We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.

Her iki protokol Hayvan Bakımı (CCAC) Kanada Konseyi kurallarına uyduğu ve Ottawa Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi (Protokol BL-226) onayı ile yapılmıştır. 1. Zaman Diferansiyel Boyama Tekniği: Mitokondri zengin Boya Banyosu <ol><li> Dimetil sülfoksit (% 100 DMSO) içinde 94.0 ul 50 ug çözülmesiyle, 1 mM MitoTracker Kırmızı stok çözelti hazırlayın. Kullanılmadığı zaman -20 ° C&#39;de karanlıkta stok solüsyonu tutun. Donma / çözülme döngüleri kaçının. </li><li> 600 ml&#39;lik bir maksimum hacme sahip - (6 kutu 3) koyu kutuları hazırlayın. Sistem 400 ml su (su normalde tutulan balık) ile kutuları doldurun ve O 2 kaynağı sağlamak için her kutuda bir hava taşı yerleştirin. Goldfish elde (30-40 g) ve 400 ml su ve hava taşı ile kutulara koyun. 30 dakika sonra, 0.1 uM ve 0.01% DMSO nihai konsantrasyonlar elde etmek için uygun bir mitokondri zengin boya ekleyin. 4 saat için balık batırınr. <ol><li> Bu kontrol balık (yani, hiçbir denervasyon) ise, kutulara su akışı açmak boya dışarı floş ve protokolde ayrılan süre için balık kurtarmak için izin verir. 5 gün - Balık genellikle 3 kurtarıldı. </li></ol></li><li> Iyileşme süresinden sonra Bölüm 3 geçin: Zaman Diferansiyel Boyama Tekniği: İmünohistokimya. Bu balıklar sinirsiz için ise Bölüm 2 geçin: Tam İkili denervasyon Prosedürü. </li></ol> 2. Tam İkili denervasyon Prosedürü <ol><li> (Kavisli) Öğrenci Vannas yaylı makas, standart model forseps-düz 1 çift 1 çift elde, standart model forseps kavisli 1 çift, No. 5 forseps 2 çift, doku retraktörleri 1 çift, küçük pamuk topları (1 - 2 mm çapında), ve pamuklu (Q İpuçları veya eşdeğeri). </li><li> Anestezik su banyosu hazırlayın. İlk olarak, 100 ml lik bir son hacme kadar benzokain, 10 g çözülmesi% 99 etanol içinde bir stok çözeltisi hazırlanır. , Anestezi su banyosu hazırlamak gerekli sıcaklıkta gazlı sistem su 30 L içine stok benzocaine solüsyonu 15 ml eritmek için. Bir hava pompası veya su deposu bir merkezi hava hattına bağlanmış bir hava taşı yerleştirerek su havalandırır. <ol><li> Anestezik su banyosunda (Şekil 1A) içine balık yerleştirin. </li><li> Nefes bittikten sonra, bir ameliyat masaya balık yerleştirin ve Şekil 1B gösterildiği gibi entübe. Gazlı anestezik solüsyonu ile solungaçları sulamak için kendi ağız boşluğuna bir tüp takarak bunu yapın. Solungaçlar sulama balık denervasyon işlemi sırasında O 2 ve anestezi yeterli bir miktarı ile birlikte temin eder. Baş hafifçe aşağı doğru eğimli şekilde balık yerleştirin. Bu dördüncü solungaç kemer arkasındaki alanda daha iyi erişim sağlar. </li></ol></li><li> Yavaşça düz standart desen forseps ile kapakçık asansörve operculum&#39;un ve kafa içi arasındaki doku Ekartörleri yerleştirin. Dikkatle kafayla uzaklaştırdı kapakçık tutmak ve maruz solungaçları tutmak için doku Ekartörleri açın. </li><li> Anestezi çözüm Bu işlem sırasında solungaçları sulama emin olun. Retraktör dört solungaç kemer erişim sağlar baş yanında kolları dinlendirin. </li><li> Kafasına dördüncü solungaç kemeri takılması ligaman gerginliği oluşturmak için bunları açmak yavaşça dördüncü solungaç kemer ve başın arkasında arasındaki kavisli standart model forseps yerleştirin ve. Operkuler boşluğuna solungaç kemer dorsal ucunu bağlayan epitel delerek - (3 mm 2) sayılı bir çift ile 5 forseps küçük bir açıklık oluşturmak. Büyük bir kan damarı hasar riski olduğundan çok derin gitmek için dikkatli olun. </li><li> 5 forseps yavaş ve dikkatli bir şekilde sayılı ile yapılan küçük bir pamuk ile IX (glossofarengeal) ve X (vagus) sinirleri açığa kesi genişletin. ÜcretsizYine kan damarları zarar vermemeye özen, No. 5 forseps kullanarak herhangi bir bağ dokusu sinirler. NOT: akvaryum balığı solungaç IX ve X sinirler dördüncü solungaç kemer arkasında derin dinlenme ve solungaç kemerler besleyen ana kan damarlarının yakınlık vardır. </li><li> Sinirler kullanımını tespit edildikten sonra kavisli standart şekil forseps ile açık kesi tutarak kavisli yay makas dikkatle sinirleri kesmek için. Sinirleri kesilmesinin ardından, yavaşça kavisli bir forseps geri. 48 saat - epitel çok ince ve kesi genellikle 24 içinde kendi kapatması nedeniyle dikişlerle kesi kapatmak için gerek yoktur. Doku ekartörünü çıkarın. </li><li> Başın diğer tarafta aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Anestezi balık kurtarmak taze havalandırılmış su anestezik gelen solungaçları sulanması geçin. Bir kez operkuler hareketler en az 24 saat iyileşmek için deneysel tanklara balık taşımak devam var. </li><li&gt; balık ayrı bir set bir &quot;sahte&quot; işlemini gerçekleştirin. &quot;Sahte&quot; prosedürü sinirleri kesmeden dördüncü solungaç kemer arkasında epitel piercing içerir. </li></ol> 3. Saat Diferansiyel Boyama Tekniği: İmmünhistokimya <ol><li> (, PBS içinde 96 ml 4 gr PFA PBS) İlk olarak, 1x Fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlanması. PFA oda sıcaklığında PBS içinde kolaylıkla çözülmez. Bir su banyosu içinde ısı çözeltisi PFA eritin. Bir çeker ocak içinde, bu gerçekleştirin. PFA çözelti içinde bir kez kullanmadan önce soğumaya bırakın. 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de depolayın. </li><li> 8 sintilasyon şişelerine (solungaç kemeri başına 1 tüp) toplam bir parıldama ampulüne konulması ile% 4 PFA 4 ml - solungaç doku balık ötenazi ve ekstre etmeden önce, 3 yerleştirin. Buna ek olarak, küçük 1x PBS ile tekne tartın ve dolgu almak. Bu kesilmiş sonra doku yıkamak için kullanılır. Buz üzerinde tüm çözümleri tutun. </li><li> Canlı mitokondri zengin boya maruz kalınması sonrasındaDeney benzokain aşırı dozda bir su banyosunda koyarak goldfish euthanize, tamamladı. </li><li> Brankiyal solungaç sepeti her ucunu sever bir baş tarafında ve kavisli makas üzerinde kapakçık kaldırmak için künt forseps kullanın. Dikkatle künt forseps kullanarak diken tarafından solungaçları pick up ve operkuler boşluğunun onları kaldırın. Hemen aşırı Benzocaine ve kan kaldırmak için PBS 1x buz soğuk solungaçları yıkayın. </li><li> % 4 PFA ile doldurulmuş ayrı şişelerde kesilmiş solungaçları (her solungaç kemeri için bir şişe) yerleştirilir ve 4 ° C&#39;de O / N düzeltin. </li><li> Tespit edildikten sonra, 1X PBS içinde fazla PFA yıkama ve 4 ° C&#39;de, oda sıcaklığında ya da O / N oranında 6 saat süre ile bir çalkalama ile% 1 Triton-X 1.5 ml ile doldurulmuş bir 2 mi mermi tüpü içinde doku yerleştirin. Bu adım doku permeabilizes. Bütün solungaç 2 ml tüp içine yerleştirmek için çok büyük ise, filamentler zarar vermemeye tüp alarak dikkat sığacak kadar küçük bölümler halinde doku kesti. <ol><li> Mi birincil antikor dilüeXing 1x PBS 992 ul her bir birincil antikor (8 ul toplam) stok çözeltisi 4 ul. NKA (NKA-zengin hücreler etiketler) emin olun ve zn-12 (etiketler nöronlar) birincil antikorlar aynı konakta gündeme gelmiş. Araştırmacılar farklı bir konak türlerinde kaldırdı birincil ve ikincil antikorlar kullanmak zorunda olan aynı zamanda belirli IC alt tipi tanımlamak için karar verirseniz, bu önemlidir. </li><li> Triton-X çözüm çıkarın ve doku eklemek için 1 yıkama olmadan: Bir NKA monoklonal antikor 250 seyreltme (1x PBS içinde sulandırmak) (α-5) NKA zengin hücreler ve Zebra balığı spesifik nöronal antikor tespit etmek için (zn-12) Sinir lifleri (birincil antikor) tespit etmek ve 4 ° C sıcaklıkta, oda sıcaklığında ya da O / N oranında 6 saat süre ile bir çalkalama ile inkübe edilmesi. </li></ol></li><li> 1x PBS kullanılarak 3 dakika her biri için birincil antikor 3 kez yıkayın. Bunu yapmak için, bir pipet kullanarak dışarı aspirasyon yoluyla tüpten birincil antikor çözüm kaldırmak. </li><li> Bir ikincil antikor hazırlayın1: 1x PBS 995 ul içine stok ikincil antikor 5 ul karıştırarak 200 seyreltme. Ikincil antikoru (Alexa Fluor 488) uygulanır ve bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında ya da O / N oranında 6 saat süre ile inkübe edilir. NOT: MitoTracker Kırmızı bir ~ 594 nm dalga boyunda heyecanlı ve kırmızı floresan olacaktır. Bir ~ 488 nm dalga boyunda heyecan ve yeşil floresant olan bir ikinci antikor, NKA etiket ve zn-12 primer antikor için kullanılabilir olması gerekir. </li><li> (Adım 3.7&#39;de tarif edildiği gibi), 5 dakika her biri için dokuya 3 kez yıkanarak fazla ikincil antikoru çıkarın. </li></ol> 4. Görüntüleme <ol><li> Yıkandıktan sonra, hücreler ve sinir liflerinin konfokal görüntüleme monte bütün bir içbükey slayt üzerinde doku monte edin. Doku monte etmek için, ilk olarak düz bir mikroskop lamı üzerine 1x PBS bir damla (200 ul) yerleştirin. Bu dokunun kurutulması etmez sağlar. </li><li> Kavisli mikro-makas ile solungaç hemibranchs ayırın. 1x PBS bir damla ve bir konkav slayt içine montaj medya bir damla yerleştirin. </li><li> Yukarı bakacak şekilde filamanın ön kenarı ile içbükey slayt ayrılmış hemibranchs yerleştirin ve bir kapak kayma ile kaplayın. Dolaşırım ve doku yerinden gelen kapak kayma önlemek için tırnak cilası ile kapak kayma kenarlarını hafifçe sürün. Görüntüleme önce 15 dakika - Doku 10 içbükey slayt altına yerleşmek için izin verin. </li><li> Her solungaç kemer için, solungaç kemer başına altı görüntüler üreten, görüntüleme için rastgele altı solungaç filamentleri seçin. 3 mikron optik dilim - 1 alarak görüntüye doku geleneksel konfokal mikroskopi kullanın. NOT: Herhangi bir önceden varolan hücrelerin MitoTracker Kırmızı ile işaretlenmiş olacak ve NKA için olumlu sadece sarı görünür. Sadece kırmızı görünen hücreler NKA içermeyen önceden varolan IC vardır. Herhangi bir yeni çoğaldı hücre yalnızca NKA için olumlu olacak ve sadece yeşil görünür. Sinir lifleri de yeşil görünecektir. </li></ol> Ionocyte Niceleme 5. Görüntü Analizi <ol><li> EAC içingörüntülü olmuştur h solungaç Filament, Z yığının bölümleri ile kaydırma ve mevcut ve yeni ayırt olsun veya olmasın, önceden var olan ve / veya innerve katmanlı ve filamental IC sayarak IC&#39;leri ve ilgili sinir donanımını ölçmek . </li><li> Filamanın (mm 2) iplik başına veya alan başına IC&#39;leri sayısal olmalıdır. IC ölçüldü hangi filamanın alanı kapsayan filamanın lamellerini anahat görüntüler elde için kullanılan yazılım ile ilişkili çizim araçlarını kullanarak yapın. Çoğu konfokal görüntüleme yazılım programları resmin üzerine özetlenen bölgenin alanını hesaplamak için seçeneğiniz vardır. Eğer bölgeyi kazanmak için bunu yapmak için izin verir görüntüleme yazılımı seçeneği kullanın. </li><li> (Mm 2 başına, örneğin) birim alan başına IC bir ölçü elde etmek için yazılım tarafından hesaplanan alana göre sayılan IC bölün. </li></ol>

<ol>
	<li>Katoh, F., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+transformation+and+long-term+replacement+of+branchial+chloride+cells+in+killifish+transferred+from+seawater+to+freshwater,+revealed+by+morphofunctional+observations+and+a+newly+established+'time-differential+double+fluorescent+staining'+technique.">Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established 'time-differential double fluorescent staining' technique.</a> J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).</li><li>Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+branchial+chloride+cells+and+gas+transfer+in+freshwater+fish.">Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).</li><li>Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+alters+the+respiratory+surface+area+of+crucian+carp+Carassius+carassius+and+goldfish+Carassius+auratus.">Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus.</a> J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).</li><li>Mitrovic, D., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+thermally+induced+gill+remodeling+on+ionocyte+distribution+and+branchial+chloride+fluxes+in+goldfish+(Carassius+auratus).">The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus).</a> J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).</li><li>Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoxia-induced+gill+remodelling+on+the+innervation+and+distribution+of+ionocytes+in+the+gill+of+goldfish,+Carassius+auratus.">Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus.</a> J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).</li><li>Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+soft-water+acclimation+on+gill+structure+in+the+rainbow+trout+Oncorhynchus+mykiss.">The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss.</a> Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).</li><li>Jonz, M. G., Nurse, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+mitochondria-rich+cells+and+associated+innervation+in+adult+and+developing+zebrafish.">Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).</li><li>Laurent, P., Hebibi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gill+morphometry+and+fish+osmoregulation.">Gill morphometry and fish osmoregulation.</a> Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).</li><li>Perry, S. F., Laurent, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptational+responses+of+rainbow+trout+to+lowered+external+NaCL+concentration:+contribution+of+the+branchial+chloride+cell.">Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell.</a> J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).</li><li>Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+fish+gill:+dominant+site+of+gas+exchange,+osmoregulation,+acid-base+regulation,+and+excretion+of+nitrogenous+waste.">The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste.</a> Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).</li><li>Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+fish+gills:+recent+progress+in+the+cellular+and+molecular+mechanisms.">Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Active+Uptake+of+Ions+into+Cells+and+Organisms.">The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).</li><li>Nilsson, G. E., Randall, D. J., Hoar, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+and+pharmacology+of+the+gills.">Innervation and pharmacology of the gills.</a> Fish Physiology. , 185-272 (1984).</li><li>Sundin, L., Nilsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branchial+innervation.">Branchial innervation.</a> J. Exp. Zool. 293 (3), 232-248 (2002).</li><li>Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+ionocytes+in+the+freshwater+fish+gill).">Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill).</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).</li><li>Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+Na+/K+-ATPase+in+the+gill+epithelium+of+rainbow+trout,+Oncorhynchus+mykiss.">Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss.</a> Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).</li><li>Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branchial+chloride+cell+proliferation+in+the+rainbow+trout,+Onchorhynchus+mykiss:+implications+for+gas+transfer.">Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer.</a> Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).</li><li>Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+gill+remodeling+on+transepithelial+sodium+fluxes+and+the+distribution+of+presumptive+sodium-transporting+ionocytes+in+goldfish+(Carassius+auratus).">The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus).</a> J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).</li><li>Chou, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypothermia+on+gene+expression+in+zebrafish+gills:+upregulation+in+differentiation+and+function+of+ionocytes+as+compensatory+responses.">Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses.</a> J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).</li><li>Kaneko, T., Katoh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+chloride+cells+in+killifish+Fundulus+heteroclitus,+a+euryhaline+teleost+with+seawater+preference.">Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference.</a> Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).</li><li>Ouattara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+gill+ionocyte+morphology+and+function+following+transfer+from+fresh+to+hypersaline+waters+in+the+tilapia+Sarotherodon+melanotheron.">Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron.</a> Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).</li><li>Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+branchial+chloride+cell+proliferation+on+respiratory+function+in+the+rainbow+trout,+Oncorhynchusmykiss.">The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss.</a> J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).</li><li>Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+gill+innervation+in+two+teleosts,+the+perch+and+the+trout.">Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout.</a> Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).</li><li>Jonz, M. G., Nurse, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+on+gill+innervation:+insights+from+a+model+vertebrate.">New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate.</a> J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).</li><li>Jonz, M. G., Zaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+control+of+the+gills.">Nervous control of the gills.</a> Acta Histochem. 111 (3), 207-216 (2009).</li><li>Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrabranchial+chemoreceptors+involved+in+respiratory+reflexes+in+the+neotropical+fish,+Colossoma+macropomum+(the+tambaqui).">Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui).</a> J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).</li><li>Hwang, P., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+fish+ion+regulation+and+mitochondrion-rich+cells.">New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> Zaman diferansiyel boyama tekniği iyon alımı dinamik düzenleme anlamak ve solungaç epitel IC zamansal yeniden dağılımını incelemek için yararlı bir araç olabilir. Basit bir prosedür olmasına rağmen, zaman diferansiyel boyama tekniğinin başarısı için önemlidir kilit noktaları vardır. goldfish protokolünde ayrılan zaman için mitokondri zengin boya maruz gerekir. Daha kısa maruz mitokondri zengin hücreler (yani, ionocytes) ile boyanın zayıf emme ile sonuçlanacaktır. Tespit sırasında, solungaç dokusu hızla eksize edilmeli ve fotoğraf beyazlatma önlemek için karanlıkta tuttu. Doku tespitin 2 hafta içinde görüntüleme için işlenmiş olması gerekir. İkili sinir kesit işlemi sırasında balık iyi anestezi olduğundan emin; sinirler ve kan damarları açıkça belirlenmiştir; Bir kurtarma tankına taşınmadan önce ve balık dolu operkuler işlevini sürdürür. &quot;&gt; FW ortamı. Pasif iyon kayıpları ve ozmotik su kazancı 14 dengeleme ikili mücadeleden ile balık sunan pasif iyon kayıplarının dengelenmesi filamental ve lameller epitel onlar lokalize olan IC genelinde tuz aktif alımı yoluyla gerçekleşir dış çevre 2,4,8,9,16 ile doğrudan temas. Ancak, solungaç üzerindeki IC yeri statik değildir. Son üç yılda bir dizi çalışma bu birkaç FW balık türleri göstermiştir, karşı karşıya Bir iyonik ve / veya ısı meydan, ince tabakanın 1,2,4,5,17-21 daha uzak bölgelere lamelinin filaman veya bazdan brankiyal ICs dağıtmak. Bu tür bir yeniden dağıtım lamellerinin kalınlığı artırabilen Gaz transferi bozabilir (O 2, CO 2) 22. Araştırmacılar bu yazıda anlatılan zaman diferansiyel boyama tekniği kullandık solungaç epitel boyunca tehcir ve emergenc izlemek içinBu farklı deneysel koşullar (Şekil 1C) 1,4,5 altında solungaç epitel yeni IC e. solungaçları ve muhtemelen brankial IC, IX ve X, kranial sinirler 7,23-25 ​​tarafından innerve edilir. Bu sinirler, sırasıyla, ve solungaç gelen efferent ve afferent girdiler hem de taşırlar. Onlar 4. solungaç kemer arkasında ağız boşluğuna dorsal tarafında yer almaktadır. sinirler ve ikili denervasyon işlemi yapılabilir hangi ile kolaylığı erişilebilirlik türe özeldir. Sinir doku ince bir tabaka altında 4. solungaç kemeri arkasında, tek bir düzlem üzerinde uzanmamaktadır için alabalık, örneğin, kafa sivri ve düzleştirilmiş anatomi sağlar. Bu sinirler görünür ve denervasyon yordamı gerçekleştirmek için araştırmacı kolayca erişilebilir hale getirir. Buna karşılık, akvaryum balığı kısa burun ve yuvarlak kafa var. Japon balıklarının IX ve X kranial sinirler dorsal si derinliklerine yalanFarklı uçakları işgal 4. solungaç kemer sonra kavite de. Bu yönelim sinirlerin erişim kolaylığı sınırlar ve uygun sinirleri belirlemek ve sever bir daha dikkatli bir yaklaşım gerektirir. denervasyon prosedürünün amacı, sırasıyla, ve solungaç duyu afferent ve efferent giriş kaldırmaktır. Solungaç kemeri denervasyonu da radyoizotopların iyon akışı deneyleri (örneğin, 22 Na) ile akuple edilebilir. Bu teknikler solungaç epitel boyunca iyon hareketi sinir giriş katkısını incelemek için tandem kullanılabilir. Denervasyon prosedürü başka sınırlama sinir kesilmesinin böylece zaman, duyusal ve motor nöronlar arasında ayrım bu innervasyon iki tip kaldırılır ediliyor mümkündür paket yetersizlik. Herhangi bir motor nöronları tomar balık solungaç ve operkuler hareketini etkileyebilir. Solungaç denervasyon deneyler yaparken Böylece de sonra havalandırmayı izlemek için önemlidirBalık gazı ve iyon değişimi hem de yeterli solungaç hareketi var olduğundan emin olmak için prosedür kurtarıldı. karanlık döngüsü ve beslenen ticari gıda pelet: Bu yazının kullanım yetişkin hayvanlarda açıklanan protokoller 12:12 ışık tuttu. Bu yöntemler, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. İlk olarak, mitokondri zengin boya maruz kaldıktan sonra iyileşme süresi, araştırmacının protokol (örneğin, 1, 3, 5, veya 14 gün) gereklerine göre ayarlanabilir. Laboratuvarda mitokondri zengin boya maruz kaldıktan sonra iyileşme uzun süre 14 gün 4,5 olmuştur. Iyileşme 14 gün sonra mitokondri zengin boyanın floresan yoğunluğunda önemli bir azalma oldu. İkincisi, α-5 birincil antikor kullanımı sadece NKA zengin hücrelerin belirlenmesi ve brankial IC farklı alt tipleri arasında ayrım yapmaz sınırlıdır. IC çoğunluğu her iki mitochondr olduğunu Neyse, akvaryum balığı o kurulduiyon zengin (Mitotracker etiket) ve tüm balık türlerinin 4,27 durumda olmayabilir hücreler (α-5 etiket) NKA zengin. Gelecek deneyler kanalları, pompa ve eşanjör (örneğin, NHE, H + pompa) çeşitli karşı özellikle yönlendirilmiş antikorlar kullanarak belirli IC alt tiplerinin zamansal yeniden dağıtılması aşağıdaki odaklanabilirsiniz. Önceki çalışmalar bulduğu mitokondri zengin boya sergi NKA immünoreaktivitesinde 4 ile boyanmış ionocytes çoğunluğu. IC İnnervasyonu zebra balığı türetilmiş nörona özgü antijen (Zn-12) karşı birincil antikor kullanılarak tespit edilebilir. Bu çalışmada,-5 α ve zn-12 birincil antikorlar için aynı ikincil antikoru (Alexa Fluor 488) ile tespit edilmiştir. Her iki birincil antikorlar bir fare konakta gündeme getirilen ve NKA zengin hücreler ve nöronlar aynı renk floresan bile morfolojik ayırt edilebilir olması ile aşılır Bu sınırlama nedeniyle. Sıralı boyamaFarklı ikincil antikorlarla (Alexa Fluor 488 ile, örneğin, ilk α-5 Alexa Fluor 594 ile-12 zn) da aynı renk floresanlama iki belirteçleri olan sorununu ortadan kaldırmak için kullanılabilir. Son olarak, tam iki taraflı sinir kesit protokole özgü solungaç kemerler sinirleri hedef modifiye edilebilir. Örneğin, seçici sinir kesit hafifçe solungaç sepeti (Şekil 2B-E) dorsal sonunda birinci solungaç kemer giden sinirleri açığa birinci ve ikinci solungaç kemeri ayırarak birinci solungaç kemer yapılabilir. Zaman diferansiyel tekniği aynı zamanda geliştirmek ve solungaç deriden iyon taşıma geçişler gibi larva Zebra balığı balık ionocytes dağılımını incelemek için uygulanabilir.

IC balık iyonik düzenleme için işlevsel birim ve solungaç filamentlerin epitel yüzeylerde bulunan ve 4,6-8,10 lamelleri. Alt tipler benzersiz özelliklere sahip olduğu tarif edilmesine rağmen, IC birçok mitokondri yüksek yoğunluklu (böylece aynı zamanda mitokondri zengin hücreler olarak da bilinir) ve / veya enzimin bolluğu ile karakterize edilen, Na + / K + ATPaz (NKA). Tipik olarak, bu IC ev iyon düzenleme (örneğin, Na + / H + değiştirici, Na / Cl - ko-transporter H + pompa) &#39;de yer alan diğer pompalar, iyon kanalları ve değiştiricilerin çeşitli 2,10,11. bir telafi mekanizması olarak IC dağıtılması ve yayılması özellikle iyonik stres (örneğin, iyon-fakir suya maruz kalma) 4,8,9 sırasında iyon dengesini sağlamaya yönelik merkezi. Bu çalışma, bir zaman diferansiyel boyama Techni açıklarque 1 balık solungaçları yeni çoğaldı ionocytes (IC) tanımlamak için. Bu teknik, solungaç kemerler tam bir ikili denervasyon ile birleştirilmiştir. Balığı (Carassius auratus), bu çalışmalarda kullanılan türler, yapısal olarak kendi solungaçları 2 yeni model için önemli bir özelliğine sahiptir, çünkü solungaç epitel hücrelerin çoğalmasını çalışma için uygundur. Soğuk su (&lt;15 ° C) ya da, oksijen azalması, sırasıyla 3 ortama alıştırılır - Gill yeniden modelleme (30 ° C, normal olarak 15 de muhafaza edilmiş) balık bir interlameller hücre kitlesinin büyümesine ve geri çekilmesi (ILCM) belirtir. Goldfish zamanı diferansiyel boyama tekniği kullanılarak Önceki çalışmalar 4,5 biçimlenme solungaç bağlamında solungaç üzerindeki IC dağıtılması, innervasyon ve çoğalması üzerine odaklanmıştır. Katoh ve Kaneko 1 killifish dönüşümü ve brankial IC değiştirilmesini incelemek için bu yeni tekniği geliştirdi (Fundulus heteroclitus) transfeTemiz su (FW) deniz suyu (SW) ile ilgili rred. Bu çalışmada, odak noktası 25 ° C alıştırıldı akvaryum balığı IC çoğalması ve innervasyonunu üzerindedir. Gill yeniden bağlamında, bu gösterilen süre farkı boyama tekniği kullanılarak, akvaryum balığı hipoksik maruz kalma ve takip eden normoksik geri kazanımı sırasında ICs sabit sayıda muhafaza, bununla birlikte, inerve hücrelerin yüzdesi normoksik iyileşme dönemi 5 boyunca azalmıştır. Bu nöral kontrol altında 12 fazla 70 yıl önce balık iyonik alım mekanizmaları olduğu ileri sürülmüştür. teleost solungaç da &quot;brankiyal sinirler&quot; 13,14 olarak anılacaktır yüz (VII), dil ve yutak (IX) ve vagus (X) sinirler tarafından innerve edilir. Zebra balığı üzerine Jonz ve Hemşire (2003) tarafından yürütülen çalışmalar (Danio rerio) solungaç innervasyon innervasyon kökeni dışsal (hücre gövdesi (sinir lifi hücre gövdesi solungaç için dışsal olan) yanı sıra içsel olduğunu gösterdisinir lifi) solungaç özgüdür. Aynı yazarlar da brankiyal IC dışsal 7 innerve olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada, tam iki taraflı solungaç denervasyon ile birleştiğinde zaman diferansiyel boyama tekniği akvaryum balığı olarak dışsal innervasyon eksik IC çoğalmasını araştırmak için kullanıldı. Narin cerrahi prosedürler kolaylaştırır ve ionocytes kolayca standart immunohistokimyasal teknikler kullanılarak tanımlanır - Tam ikili solungaç denervasyon kranial sinirler IX ve X. nispeten büyük boy (200 gr 30), çünkü bu iki yaklaşım akvaryum balığı uygulanabilir olan kesilmesinin anlamına gelir. Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, University Mevcut çalışmada, IC (ör MitoTracker Kırmızı) önemli bir mitokondri özel bir boya ya da Na + / K + -ATPaz (α-5 α-alt birimlerine karşı birincil antikor kullanılarak görselleştirilmiştir Iowa, Iowa City IA). Bu protokol, basit bir yöntemii sağlargörselleştirme ve balık solungaç üzerindeki IC yeniden dağıtılmasını ve çoğalmasını analiz d.

<table><tbody><tr><td>MitoTracker Red</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma Alrdich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-5 primary antibody</td><td>Develompental Hybridoma Bank</td><td>a5</td><td></td></tr><tr><td>zn12 primary antibody</td><td>Develompental Hybridoma Bank</td><td>zn12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (anti mouse)</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Sigma Alrdich</td><td>E1501</td><td>4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>straight</td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-12</td><td>curved</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Tissue retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17009-07</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Alrdich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma Alrdich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish

Brankiyal ionocytes (IC) balık iyonik düzenleme için işlevsel birimlerdir. Yetişkinlerde, onlar solungaç ve filamental ve katmanlı epitel bulunan nerede Na +, Cl gibi onlar ulaşım iyonları - iyon kanalları, pompa ve eşanjör çeşitli yoluyla ve Ca 2+. teleost solungaç dışsal glossofaringeal (IX) ve vagus (X) sinirler (VI) yüz tarafından innerve edilir. IX ve X sinirler de brankiyal IC innervasyon dışsal kaynağıdır. Burada, innervasyonu, çoğalmasını ve IC dağılımını incelemek için kullanılan iki teknik tarif edilmiştir: Bir zaman diferansiyel boyama tekniği ve tam ikili solungaç denervasyon tekniği. Kısaca, akvaryum balığı hayati mitokondri özel boya maruz (örn, MitoTracker Kırmızı) etiketler (kırmızı floresan) önceden varolan IC. Balık ya da 3 için eski hallerine gelmeye bırakılmıştır - 5 gün ya da hemen tam bir ikili solungaç denervasyon uygulandı. 3 Sonra - kurtarma 5 gün, gdertlerin hasat ve immünohistokimya için sabittir. Doku daha sonra, bir α-5 birincil antikor ile boyanmış olan (hedef hücreleri ihtiva eden + / K + ATPaz Na) Tüm (hem yeni hem de önceden var olan) IC yeşil etiket ikincil bir antikor ile birlikte kullanılabilir. Konfokal görüntüleme kullanarak, önceden varolan IC ve yeni ICS (bir canlı mitokondri özel boya ve α-5 hem de etiketli) sarı görünür (α-5 yalnızca etiketli) yeşil görünür olduğu gösterilmiştir. Tandem kullanılan iki teknik balık çevre sorunlarına maruz kaldığında solungaç filamanın üzerindeki IC innervasyonu, çoğalmasını ve dağıtım çalışma uygulanabilir.

Şekil 1 kurmak cerrahi tablosu (Şekil 1A) göstermektedir, ameliyat sırasında balığın yerleştirme (Şekil 1B) ve zaman diferansiyel boyama tekniği (Şekil 1C) için en önemli üç adım. Aşama 1 &#39;de, balık, karanlıkta 25 ° C&#39;de iyi havalandırılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca muhafaza edilir. 30 dakikalık bir süre boyunca, bir araştırmacı Aşama 2 (Şekil 1C) sırasında suya ilave edilir, DMSO içinde mitokondri zengin boya kısım hazırlayabilir. Adım 2 kuluçka dönemi mitokondri zengin hücreler (yani, IC) içine su mitokondri zengin boya alımı için izin verir. Balık sonra ya tam ikili denervasyon yordamı veya balık anestezi olduğu sahte prosedürü ve manipüle opercula tabi ama sinirler sağlam kalır. Adım 3 kurmak ei olan bir balık akan su ile sağlanan bir kurtarma odasını temsilther tam ikili denervasyon veya &quot;sahte&quot; prosedürü geçirmiş. Kurtarma döneminden sonra, balık ötenazi ve solungaçları kesilmiş ve immünohistokimya için tespit edildi. bir &quot;sahte&quot; prosedürü geçirmiş olan bir balık solungaç lifte IC genel dağılımı ve innervasyon Şekil 2&#39;de tasvir edilmiştir. IC interlameller bölgeleri. Şekil 2A, Şekil tabanında olarak filamental epitel bulunurlar Mitokondri zengin boya ile etiketlenmiş önceden varolan IC (denervasyon / sahte işlemleri yapıldı önce, yani bu IC var). Şekil 2B sinir lifleri önceden varolan ve yeni oluşan IC (NKA immünoreaktivitesinde tarafından tanımlanan) filamental ve innerve gösterir katmanlı epithelia. Son olarak, iki görüntü birleştirme (Şekil 2C) açıkça önceden varolan IC (sarı görünür) ve yeni IC (yeşil görünür) ortaya koymaktadır.Şekil 2D, Şekil 2A-C&#39;de gösterilen filament IC miktar temsil eden bir grafiktir. Bu özel filament üzerinde, önceden varolan IC mm&#39;den 2 başına yeni çoğaldı IC büyük bir sayı olduğu görülmektedir (N = 1). Dışsal brankial innervasyon kaynağını kaldırmak için, IX ve X, kranial sinirler (dışsal innervasyon) kesildi. Şekil 3A solungaç filamentleri sonra operkuler boşluğunun dorsal bölgesini gösterir ve sinirleri kapsayan epithelia IX ve X maruz çıkarıldı iki büyük sinir gövdelerine gelen yayılan (Roma rakamları ile gösterilir) kranial sinirler dört kemerli (Şekil 3A) innerve; solungaç kemerler ilk solungaç kemer seçici denervasyon göstermektedir 4. Şekil 3B-E ile 1 numaralı edilir. İlk solungaç kemer geri kalanı için innervasyon o etkilemeden kaldırılabilir hem IX ve X, kranial sinirler (Şekil 3B) tarafından innerve edilirsolungaç kemerli (Şekil 3C-E) f. Solungaç filamanlara dış innervasyon kademeli kaybı (Şekil 4A-C) Tam karşılıklı denervasyon ile sonuçlanır. Kontrol balık filamanın (Şekil 4A), uzunluğu boyunca devam eden bir belirgin sinir demeti sergiler. Tam karşılıklı denervasyon iyileşme 2 gün (Şekil 4B) sonra dış innervasyon bir kayıp ile sonuçlanmıştır. Dışsal innervasyon daha fazla kaybolma denervasyon (Şekil 4C) kurtarma 5 gün sonra kaydedildi. Kurtarma 5 gün muhtemelen solungaç filamanın içinde hücre organları ile sinir elde sonra IC Herhangi kalan innervasyon (içsel inervasyon; Şekil 4C). <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1. Deneysel kullanılan adımların denervasyon prosedürü ve dizi için ayarlanmışZaman diferansiyel boyama tekniği. Anestezi ve iyileşme tankları gösteren denervasyon prosedürü için kurulmuş (A) Cerrahi tablo. Bir anestezi, entübe balık yerleştirme (B) Örnek. Zaman diferansiyel boyama tekniğinde kullanılan (C) Anahtar adımlar. Aşama 1 &#39;de, balık, 30 dakika için bir ısı kontrol statik havalandırılmış su banyosu içine yerleştirilir. Mitokondri zengin boya 0.1 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde edilmesi için Adım 2&#39;de ilave edildi ve balık 4 saat en az çözelti içinde banyo bırakılır. Su akış Adım balık solungacında tam ikili denervasyon veya sahte ameliyat ya uğrar bu noktada 3 başlatılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg" width="600"<html> /&gt; Şekil 2 gün tam ikili denervasyon sonra (25 ° C alıştırıldı) bir akvaryum balığı zaman diferansiyel boyama tekniği temsil 2. Işık mikrografları. (A), önceden var olan ionocytes (IC; oklar) dağılımı. Tek solungaç lifte mitokondri zengin boya boyama ile ortaya (B) IC dağılımı (yeni ve önceden var olan) ve brankiyal sinirlerin (kesikli oklar) sırasıyla, α-5 ve Zn-12 antikorları ile lekeleme ile ortaya çıkar. oklar IC göstermektedir (C) (A) ve (B) üst üste önceden mevcut IC ayırır.; (; oklarla gösterilen yeşil görünür) yeni çoğaldı IC (sarı görünen ok uçları ile gösterilir). Olarak kaydedin (C) innerve önceden var olan ionocyte bir büyütme. (D), panel (AC) &#39;de gösterilen filament IC kantifikasyon Örnek grafik. Panelinde, N = 1 ölçek çizgisi (C), 50 mm ve tüm paneller için geçerlidir./ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" width="700" /> Solungaç innervasyon çeşitli aşamalarını gösteren 3. Temsilcisi görüntüleri Şekil. IX ve X, kranial sinirler 4 solungaç kemeri innerve gösteren ağız boşluğuna (A) dorsal görünümü. Gill kemerler 1-4 numaralandırılır. solungaç filamentleri ve sinirler daha iyi innervasyon görselleştirmek için çıkarıldı kapsayan doku. (B) 1. ve 2. solungaç kemerler duyusal organı ortaya çıkarmak için ayrılır ve IX ve X, kranial sinirlerin dalları 1. solungaç innerve kemer. IX ve X, kranial sinirlerin dalları kesilmesinin 1. solungaç kemer seçici denervasyon gösteren görüntülerin (CE) Dizi. Şematik yeniden içinteleost balık solungaç innervasyonunu sunumu, Milsom vd Şekil 1&#39;e bakınız 26 görüntülerde beyaz çizgiler mikroskop ışıkları su yansıması vardır.; herhangi bir morfolojik yapısını tanımlamak gerekmez. Panelinde Ölçek çubuğu (E) 4 mm ve tüm paneller için geçerlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" width="700" /> 25 ° C Ionocytes (ok başları ile gösterilir) acclimated bir akvaryum balığı olan 1. solungaç kemer tek bir filamanın üzerinde ionocytes dağılımını ve innervasyonu gösteren Şekil 4. Işık mikrografları belirtilen α-5 antikoru ve sinirler (ile boyandı bY oklar). Zn-12 antikoru ile boyanmış muhtemelen geniş katmanlı dallanma ile IX ve X, sinirler (dıştan innervasyon) gelen, merkezi bir sinir kümesini gösteren bir kontrol balık (A) Gill filaman edildi. Belirtilen ionocytes bazıları da (insert). (B) solungaç filaman 2 gün tam ikili denervasyon sonra innerve edilir. Katmanlı innervasyon 5 gün dışsal innervasyon büyük ölçüde yok olduğunu gösteren tam ikili denervasyon sonrası. (C) solungaç Filament büyük ölçüde sağlam çıktı ise merkezi sinir demetinin bir azalma oldu. Nitel analiz tam ikili denervasyon solungaç filamanın içinde hücre gövdeleri (içsel innervasyon) filamanın boyunca ve lameller içine bir sinir ağı oluşturma ile sinirleri korurken dışsal solungaç innervasyon bozulmasını neden olduğunu göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" target="_blank">Lütfen</a>Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Watch this Scientific Journal Video about A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish at JoVE.com

A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

Tam İkili Gill Denervasyonun ile birleştiğinde A Time Diferansiyel Boyama Tekniği Balık Ionocytes Eğitim için

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

a-time-differential-staining-technique-coupled-with-full-bilateral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.4K Görüntüleme.  University of Ottawa. This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation. 

Video: A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Gerilim duyarlı Boyalar ile Yengeç Stomatogastric Ganglion Nöronlar Optik Görüntüleme

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Nörobilim

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-kelepçe Kapasitans Ölçümler ve Ca 2 + Retina Dilimleri Tek Sinir Terminalleri Görüntüleme

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ganglia that line the spinal column. Understanding the receptors and channels expressed by these sensory afferent neurons could lead to novel therapies for disease. The initial step is to identify the specific subset of sensory neurons of interest. Here we describe a method to identify afferent neurons innervating the muscles by retrograde labeling using a fluorescent dye DiI (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate). Understanding the contribution of ion channels to excitation of muscle afferents could help to better control excessive excitability induced by certain disease states such as peripheral vascular disease or heart failure. We used two approaches to identify the voltage dependent ion channels expressed by these neurons, patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry. While electrophysiology plus pharmacological blockers can identify functional ion channel types, we used immunocytochemistry to identify channels for which specific blockers were unavailable and to better understand the ion channel distribution pattern in the cell population. These techniques can be applied to other areas of the nervous system to study specific neuronal groups.

Afferent sensory neurons signal sensory information from the periphery to the central nervous system. Identifying specific afferent neurons will help in understanding their physiology. We describe a method of retrograde labeling to identify afferent neurons, and study the voltage-gated ion channels in these neurons using patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry.

Ifade İyon Kanallarının Çalışması için özel Duyusal Nöron Populasyonlarının Belirlenmesi

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Kerevit ve yüzgeç Sistemi: Sinir Kordon ve Motorlu Pattern Extracellular Recordings ve Diseksiyon için Pratik Kılavuzu

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Gelişim Biyolojisi

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Değiştirilmiş elektriksel aktiviteye maruz kalan bireysel canlı zebra balıklarında iskelet kası büyümesinin gerçek zamanlı ve tekrarlanan ölçümü

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

koku ampul kalsiyum Değişiklikleri İzleme yoluyla Sıcaklık kaynaklı Nöronal Aktivite Kayıt<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Biyoloji

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Tam İkili Gill Denervasyonun ile birleştiğinde A Time Diferansiyel Boyama Tekniği Balık Ionocytes Eğitim için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet