We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.

Her iki protokol Hayvan Bakımı (CCAC) Kanada Konseyi kurallarına uyduğu ve Ottawa Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi (Protokol BL-226) onayı ile yapılmıştır. 1. Zaman Diferansiyel Boyama Tekniği: Mitokondri zengin Boya Banyosu <ol><li> Dimetil sülfoksit (% 100 DMSO) içinde 94.0 ul 50 ug çözülmesiyle, 1 mM MitoTracker Kırmızı stok çözelti hazırlayın. Kullanılmadığı zaman -20 ° C&#39;de karanlıkta stok solüsyonu tutun. Donma / çözülme döngüleri kaçının. </li><li> 600 ml&#39;lik bir maksimum hacme sahip - (6 kutu 3) koyu kutuları hazırlayın. Sistem 400 ml su (su normalde tutulan balık) ile kutuları doldurun ve O 2 kaynağı sağlamak için her kutuda bir hava taşı yerleştirin. Goldfish elde (30-40 g) ve 400 ml su ve hava taşı ile kutulara koyun. 30 dakika sonra, 0.1 uM ve 0.01% DMSO nihai konsantrasyonlar elde etmek için uygun bir mitokondri zengin boya ekleyin. 4 saat için balık batırınr. <ol><li> Bu kontrol balık (yani, hiçbir denervasyon) ise, kutulara su akışı açmak boya dışarı floş ve protokolde ayrılan süre için balık kurtarmak için izin verir. 5 gün - Balık genellikle 3 kurtarıldı. </li></ol></li><li> Iyileşme süresinden sonra Bölüm 3 geçin: Zaman Diferansiyel Boyama Tekniği: İmünohistokimya. Bu balıklar sinirsiz için ise Bölüm 2 geçin: Tam İkili denervasyon Prosedürü. </li></ol> 2. Tam İkili denervasyon Prosedürü <ol><li> (Kavisli) Öğrenci Vannas yaylı makas, standart model forseps-düz 1 çift 1 çift elde, standart model forseps kavisli 1 çift, No. 5 forseps 2 çift, doku retraktörleri 1 çift, küçük pamuk topları (1 - 2 mm çapında), ve pamuklu (Q İpuçları veya eşdeğeri). </li><li> Anestezik su banyosu hazırlayın. İlk olarak, 100 ml lik bir son hacme kadar benzokain, 10 g çözülmesi% 99 etanol içinde bir stok çözeltisi hazırlanır. , Anestezi su banyosu hazırlamak gerekli sıcaklıkta gazlı sistem su 30 L içine stok benzocaine solüsyonu 15 ml eritmek için. Bir hava pompası veya su deposu bir merkezi hava hattına bağlanmış bir hava taşı yerleştirerek su havalandırır. <ol><li> Anestezik su banyosunda (Şekil 1A) içine balık yerleştirin. </li><li> Nefes bittikten sonra, bir ameliyat masaya balık yerleştirin ve Şekil 1B gösterildiği gibi entübe. Gazlı anestezik solüsyonu ile solungaçları sulamak için kendi ağız boşluğuna bir tüp takarak bunu yapın. Solungaçlar sulama balık denervasyon işlemi sırasında O 2 ve anestezi yeterli bir miktarı ile birlikte temin eder. Baş hafifçe aşağı doğru eğimli şekilde balık yerleştirin. Bu dördüncü solungaç kemer arkasındaki alanda daha iyi erişim sağlar. </li></ol></li><li> Yavaşça düz standart desen forseps ile kapakçık asansörve operculum&#39;un ve kafa içi arasındaki doku Ekartörleri yerleştirin. Dikkatle kafayla uzaklaştırdı kapakçık tutmak ve maruz solungaçları tutmak için doku Ekartörleri açın. </li><li> Anestezi çözüm Bu işlem sırasında solungaçları sulama emin olun. Retraktör dört solungaç kemer erişim sağlar baş yanında kolları dinlendirin. </li><li> Kafasına dördüncü solungaç kemeri takılması ligaman gerginliği oluşturmak için bunları açmak yavaşça dördüncü solungaç kemer ve başın arkasında arasındaki kavisli standart model forseps yerleştirin ve. Operkuler boşluğuna solungaç kemer dorsal ucunu bağlayan epitel delerek - (3 mm 2) sayılı bir çift ile 5 forseps küçük bir açıklık oluşturmak. Büyük bir kan damarı hasar riski olduğundan çok derin gitmek için dikkatli olun. </li><li> 5 forseps yavaş ve dikkatli bir şekilde sayılı ile yapılan küçük bir pamuk ile IX (glossofarengeal) ve X (vagus) sinirleri açığa kesi genişletin. ÜcretsizYine kan damarları zarar vermemeye özen, No. 5 forseps kullanarak herhangi bir bağ dokusu sinirler. NOT: akvaryum balığı solungaç IX ve X sinirler dördüncü solungaç kemer arkasında derin dinlenme ve solungaç kemerler besleyen ana kan damarlarının yakınlık vardır. </li><li> Sinirler kullanımını tespit edildikten sonra kavisli standart şekil forseps ile açık kesi tutarak kavisli yay makas dikkatle sinirleri kesmek için. Sinirleri kesilmesinin ardından, yavaşça kavisli bir forseps geri. 48 saat - epitel çok ince ve kesi genellikle 24 içinde kendi kapatması nedeniyle dikişlerle kesi kapatmak için gerek yoktur. Doku ekartörünü çıkarın. </li><li> Başın diğer tarafta aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Anestezi balık kurtarmak taze havalandırılmış su anestezik gelen solungaçları sulanması geçin. Bir kez operkuler hareketler en az 24 saat iyileşmek için deneysel tanklara balık taşımak devam var. </li><li&gt; balık ayrı bir set bir &quot;sahte&quot; işlemini gerçekleştirin. &quot;Sahte&quot; prosedürü sinirleri kesmeden dördüncü solungaç kemer arkasında epitel piercing içerir. </li></ol> 3. Saat Diferansiyel Boyama Tekniği: İmmünhistokimya <ol><li> (, PBS içinde 96 ml 4 gr PFA PBS) İlk olarak, 1x Fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlanması. PFA oda sıcaklığında PBS içinde kolaylıkla çözülmez. Bir su banyosu içinde ısı çözeltisi PFA eritin. Bir çeker ocak içinde, bu gerçekleştirin. PFA çözelti içinde bir kez kullanmadan önce soğumaya bırakın. 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de depolayın. </li><li> 8 sintilasyon şişelerine (solungaç kemeri başına 1 tüp) toplam bir parıldama ampulüne konulması ile% 4 PFA 4 ml - solungaç doku balık ötenazi ve ekstre etmeden önce, 3 yerleştirin. Buna ek olarak, küçük 1x PBS ile tekne tartın ve dolgu almak. Bu kesilmiş sonra doku yıkamak için kullanılır. Buz üzerinde tüm çözümleri tutun. </li><li> Canlı mitokondri zengin boya maruz kalınması sonrasındaDeney benzokain aşırı dozda bir su banyosunda koyarak goldfish euthanize, tamamladı. </li><li> Brankiyal solungaç sepeti her ucunu sever bir baş tarafında ve kavisli makas üzerinde kapakçık kaldırmak için künt forseps kullanın. Dikkatle künt forseps kullanarak diken tarafından solungaçları pick up ve operkuler boşluğunun onları kaldırın. Hemen aşırı Benzocaine ve kan kaldırmak için PBS 1x buz soğuk solungaçları yıkayın. </li><li> % 4 PFA ile doldurulmuş ayrı şişelerde kesilmiş solungaçları (her solungaç kemeri için bir şişe) yerleştirilir ve 4 ° C&#39;de O / N düzeltin. </li><li> Tespit edildikten sonra, 1X PBS içinde fazla PFA yıkama ve 4 ° C&#39;de, oda sıcaklığında ya da O / N oranında 6 saat süre ile bir çalkalama ile% 1 Triton-X 1.5 ml ile doldurulmuş bir 2 mi mermi tüpü içinde doku yerleştirin. Bu adım doku permeabilizes. Bütün solungaç 2 ml tüp içine yerleştirmek için çok büyük ise, filamentler zarar vermemeye tüp alarak dikkat sığacak kadar küçük bölümler halinde doku kesti. <ol><li> Mi birincil antikor dilüeXing 1x PBS 992 ul her bir birincil antikor (8 ul toplam) stok çözeltisi 4 ul. NKA (NKA-zengin hücreler etiketler) emin olun ve zn-12 (etiketler nöronlar) birincil antikorlar aynı konakta gündeme gelmiş. Araştırmacılar farklı bir konak türlerinde kaldırdı birincil ve ikincil antikorlar kullanmak zorunda olan aynı zamanda belirli IC alt tipi tanımlamak için karar verirseniz, bu önemlidir. </li><li> Triton-X çözüm çıkarın ve doku eklemek için 1 yıkama olmadan: Bir NKA monoklonal antikor 250 seyreltme (1x PBS içinde sulandırmak) (α-5) NKA zengin hücreler ve Zebra balığı spesifik nöronal antikor tespit etmek için (zn-12) Sinir lifleri (birincil antikor) tespit etmek ve 4 ° C sıcaklıkta, oda sıcaklığında ya da O / N oranında 6 saat süre ile bir çalkalama ile inkübe edilmesi. </li></ol></li><li> 1x PBS kullanılarak 3 dakika her biri için birincil antikor 3 kez yıkayın. Bunu yapmak için, bir pipet kullanarak dışarı aspirasyon yoluyla tüpten birincil antikor çözüm kaldırmak. </li><li> Bir ikincil antikor hazırlayın1: 1x PBS 995 ul içine stok ikincil antikor 5 ul karıştırarak 200 seyreltme. Ikincil antikoru (Alexa Fluor 488) uygulanır ve bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında ya da O / N oranında 6 saat süre ile inkübe edilir. NOT: MitoTracker Kırmızı bir ~ 594 nm dalga boyunda heyecanlı ve kırmızı floresan olacaktır. Bir ~ 488 nm dalga boyunda heyecan ve yeşil floresant olan bir ikinci antikor, NKA etiket ve zn-12 primer antikor için kullanılabilir olması gerekir. </li><li> (Adım 3.7&#39;de tarif edildiği gibi), 5 dakika her biri için dokuya 3 kez yıkanarak fazla ikincil antikoru çıkarın. </li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Yıkandıktan sonra, hücreler ve sinir liflerinin konfokal görüntüleme monte bütün bir içbükey slayt üzerinde doku monte edin. Doku monte etmek için, ilk olarak düz bir mikroskop lamı üzerine 1x PBS bir damla (200 ul) yerleştirin. Bu dokunun kurutulması etmez sağlar. </li><li> Kavisli mikro-makas ile solungaç hemibranchs ayırın. 1x PBS bir damla ve bir konkav slayt içine montaj medya bir damla yerleştirin. </li><li> Yukarı bakacak şekilde filamanın ön kenarı ile içbükey slayt ayrılmış hemibranchs yerleştirin ve bir kapak kayma ile kaplayın. Dolaşırım ve doku yerinden gelen kapak kayma önlemek için tırnak cilası ile kapak kayma kenarlarını hafifçe sürün. Görüntüleme önce 15 dakika - Doku 10 içbükey slayt altına yerleşmek için izin verin. </li><li> Her solungaç kemer için, solungaç kemer başına altı görüntüler üreten, görüntüleme için rastgele altı solungaç filamentleri seçin. 3 mikron optik dilim - 1 alarak görüntüye doku geleneksel konfokal mikroskopi kullanın. NOT: Herhangi bir önceden varolan hücrelerin MitoTracker Kırmızı ile işaretlenmiş olacak ve NKA için olumlu sadece sarı görünür. Sadece kırmızı görünen hücreler NKA içermeyen önceden varolan IC vardır. Herhangi bir yeni çoğaldı hücre yalnızca NKA için olumlu olacak ve sadece yeşil görünür. Sinir lifleri de yeşil görünecektir. </li></ol> Ionocyte Niceleme 5. Görüntü Analizi <ol><li> EAC içingörüntülü olmuştur h solungaç Filament, Z yığının bölümleri ile kaydırma ve mevcut ve yeni ayırt olsun veya olmasın, önceden var olan ve / veya innerve katmanlı ve filamental IC sayarak IC&#39;leri ve ilgili sinir donanımını ölçmek . </li><li> Filamanın (mm 2) iplik başına veya alan başına IC&#39;leri sayısal olmalıdır. IC ölçüldü hangi filamanın alanı kapsayan filamanın lamellerini anahat görüntüler elde için kullanılan yazılım ile ilişkili çizim araçlarını kullanarak yapın. Çoğu konfokal görüntüleme yazılım programları resmin üzerine özetlenen bölgenin alanını hesaplamak için seçeneğiniz vardır. Eğer bölgeyi kazanmak için bunu yapmak için izin verir görüntüleme yazılımı seçeneği kullanın. </li><li> (Mm 2 başına, örneğin) birim alan başına IC bir ölçü elde etmek için yazılım tarafından hesaplanan alana göre sayılan IC bölün. </li></ol>

<ol>
	<li>Katoh, F., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+transformation+and+long-term+replacement+of+branchial+chloride+cells+in+killifish+transferred+from+seawater+to+freshwater,+revealed+by+morphofunctional+observations+and+a+newly+established+'time-differential+double+fluorescent+staining'+technique.">Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established 'time-differential double fluorescent staining' technique.</a> J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).</li><li>Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+branchial+chloride+cells+and+gas+transfer+in+freshwater+fish.">Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).</li><li>Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+alters+the+respiratory+surface+area+of+crucian+carp+Carassius+carassius+and+goldfish+Carassius+auratus.">Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus.</a> J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).</li><li>Mitrovic, D., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+thermally+induced+gill+remodeling+on+ionocyte+distribution+and+branchial+chloride+fluxes+in+goldfish+(Carassius+auratus).">The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus).</a> J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).</li><li>Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoxia-induced+gill+remodelling+on+the+innervation+and+distribution+of+ionocytes+in+the+gill+of+goldfish,+Carassius+auratus.">Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus.</a> J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).</li><li>Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+soft-water+acclimation+on+gill+structure+in+the+rainbow+trout+Oncorhynchus+mykiss.">The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss.</a> Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).</li><li>Jonz, M. G., Nurse, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+mitochondria-rich+cells+and+associated+innervation+in+adult+and+developing+zebrafish.">Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).</li><li>Laurent, P., Hebibi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gill+morphometry+and+fish+osmoregulation.">Gill morphometry and fish osmoregulation.</a> Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).</li><li>Perry, S. F., Laurent, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptational+responses+of+rainbow+trout+to+lowered+external+NaCL+concentration:+contribution+of+the+branchial+chloride+cell.">Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell.</a> J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).</li><li>Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+fish+gill:+dominant+site+of+gas+exchange,+osmoregulation,+acid-base+regulation,+and+excretion+of+nitrogenous+waste.">The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste.</a> Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).</li><li>Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+fish+gills:+recent+progress+in+the+cellular+and+molecular+mechanisms.">Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Active+Uptake+of+Ions+into+Cells+and+Organisms.">The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).</li><li>Nilsson, G. E., Randall, D. J., Hoar, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+and+pharmacology+of+the+gills.">Innervation and pharmacology of the gills.</a> Fish Physiology. , 185-272 (1984).</li><li>Sundin, L., Nilsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branchial+innervation.">Branchial innervation.</a> J. Exp. Zool. 293 (3), 232-248 (2002).</li><li>Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+ionocytes+in+the+freshwater+fish+gill).">Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill).</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).</li><li>Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+Na+/K+-ATPase+in+the+gill+epithelium+of+rainbow+trout,+Oncorhynchus+mykiss.">Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss.</a> Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).</li><li>Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branchial+chloride+cell+proliferation+in+the+rainbow+trout,+Onchorhynchus+mykiss:+implications+for+gas+transfer.">Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer.</a> Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).</li><li>Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+gill+remodeling+on+transepithelial+sodium+fluxes+and+the+distribution+of+presumptive+sodium-transporting+ionocytes+in+goldfish+(Carassius+auratus).">The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus).</a> J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).</li><li>Chou, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypothermia+on+gene+expression+in+zebrafish+gills:+upregulation+in+differentiation+and+function+of+ionocytes+as+compensatory+responses.">Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses.</a> J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).</li><li>Kaneko, T., Katoh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+chloride+cells+in+killifish+Fundulus+heteroclitus,+a+euryhaline+teleost+with+seawater+preference.">Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference.</a> Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).</li><li>Ouattara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+gill+ionocyte+morphology+and+function+following+transfer+from+fresh+to+hypersaline+waters+in+the+tilapia+Sarotherodon+melanotheron.">Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron.</a> Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).</li><li>Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+branchial+chloride+cell+proliferation+on+respiratory+function+in+the+rainbow+trout,+Oncorhynchusmykiss.">The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss.</a> J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).</li><li>Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+gill+innervation+in+two+teleosts,+the+perch+and+the+trout.">Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout.</a> Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).</li><li>Jonz, M. G., Nurse, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+on+gill+innervation:+insights+from+a+model+vertebrate.">New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate.</a> J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).</li><li>Jonz, M. G., Zaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+control+of+the+gills.">Nervous control of the gills.</a> Acta Histochem. 111 (3), 207-216 (2009).</li><li>Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrabranchial+chemoreceptors+involved+in+respiratory+reflexes+in+the+neotropical+fish,+Colossoma+macropomum+(the+tambaqui).">Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui).</a> J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).</li><li>Hwang, P., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+fish+ion+regulation+and+mitochondrion-rich+cells.">New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> Zaman diferansiyel boyama tekniği iyon alımı dinamik düzenleme anlamak ve solungaç epitel IC zamansal yeniden dağılımını incelemek için yararlı bir araç olabilir. Basit bir prosedür olmasına rağmen, zaman diferansiyel boyama tekniğinin başarısı için önemlidir kilit noktaları vardır. goldfish protokolünde ayrılan zaman için mitokondri zengin boya maruz gerekir. Daha kısa maruz mitokondri zengin hücreler (yani, ionocytes) ile boyanın zayıf emme ile sonuçlanacaktır. Tespit sırasında, solungaç dokusu hızla eksize edilmeli ve fotoğraf beyazlatma önlemek için karanlıkta tuttu. Doku tespitin 2 hafta içinde görüntüleme için işlenmiş olması gerekir. İkili sinir kesit işlemi sırasında balık iyi anestezi olduğundan emin; sinirler ve kan damarları açıkça belirlenmiştir; Bir kurtarma tankına taşınmadan önce ve balık dolu operkuler işlevini sürdürür. &quot;&gt; FW ortamı. Pasif iyon kayıpları ve ozmotik su kazancı 14 dengeleme ikili mücadeleden ile balık sunan pasif iyon kayıplarının dengelenmesi filamental ve lameller epitel onlar lokalize olan IC genelinde tuz aktif alımı yoluyla gerçekleşir dış çevre 2,4,8,9,16 ile doğrudan temas. Ancak, solungaç üzerindeki IC yeri statik değildir. Son üç yılda bir dizi çalışma bu birkaç FW balık türleri göstermiştir, karşı karşıya Bir iyonik ve / veya ısı meydan, ince tabakanın 1,2,4,5,17-21 daha uzak bölgelere lamelinin filaman veya bazdan brankiyal ICs dağıtmak. Bu tür bir yeniden dağıtım lamellerinin kalınlığı artırabilen Gaz transferi bozabilir (O 2, CO 2) 22. Araştırmacılar bu yazıda anlatılan zaman diferansiyel boyama tekniği kullandık solungaç epitel boyunca tehcir ve emergenc izlemek içinBu farklı deneysel koşullar (Şekil 1C) 1,4,5 altında solungaç epitel yeni IC e. solungaçları ve muhtemelen brankial IC, IX ve X, kranial sinirler 7,23-25 ​​tarafından innerve edilir. Bu sinirler, sırasıyla, ve solungaç gelen efferent ve afferent girdiler hem de taşırlar. Onlar 4. solungaç kemer arkasında ağız boşluğuna dorsal tarafında yer almaktadır. sinirler ve ikili denervasyon işlemi yapılabilir hangi ile kolaylığı erişilebilirlik türe özeldir. Sinir doku ince bir tabaka altında 4. solungaç kemeri arkasında, tek bir düzlem üzerinde uzanmamaktadır için alabalık, örneğin, kafa sivri ve düzleştirilmiş anatomi sağlar. Bu sinirler görünür ve denervasyon yordamı gerçekleştirmek için araştırmacı kolayca erişilebilir hale getirir. Buna karşılık, akvaryum balığı kısa burun ve yuvarlak kafa var. Japon balıklarının IX ve X kranial sinirler dorsal si derinliklerine yalanFarklı uçakları işgal 4. solungaç kemer sonra kavite de. Bu yönelim sinirlerin erişim kolaylığı sınırlar ve uygun sinirleri belirlemek ve sever bir daha dikkatli bir yaklaşım gerektirir. denervasyon prosedürünün amacı, sırasıyla, ve solungaç duyu afferent ve efferent giriş kaldırmaktır. Solungaç kemeri denervasyonu da radyoizotopların iyon akışı deneyleri (örneğin, 22 Na) ile akuple edilebilir. Bu teknikler solungaç epitel boyunca iyon hareketi sinir giriş katkısını incelemek için tandem kullanılabilir. Denervasyon prosedürü başka sınırlama sinir kesilmesinin böylece zaman, duyusal ve motor nöronlar arasında ayrım bu innervasyon iki tip kaldırılır ediliyor mümkündür paket yetersizlik. Herhangi bir motor nöronları tomar balık solungaç ve operkuler hareketini etkileyebilir. Solungaç denervasyon deneyler yaparken Böylece de sonra havalandırmayı izlemek için önemlidirBalık gazı ve iyon değişimi hem de yeterli solungaç hareketi var olduğundan emin olmak için prosedür kurtarıldı. karanlık döngüsü ve beslenen ticari gıda pelet: Bu yazının kullanım yetişkin hayvanlarda açıklanan protokoller 12:12 ışık tuttu. Bu yöntemler, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. İlk olarak, mitokondri zengin boya maruz kaldıktan sonra iyileşme süresi, araştırmacının protokol (örneğin, 1, 3, 5, veya 14 gün) gereklerine göre ayarlanabilir. Laboratuvarda mitokondri zengin boya maruz kaldıktan sonra iyileşme uzun süre 14 gün 4,5 olmuştur. Iyileşme 14 gün sonra mitokondri zengin boyanın floresan yoğunluğunda önemli bir azalma oldu. İkincisi, α-5 birincil antikor kullanımı sadece NKA zengin hücrelerin belirlenmesi ve brankial IC farklı alt tipleri arasında ayrım yapmaz sınırlıdır. IC çoğunluğu her iki mitochondr olduğunu Neyse, akvaryum balığı o kurulduiyon zengin (Mitotracker etiket) ve tüm balık türlerinin 4,27 durumda olmayabilir hücreler (α-5 etiket) NKA zengin. Gelecek deneyler kanalları, pompa ve eşanjör (örneğin, NHE, H + pompa) çeşitli karşı özellikle yönlendirilmiş antikorlar kullanarak belirli IC alt tiplerinin zamansal yeniden dağıtılması aşağıdaki odaklanabilirsiniz. Önceki çalışmalar bulduğu mitokondri zengin boya sergi NKA immünoreaktivitesinde 4 ile boyanmış ionocytes çoğunluğu. IC İnnervasyonu zebra balığı türetilmiş nörona özgü antijen (Zn-12) karşı birincil antikor kullanılarak tespit edilebilir. Bu çalışmada,-5 α ve zn-12 birincil antikorlar için aynı ikincil antikoru (Alexa Fluor 488) ile tespit edilmiştir. Her iki birincil antikorlar bir fare konakta gündeme getirilen ve NKA zengin hücreler ve nöronlar aynı renk floresan bile morfolojik ayırt edilebilir olması ile aşılır Bu sınırlama nedeniyle. Sıralı boyamaFarklı ikincil antikorlarla (Alexa Fluor 488 ile, örneğin, ilk α-5 Alexa Fluor 594 ile-12 zn) da aynı renk floresanlama iki belirteçleri olan sorununu ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Son olarak, tam iki taraflı sinir kesit protokole özgü solungaç kemerler sinirleri hedef modifiye edilebilir. Örneğin, seçici sinir kesit hafifçe solungaç sepeti (Şekil 2B-E) dorsal sonunda birinci solungaç kemer giden sinirleri açığa birinci ve ikinci solungaç kemeri ayırarak birinci solungaç kemer yapılabilir. Zaman diferansiyel tekniği aynı zamanda geliştirmek ve solungaç deriden iyon taşıma geçişler gibi larva Zebra balığı balık ionocytes dağılımını incelemek için uygulanabilir.

IC balık iyonik düzenleme için işlevsel birim ve solungaç filamentlerin epitel yüzeylerde bulunan ve 4,6-8,10 lamelleri. Alt tipler benzersiz özelliklere sahip olduğu tarif edilmesine rağmen, IC birçok mitokondri yüksek yoğunluklu (böylece aynı zamanda mitokondri zengin hücreler olarak da bilinir) ve / veya enzimin bolluğu ile karakterize edilen, Na + / K + ATPaz (NKA). Tipik olarak, bu IC ev iyon düzenleme (örneğin, Na + / H + değiştirici, Na / Cl - ko-transporter H + pompa) &#39;de yer alan diğer pompalar, iyon kanalları ve değiştiricilerin çeşitli 2,10,11. bir telafi mekanizması olarak IC dağıtılması ve yayılması özellikle iyonik stres (örneğin, iyon-fakir suya maruz kalma) 4,8,9 sırasında iyon dengesini sağlamaya yönelik merkezi. Bu çalışma, bir zaman diferansiyel boyama Techni açıklarque 1 balık solungaçları yeni çoğaldı ionocytes (IC) tanımlamak için. Bu teknik, solungaç kemerler tam bir ikili denervasyon ile birleştirilmiştir. Balığı (Carassius auratus), bu çalışmalarda kullanılan türler, yapısal olarak kendi solungaçları 2 yeni model için önemli bir özelliğine sahiptir, çünkü solungaç epitel hücrelerin çoğalmasını çalışma için uygundur. Soğuk su (&lt;15 ° C) ya da, oksijen azalması, sırasıyla 3 ortama alıştırılır - Gill yeniden modelleme (30 ° C, normal olarak 15 de muhafaza edilmiş) balık bir interlameller hücre kitlesinin büyümesine ve geri çekilmesi (ILCM) belirtir. Goldfish zamanı diferansiyel boyama tekniği kullanılarak Önceki çalışmalar 4,5 biçimlenme solungaç bağlamında solungaç üzerindeki IC dağıtılması, innervasyon ve çoğalması üzerine odaklanmıştır. Katoh ve Kaneko 1 killifish dönüşümü ve brankial IC değiştirilmesini incelemek için bu yeni tekniği geliştirdi (Fundulus heteroclitus) transfeTemiz su (FW) deniz suyu (SW) ile ilgili rred. Bu çalışmada, odak noktası 25 ° C alıştırıldı akvaryum balığı IC çoğalması ve innervasyonunu üzerindedir. Gill yeniden bağlamında, bu gösterilen süre farkı boyama tekniği kullanılarak, akvaryum balığı hipoksik maruz kalma ve takip eden normoksik geri kazanımı sırasında ICs sabit sayıda muhafaza, bununla birlikte, inerve hücrelerin yüzdesi normoksik iyileşme dönemi 5 boyunca azalmıştır. Bu nöral kontrol altında 12 fazla 70 yıl önce balık iyonik alım mekanizmaları olduğu ileri sürülmüştür. teleost solungaç da &quot;brankiyal sinirler&quot; 13,14 olarak anılacaktır yüz (VII), dil ve yutak (IX) ve vagus (X) sinirler tarafından innerve edilir. Zebra balığı üzerine Jonz ve Hemşire (2003) tarafından yürütülen çalışmalar (Danio rerio) solungaç innervasyon innervasyon kökeni dışsal (hücre gövdesi (sinir lifi hücre gövdesi solungaç için dışsal olan) yanı sıra içsel olduğunu gösterdisinir lifi) solungaç özgüdür. Aynı yazarlar da brankiyal IC dışsal 7 innerve olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada, tam iki taraflı solungaç denervasyon ile birleştiğinde zaman diferansiyel boyama tekniği akvaryum balığı olarak dışsal innervasyon eksik IC çoğalmasını araştırmak için kullanıldı. Narin cerrahi prosedürler kolaylaştırır ve ionocytes kolayca standart immunohistokimyasal teknikler kullanılarak tanımlanır - Tam ikili solungaç denervasyon kranial sinirler IX ve X. nispeten büyük boy (200 gr 30), çünkü bu iki yaklaşım akvaryum balığı uygulanabilir olan kesilmesinin anlamına gelir. Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, University Mevcut çalışmada, IC (ör MitoTracker Kırmızı) önemli bir mitokondri özel bir boya ya da Na + / K + -ATPaz (α-5 α-alt birimlerine karşı birincil antikor kullanılarak görselleştirilmiştir Iowa, Iowa City IA). Bu protokol, basit bir yöntemii sağlargörselleştirme ve balık solungaç üzerindeki IC yeniden dağıtılmasını ve çoğalmasını analiz d.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="736">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:235px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MitoTracker Red</td>
			<td style="width:235px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#945;-5 primary antibody</td>
			<td style="width:235px;">Develompental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:119px;">a5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">zn12 primary antibody</td>
			<td style="width:235px;">Develompental Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:119px;">zn12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alexa Fluor 488 (anti mouse)</td>
			<td style="width:235px;">Life Technologies</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzocaine</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>E1501</td>
			<td>4-Aminobenzoic acid ethyl ester, Ethyl 4-aminobenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td>straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11001-12</td>
			<td>curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dumont No. 5 forceps</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tissue retractor</td>
			<td style="width:235px;">Fine Science Tools</td>
			<td>17009-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X</td>
			<td style="width:235px;">Sigma Alrdich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:235px;">Vector Laboratories&#160;</td>
			<td>H-1200&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish

Brankiyal ionocytes (IC) balık iyonik düzenleme için işlevsel birimlerdir. Yetişkinlerde, onlar solungaç ve filamental ve katmanlı epitel bulunan nerede Na +, Cl gibi onlar ulaşım iyonları - iyon kanalları, pompa ve eşanjör çeşitli yoluyla ve Ca 2+. teleost solungaç dışsal glossofaringeal (IX) ve vagus (X) sinirler (VI) yüz tarafından innerve edilir. IX ve X sinirler de brankiyal IC innervasyon dışsal kaynağıdır. Burada, innervasyonu, çoğalmasını ve IC dağılımını incelemek için kullanılan iki teknik tarif edilmiştir: Bir zaman diferansiyel boyama tekniği ve tam ikili solungaç denervasyon tekniği. Kısaca, akvaryum balığı hayati mitokondri özel boya maruz (örn, MitoTracker Kırmızı) etiketler (kırmızı floresan) önceden varolan IC. Balık ya da 3 için eski hallerine gelmeye bırakılmıştır - 5 gün ya da hemen tam bir ikili solungaç denervasyon uygulandı. 3 Sonra - kurtarma 5 gün, gdertlerin hasat ve immünohistokimya için sabittir. Doku daha sonra, bir α-5 birincil antikor ile boyanmış olan (hedef hücreleri ihtiva eden + / K + ATPaz Na) Tüm (hem yeni hem de önceden var olan) IC yeşil etiket ikincil bir antikor ile birlikte kullanılabilir. Konfokal görüntüleme kullanarak, önceden varolan IC ve yeni ICS (bir canlı mitokondri özel boya ve α-5 hem de etiketli) sarı görünür (α-5 yalnızca etiketli) yeşil görünür olduğu gösterilmiştir. Tandem kullanılan iki teknik balık çevre sorunlarına maruz kaldığında solungaç filamanın üzerindeki IC innervasyonu, çoğalmasını ve dağıtım çalışma uygulanabilir.

Şekil 1 kurmak cerrahi tablosu (Şekil 1A) göstermektedir, ameliyat sırasında balığın yerleştirme (Şekil 1B) ve zaman diferansiyel boyama tekniği (Şekil 1C) için en önemli üç adım. Aşama 1 &#39;de, balık, karanlıkta 25 ° C&#39;de iyi havalandırılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca muhafaza edilir. 30 dakikalık bir süre boyunca, bir araştırmacı Aşama 2 (Şekil 1C) sırasında suya ilave edilir, DMSO içinde mitokondri zengin boya kısım hazırlayabilir. Adım 2 kuluçka dönemi mitokondri zengin hücreler (yani, IC) içine su mitokondri zengin boya alımı için izin verir. Balık sonra ya tam ikili denervasyon yordamı veya balık anestezi olduğu sahte prosedürü ve manipüle opercula tabi ama sinirler sağlam kalır. Adım 3 kurmak ei olan bir balık akan su ile sağlanan bir kurtarma odasını temsilther tam ikili denervasyon veya &quot;sahte&quot; prosedürü geçirmiş. Kurtarma döneminden sonra, balık ötenazi ve solungaçları kesilmiş ve immünohistokimya için tespit edildi. bir &quot;sahte&quot; prosedürü geçirmiş olan bir balık solungaç lifte IC genel dağılımı ve innervasyon Şekil 2&#39;de tasvir edilmiştir. IC interlameller bölgeleri. Şekil 2A, Şekil tabanında olarak filamental epitel bulunurlar Mitokondri zengin boya ile etiketlenmiş önceden varolan IC (denervasyon / sahte işlemleri yapıldı önce, yani bu IC var). Şekil 2B sinir lifleri önceden varolan ve yeni oluşan IC (NKA immünoreaktivitesinde tarafından tanımlanan) filamental ve innerve gösterir katmanlı epithelia. Son olarak, iki görüntü birleştirme (Şekil 2C) açıkça önceden varolan IC (sarı görünür) ve yeni IC (yeşil görünür) ortaya koymaktadır.Şekil 2D, Şekil 2A-C&#39;de gösterilen filament IC miktar temsil eden bir grafiktir. Bu özel filament üzerinde, önceden varolan IC mm&#39;den 2 başına yeni çoğaldı IC büyük bir sayı olduğu görülmektedir (N = 1). Dışsal brankial innervasyon kaynağını kaldırmak için, IX ve X, kranial sinirler (dışsal innervasyon) kesildi. Şekil 3A solungaç filamentleri sonra operkuler boşluğunun dorsal bölgesini gösterir ve sinirleri kapsayan epithelia IX ve X maruz çıkarıldı iki büyük sinir gövdelerine gelen yayılan (Roma rakamları ile gösterilir) kranial sinirler dört kemerli (Şekil 3A) innerve; solungaç kemerler ilk solungaç kemer seçici denervasyon göstermektedir 4. Şekil 3B-E ile 1 numaralı edilir. İlk solungaç kemer geri kalanı için innervasyon o etkilemeden kaldırılabilir hem IX ve X, kranial sinirler (Şekil 3B) tarafından innerve edilirsolungaç kemerli (Şekil 3C-E) f. Solungaç filamanlara dış innervasyon kademeli kaybı (Şekil 4A-C) Tam karşılıklı denervasyon ile sonuçlanır. Kontrol balık filamanın (Şekil 4A), uzunluğu boyunca devam eden bir belirgin sinir demeti sergiler. Tam karşılıklı denervasyon iyileşme 2 gün (Şekil 4B) sonra dış innervasyon bir kayıp ile sonuçlanmıştır. Dışsal innervasyon daha fazla kaybolma denervasyon (Şekil 4C) kurtarma 5 gün sonra kaydedildi. Kurtarma 5 gün muhtemelen solungaç filamanın içinde hücre organları ile sinir elde sonra IC Herhangi kalan innervasyon (içsel inervasyon; Şekil 4C). <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1. Deneysel kullanılan adımların denervasyon prosedürü ve dizi için ayarlanmışZaman diferansiyel boyama tekniği. Anestezi ve iyileşme tankları gösteren denervasyon prosedürü için kurulmuş (A) Cerrahi tablo. Bir anestezi, entübe balık yerleştirme (B) Örnek. Zaman diferansiyel boyama tekniğinde kullanılan (C) Anahtar adımlar. Aşama 1 &#39;de, balık, 30 dakika için bir ısı kontrol statik havalandırılmış su banyosu içine yerleştirilir. Mitokondri zengin boya 0.1 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde edilmesi için Adım 2&#39;de ilave edildi ve balık 4 saat en az çözelti içinde banyo bırakılır. Su akış Adım balık solungacında tam ikili denervasyon veya sahte ameliyat ya uğrar bu noktada 3 başlatılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg" width="600"<html> /&gt; Şekil 2 gün tam ikili denervasyon sonra (25 ° C alıştırıldı) bir akvaryum balığı zaman diferansiyel boyama tekniği temsil 2. Işık mikrografları. (A), önceden var olan ionocytes (IC; oklar) dağılımı. Tek solungaç lifte mitokondri zengin boya boyama ile ortaya (B) IC dağılımı (yeni ve önceden var olan) ve brankiyal sinirlerin (kesikli oklar) sırasıyla, α-5 ve Zn-12 antikorları ile lekeleme ile ortaya çıkar. oklar IC göstermektedir (C) (A) ve (B) üst üste önceden mevcut IC ayırır.; (; oklarla gösterilen yeşil görünür) yeni çoğaldı IC (sarı görünen ok uçları ile gösterilir). Olarak kaydedin (C) innerve önceden var olan ionocyte bir büyütme. (D), panel (AC) &#39;de gösterilen filament IC kantifikasyon Örnek grafik. Panelinde, N = 1 ölçek çizgisi (C), 50 mm ve tüm paneller için geçerlidir./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" width="700" /> Solungaç innervasyon çeşitli aşamalarını gösteren 3. Temsilcisi görüntüleri Şekil. IX ve X, kranial sinirler 4 solungaç kemeri innerve gösteren ağız boşluğuna (A) dorsal görünümü. Gill kemerler 1-4 numaralandırılır. solungaç filamentleri ve sinirler daha iyi innervasyon görselleştirmek için çıkarıldı kapsayan doku. (B) 1. ve 2. solungaç kemerler duyusal organı ortaya çıkarmak için ayrılır ve IX ve X, kranial sinirlerin dalları 1. solungaç innerve kemer. IX ve X, kranial sinirlerin dalları kesilmesinin 1. solungaç kemer seçici denervasyon gösteren görüntülerin (CE) Dizi. Şematik yeniden içinteleost balık solungaç innervasyonunu sunumu, Milsom vd Şekil 1&#39;e bakınız 26 görüntülerde beyaz çizgiler mikroskop ışıkları su yansıması vardır.; herhangi bir morfolojik yapısını tanımlamak gerekmez. Panelinde Ölçek çubuğu (E) 4 mm ve tüm paneller için geçerlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" width="700" /> 25 ° C Ionocytes (ok başları ile gösterilir) acclimated bir akvaryum balığı olan 1. solungaç kemer tek bir filamanın üzerinde ionocytes dağılımını ve innervasyonu gösteren Şekil 4. Işık mikrografları belirtilen α-5 antikoru ve sinirler (ile boyandı bY oklar). Zn-12 antikoru ile boyanmış muhtemelen geniş katmanlı dallanma ile IX ve X, sinirler (dıştan innervasyon) gelen, merkezi bir sinir kümesini gösteren bir kontrol balık (A) Gill filaman edildi. Belirtilen ionocytes bazıları da (insert). (B) solungaç filaman 2 gün tam ikili denervasyon sonra innerve edilir. Katmanlı innervasyon 5 gün dışsal innervasyon büyük ölçüde yok olduğunu gösteren tam ikili denervasyon sonrası. (C) solungaç Filament büyük ölçüde sağlam çıktı ise merkezi sinir demetinin bir azalma oldu. Nitel analiz tam ikili denervasyon solungaç filamanın içinde hücre gövdeleri (içsel innervasyon) filamanın boyunca ve lameller içine bir sinir ağı oluşturma ile sinirleri korurken dışsal solungaç innervasyon bozulmasını neden olduğunu göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" target="_blank">Lütfen</a>Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish at JoVE.com

A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

Tam İkili Gill Denervasyonun ile birleştiğinde A Time Diferansiyel Boyama Tekniği Balık Ionocytes Eğitim için

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

a-time-differential-staining-technique-coupled-with-full-bilateral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Görüntüleme.  University of Ottawa. This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation. 

Video: A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Gelişim Biyolojisi

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

Bir roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Yapıştırma Tekniği bir Embriyonik tavuk Sistemde İntrakardiyak hemodinamiği Alter

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Embriyonik tavuk doku gelişimi çalışmaya Organotypic kültür yöntemi

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

Diş Hamuru Parakrin Sinyalleri yanıt olarak Neurite Outgrowth Çalışma Co-Kültür Yöntemi

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.