expostos aos desafios ambientais.

A Figura 1 ilustra a mesa de cirurgia criada (Figura 1A), a colocação do peixe durante a cirurgia (Figura 1B) e as três etapas mais importantes para a técnica de coloração de tempo diferencial (Figura 1C). No Passo 1, o peixe é mantido durante 30 min num banho de água bem oxigenada a 25 ° C no escuro. Durante o período de 30 min, o investigador pode preparar o corante alíquota rico em mitocôndria em DMSO que se adiciona à água durante o Passo 2 (Figura 1C). O período de incubação no Passo 2 permite a absorção do corante rico em mitocôndria da água para as células ricas em mitocôndria (isto é, ICs). O peixe pode então submeter ao procedimento completo bilateral desnervação ou um procedimento simulado em que o peixe é anestesiado eo opercula manipulado, mas os nervos permanecem intactos. O criado em Passo 3 representa uma câmara de recuperação fornecida com água corrente durante um peixe que tem either sofrido denervação bilateral completo ou um procedimento de &quot;farsa&quot;. Após o período de recuperação, o peixe foi sacrificado e as brânquias foram excisadas e fixadas para imuno-histoquímica. A distribuição global de inervação e os componentes no filamento de guelra de um peixe que tinham sido submetidos a um procedimento de &quot;sham&quot; está representado na Figura 2. Os CIs estão presentes no epitélio filamentosa, bem como na base das regiões interlamelares. A Figura 2A mostra ICs pré-existentes marcadas com corante rico em mitocôndrias (ou seja, esses ICs existia antes dos procedimentos desnervação / sham foram realizados). A figura 2B mostra fibras nervosas que inervam os ICs pré-existentes e recém-formados (identificado por NKA immunoreactivity) do filamentosa e epitélios lamelar. Por último, a fusão das duas imagens (Figura 2C) revela claramente os ICs pré-existentes (coloração amarela) e os novos ICs (aparecem em verde).A Figura 2D é um gráfico representativo do IC para quantificação do filamento representados na Figura 2A-C. Nesta filamento específico, parece haver um maior número de ICs recém proliferaram por mm2 de CIs pré-existente (N = 1). Para remover a fonte da inervação extrínseca branquial, os nervos cranianos IX e X (inervação extrínseca) foram cortadas. A Figura 3A mostra a região dorsal da cavidade do opérculo depois os filamentos branquiais e os epitélios que cobrem os nervos foram removidos para expor o IX e X nervos cranianos (indicadas com algarismos romanos), que se estendem a partir de dois grandes troncos nervosos para inervar todos os quatro arcos (Figura 3A); os arcos de emalhar são numeradas de 1 a 4. A Figura 3B-E ilustram denervação seletiva do primeiro arco branquial. O primeiro arco branquial é inervado por tanto os nervos cranianos IX e X (Figura 3B), que podem ser removidos sem afectar o resto da inervação para of os arcos de emalhar (Figura 3C-E). Cheio resultados denervação bilaterais em perda gradual da inervação extrínseca aos filamentos de emalhar (Figuras 4A-C). Peixes de controlo apresentam um feixe de nervos óbvio que mede o comprimento do filamento (Figura 4A). Desnervação bilateral completa resultou em alguma perda da inervação extrínseca após 2 dias de recuperação (Figura 4B). Além disso desaparecimento da inervação extrínseca foi observada após 5 dias de recuperação de desnervação (Figura 4C). Qualquer inervação restante para CIs após 5 dias de recuperação foi provavelmente derivada a partir de nervos com corpos celulares dentro do filamento branquial (inervação intrínseca; Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Experimental estabelecido para o procedimento de desnervação e seqüência de passos utilizados notempo técnica de coloração diferencial. (A) a tabela Cirurgia configurado para procedimento de desnervação mostrando os tanques de anestésicos e recuperação. (B) Exemplo da colocação de um anestesiados, peixes entubado. (C) etapas-chave do momento técnica de coloração diferencial. No Passo 1, o peixe é colocado de uma forma controlada, banho de água arejada estático temperatura durante 30 min. O corante rico em mitocôndria é adicionado na etapa 2 até uma concentração final de 0,1 uM e o peixe é permitido tomar banho na solução durante um mínimo de 4 h. O fluxo de água é reiniciado na Etapa 3, altura em que o peixe é submetido a qualquer um denervação bilateral completa do branquial ou uma cirurgia sham. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg" width="600"<html> /&gt; Figura 2. Micrografias de luz representativas do tempo técnica de coloração diferencial num peixe (aclimatados a 25 ° C) de 2 dias após a desnervação bilateral completa. (A) A distribuição de ionocytes pré-existentes (ICs; setas). Em um único filamento branquial é revelada por corante coloração rico em mitocôndrias (B) A distribuição dos ICs (novas e pré-existentes) e branquial nervos (setas tracejadas) é revelada por coloração com os anticorpos α-zn-5 e 12, respectivamente. As setas indicam ICs (C) A sobreposição de (A) e (B) distingue ICs pré-existentes. (Coloração amarela; indicadas por setas) de ICs recém proliferaram (aparecem em verde; indicadas pelas setas). Inserção em (C) é uma ampliação de uma pré-existente ionocyte inervados. (D) representativas gráfico de IC quantificação para o filamento mostrado nos painéis (AC). N bar = 1. Escala no painel (C) é de 50 mm e se aplica a todos os painéis.&quot;target =&quot; _ /ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Imagens representativas que descrevem vários estágios da inervação branquial. View (A) Dorsal da cavidade bucal, mostrando os nervos cranianos IX e X inervam todos os 4 Gill arcos. Arcos Gill são numerados 1-4. Os filamentos de emalhar e do tecido que cobre os nervos foram removidos para melhor visualizar a inervação. (B) O 1º e 2 arcos nd de emalhar são separados para revelar o órgão sensorial e os ramos dos nervos cranianos IX e X que inervam o 1º de emalhar arco. (CE) Sequência de imagens que mostram a denervação seletiva do 1º arco branquial, cortando os ramos dos nervos cranianos IX e X. Para uma re esquemáticaapresentação de emalhar inervação de peixes teleósteos, consulte a Figura 1 em Milsom et al 26 As linhas brancas nas imagens são reflexo da água das luzes de microscópio.; eles não definir qualquer estrutura morfológica. Barra de escala no painel (E) é de 4 mm e aplica-se a todos os painéis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. micrografias clara que descreve a distribuição e inervação do ionocytes em um único filamento do 1º arco branquial de um peixe dourado aclimatados a 25 ° C. Ionocytes (indicado pela seta cabeças) foram coradas com o α-5 anticorpo e os nervos (indicado bsetas y) foram coradas com o anticorpo zn-12. (A) Gill filamento de um peixe de controlo que mostra um feixe nervoso central, presumivelmente proveniente dos nervos IX e X (inervação extrínseca) com extensiva ramificação lamelar. Alguns dos ionocytes indicados também são inervados (insert). (B) Um filamento branquial dois dias após a denervação bilateral completa. Houve uma redução do feixe nervoso central, enquanto a inervação lamelar apareceu em grande parte intactos. (C) Um filamento branquial 5 dias após a denervação bilateral completa demonstrando que a inervação extrínseca foi praticamente inexistente. A análise qualitativa sugere que a denervação bilateral completa provoca a degradação da inervação extrínseca Gill, mantendo nervos com corpos celulares dentro do filamento branquial (inervação intrínseca) a criação de uma rede de nervos através do filamento e para as lamelas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor,</a>clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

A técnica de coloração diferencial Tempo Juntamente com completa Bilateral Gill denervação para Estudar Ionocytes no Peixe

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

a-time-differential-staining-technique-coupled-with-full-bilateral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K visualizações.  University of Ottawa. This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation. 

Vídeo: A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Biologia do Desenvolvimento

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness following surgical intervention are key experimental strengths. Mica plates were the first barriers used to prevent chick limb bud initiation1. Protocols that use aluminum foil as an impermeable barrier to wing bud or leg bud induction and or initiation are described. We combine this technique with bead placement lateral to the barrier to exogenously supply candidate endogenous factors that have been blocked by the barrier. The results are analyzed using in situ hybridization of subsequent gene expression. Our main focus is on the role of retinoic acid signaling in the induction and later initiation of the chick embryo fore and hindlimb. We use BMS 493 (an inverse agonist of retinoic acid receptors (RAR)) soaked beads implanted in the lateral plate mesoderm (LPM) to mimic the effect of a barrier placed between the somites (a source of retinoic acid (RA)) and the LPM from which limb buds grow. Modified versions of these protocols could also be used to address other questions on the origin and timing of inductive cues. Provided the region of the chick embryo is accessible at the relevant developmental stage, a barrier could be placed between the two tissues and consequent changes in development studied. Examples may be found in the developing brain, axis extension and in organ development, such as liver or kidney induction.

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

A técnica de coloração diferencial Tempo Juntamente com completa Bilateral Gill denervação para Estudar Ionocytes no Peixe

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento

Aplicação de barreiras impermeáveis combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

Tratamento de drogas e

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

A técnica de coloração diferencial Tempo Juntamente com completa Bilateral Gill denervação para Estudar Ionocytes no Peixe

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Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento

Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

Tratamento de drogas e

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Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Cultura de organotypic método para estudar o desenvolvimento de tecidos embrionários de galinha

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Um método de co-cultura para estudar o crescimento da neurita em resposta aos sinais de paracrina da polpa dentária

Aplicação de barreiras impermeáveis combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho