We would like to thank William Fletcher for animal care at the University of Ottawa. The authors would also like to thank Dr. William Milsom for teaching VT the full bilateral denervation technique at the University of British Columbia. A travel grant for this research was provided by the Faculty of Graduate and Postgraduate Studies at the University of Ottawa. This research is also supported by NSERC PGS-D scholarship to VT and Discovery Grants Program to SFP.

שני הפרוטוקולים תאמו את ההנחיות של המועצה הקנדית של טיפול בבעלי חיים (CCAC) ובוצעו באישור אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים אוטווה (פרוטוקול BL-226). 1. זמן דיפרנציאלי מכתים טכניקה: mitochondrion עשיר Dye אמבט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרון מניות מ&quot;מ MitoTracker אדום על ידי המסת 50 מיקרוגרם ב94.0 μl של sulfoxide דימתיל (100% DMSO). שמור פתרון מניות בחושך ב -20 ° C כאשר אינו בשימוש. הימנע מהקפאה / הפשרה מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קופסות שחורות (3-6 תיבות) עם נפח מרבי של 600 מיליליטר. מלא את התיבות עם 400 מיליליטר מים מערכת (מים הדגים בדרך כלל נערכו ב) ולמקם את אבן אוויר בכל תיבה כדי לספק מקור של O 2. להשיג דג זהב (30 - 40 גרם) ולמקם אותם בקופסות עם 400 מיליליטר של מים ואבן אוויר. לאחר 30 דקות, להוסיף צבע mitochondrion עשיר קיימא להניב ריכוזים סופיים של 0.1 מיקרומטר ו0.01% DMSO. לרחוץ את הדגים של 4 שעותr. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אלה הם דגי שליטה (כלומר, אין denervation), להפעיל את זרימת מים לתיבות, לאפשר לצבע כדי לשטוף את ולשחזר את הדגים לתקופה של הזמן המוקצב בפרוטוקול. דגים הם התאוששו בדרך כלל עבור 3-5 ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת ההחלמה להמשיך לסעיף 3: טכניקת זמן דיפרנציאלי מכתים: אימונוהיסטוכימיה. אם דגים אלה יש denervated להמשיך לסעיף 2: נוהל denervation דו-צדדי מלא. </li></ol> 2. denervation נוהל דו-צדדי מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג 1 זוג מספריים תלמיד אביב Vannas (מעוגלים), 1 זוג מלקחיים-ישר דפוס סטנדרטיים, 1 זוג מלקחיים מעוקלים דפוס סטנדרטיים, 2 זוגות של מס &#39;5 מלקחיים, 1 זוג מפשקי רקמה, כדורי צמר גפן קטן (1 - 2 מ&quot;מ קוטר), וצמר גפן (Q טיפים או שווה ערך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אמבט מים ההרדמה. ראשית, לפזר 10 גרם של benzocaine לנפח סופי של 100 מיליליטרשל 99% אתנול להכין פתרון מניות. כדי להכין את אמבט מים הרדמה, לפזר 15 מיליליטר של פתרון benzocaine המניה ל -30 ליטר של מים במערכת סודה בטמפרטורה הנדרשת. לאוורר את המים על ידי הנחת אבן-אוויר מחוברת למשאבת אוויר או אוויר-קו מרכזי למכל המים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח דגים לאמבטיה ההרדמה המים (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהנשימה פסקה, למקם את הדגים על שולחן ניתוחים וצנרר זה כפי שמוצג באיור 1. עושה זאת על ידי החדרת צינור בחלל הלחי שלה להשקות את הזימים עם הרדמה סודה. השקיה של הזימים מבטיחה כי הדגים מסופקים עם כמות מספקת של O 2 והרדמה במהלך הליך denervation. מקם את הדגים כך שהראש מוטה מעט כלפי מטה. זה מאפשר לגישה טובה יותר לאזור שמאחורי קשת הזימים הרביעית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם בעדינות את operculum עם המלקחיים דפוס סטנדרטיים ישרולמקם את מפשקי הרקמה בין operculum ואת החלק הפנימי של הראש. לפתוח בזהירות את מפשקי הרקמה לשמור operculum מהראש ולשמור על הזימים חשופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שחומר הרדמת השקיית הזימים במהלך הליך זה. לנוח מפשק מטפל בסמוך לראש אשר מספק גישה לכל ארבעת קשתות הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תבנית המלקחיים המעוקלים סטנדרטיים בין קשת הזימים הרביעית והחלק האחורי של הראש ולפתוח אותם בעדינות כדי ליצור מתח ברצועת חיבור לקשת הזימים הרביעית לראש. עם זוג מס &#39;5 מלקחיים ליצור פתח קטן (2 - 3 מ&quot;מ) על ידי פירסינג אפיתל חיבור סוף הגב של קשתות הזימים לחלל opercular. היזהר שלא ללכת עמוק מדי, כי יש את הסיכון של פגיעה בכלי דם גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם כדור צמר גפן קטן שנערך עם מס &#39;5 מלקחיים לאט ובזהירות להרחיב את החתך על מנת לחשוף את IX (לשון או לוע) וX עצבים (התועה). חינםעצבים מכל רקמת חיבור באמצעות מס &#39;5 מלקחיים, לוקח שוב להיזהר שלא לפגוע בכלי דם. הערה: IX branchial וX עצבים של דג הזהב לנוח עמוק מאחורי קשת הזימים הרביעית ונמצאים בסמיכות לכלי דם גדולים האכלה לקשתות זימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעצבים זוהו שימוש במספריים באביב המעוקלים לחתוך בזהירות את העצבים תוך כדי לחיצה על החתך פתוח עם המלקחיים צורה סטנדרטיים המעוקלים. אחרי ששרפתי את העצבים, בעדינות לחזור בו מהמלקחיים המעוקלים. אין צורך לסגור את החתך עם תפרים כי האפיתל הוא דק מאוד והחתך בדרך כלל סוגר בפני עצמו בתוך 24 - 48 שעות. הסר מפשק רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך בצד השני של הראש האחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור ההשקיה של הזימים מהרדמה למים סודה טריים להתאושש מהרדמה הדגים. ברגע שתנועות opercular חודש להעביר את הדגים למכלי ניסיון להתאושש במשך לפחות 24 שעות. </li><li&gt; בצע הליך &quot;אחיזת עיניים&quot; על סט של דגים נפרד. הליך &quot;אחיזת העיניים&quot; כרוך פירסינג אפיתל מאחורי קשת הזימים הרביעית, מבלי לנתק את העצבים. </li></ol> 3. טכניקת זמן דיפרנציאלי מכתים: אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להכין paraformaldehyde 4% (PFA) במלוח 1x פוספט (PBS; 4 g PFA ב 96 מיליליטר של PBS). PFA אינו מתמוסס בקלות בPBS ב RT. פתרון חום באמבט מים כדי לפזר PFA. לבצע את זה במנדף. ברגע שPFA הוא בפתרון לתת מגניב לפני השימוש. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הרדמת חסד הדגים וחילוץ רקמת הזימים, מקום 3 - 4 מיליליטר של 4% PFA לתוך בקבוקון נצנץ עבור הסכום כולל של 8 בקבוקוני נצנץ (1 בקבוקון לקשת זימים). בנוסף, תיקח קטן לשקול סירה ולמלא אותו עם 1x PBS. זה ישמש כדי לשטוף את הרקמה לאחר שנכרת. שמור את כל הפתרונות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חשיפת צבע mitochondrion עשיר קיימאניסוי סיים, להרדים את דג הזהב על ידי הצבתו באמבט מים עם מנת יתר של benzocaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים בוטים להרים operculum בצד אחד של הראש ומספריים מעוקלים לנתק את כל קצה של סל הזימים branchial. בזהירות להרים את הזימים על ידי rakers באמצעות מלקחיים בוטים ולהרים אותם אל מחוץ לחלל opercular. מייד לשטוף את הזימים בקרח קר 1x PBS להסיר benzocaine ודם עודפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הזימים נכרת בבקבוקונים נפרדים (בקבוקון לכל קשת זימים) מלאים עם 4% PFA ולתקן O / N ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לשטוף את PFA העודף ב1X PBS ולמקם את הרקמה בצינור כדור 2 מיליליטר מלא 1.5 מיליליטר של 1% Triton-X על שייקר במשך 6 שעות בRT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. צעד זה permeabilizes הרקמה. אם כל הזימים הוא גדולים מדי למקום לתוך צינור 2 מ&quot;ל ואז לחתוך את הרקמה לחלקים קטנים מספיק כדי להתאים את טיפול לקיחת צינור שלא לפגוע בחוטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את דילולים נוגדן הראשוניים על ידי miXing 4 μl של פתרון המניות של כל נוגדן ראשוני (כוללת של 8 μl) לμl 992 של 1x PBS. ודא שNKA (תוויות בתאי NKA עשירים) וZn-12 (נוירונים תוויות) נוגדנים ראשוניים הועלו באותו המארח. זה חשוב אם החוקרים להחליט לזהות תת IC ספציפי באותו הזמן שבו הם יצטרכו להשתמש בנוגדנים ראשוניים ומשניים גדלו במינים שונים מארח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון Triton-X וללא שטיפת הרקמות להוסיף 1: 250 דילול (לדלל ב1x PBS) של נוגדן חד שבטי NKA (α-5) כדי לזהות תאי NKA עשירים ונוגדן עצבי ספציפי דג הזברה (Zn-12) כדי לזהות סיבי עצב (נוגדנים ראשוניים) ודגירה על שייקר במשך 6 שעות בRT או O / N ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הנוגדן הראשוני 3 פעמים במשך 3 דקות כל אחד באמצעות 1x PBS. כדי לעשות זאת, להסיר את פתרון הנוגדן הראשוני מהצינור על ידי שאיבתו החוצה בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנוגדן משני ב1: 200 דילול על ידי ערבוב 5 μl של נוגדנים משני המניה לμl 995 של 1x PBS. החל נוגדנים משני (Alexa פלואוריד 488) ודגירה של 6 שעות בRT או O / N ב 4 ° C על שייקר. הערה: MitoTracker האדום הוא נרגש ב~ 594 ננומטר אורך גל ויהיה לזרוח אדום. נוגדנים משני שמתרגשים ב~ 488 ננומטר אורך גל והמאיר ירוק יש להשתמש כדי לתייג NKA וZn-12 נוגדנים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר נוגדנים משני עודפים על ידי שטיפת הרקמות 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד (כמתואר בשלב 3.7). </li></ol> 4. הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפה, הר הרקמה בשקופית קעורה להר שלם ההדמיה confocal של תאים וסיבי עצב. לעלות על הרקמה, ראשון למקם אותו בירידה (200 μl) של 1x PBS בשקופית מיקרוסקופ שטוחה. הדבר מבטיח כי הרקמות לא לייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את hemibranchs הזימים עם מיקרו-מספריים המעוגלים. מניחים ירידה של 1x PBS וירידה של תקשורת הרכבה לשקופית קעורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את hemibranchs המופרד לשקופית הקעורה עם הקצה המוביל של חוט הלהט פונה כלפי מעלה ומכסה בתלוש לכסות. מורח את הקצוות של להחליק לכסות עם לק על מנת למנוע להחליק את המכסה מההסתובבות ועקירת הרקמה. לאפשר לרקמות ליישב לתחתית של השקופית הקעורה במשך 10 - 15 דקות לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל קשת זימים, בחר שישה חוטי זימים באופן אקראי להדמיה, הפקת שש תמונות לקשת זימים. השתמש במיקרוסקופ confocal הקונבנציונלי לתמונת הרקמה על ידי לקיחת 1-3 מיקרומטר פרוסות אופטיות. הערה: כל תאים קיימים מראש תהיה שכותרתו עם MitoTracker האדום וחיובית לNKA יופיע צהוב בלבד. תאים שיופיעו אדום רק שבבים קיימים מראש שאינו מכילים NKA. כל תא התרבו חדש יהיה רק ​​חיובי לNKA ויופיע ירוק בלבד. סיבי עצב יופיעו ירוקים גם. </li></ol> ניתוח תמונה 5. לכימות Ionocyte <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לEACנימה הזימים h כי כבר צילמה, לכמת את השבבים והעצבוב הקשורים ידי גלילה בסעיפים של ערימת Z ולספור את מספר שבבי שבשבת וfilamental הנוכחי או לא והאם הם נבדלים זה עתה, קיים מראש, ו / או innervated . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את השבבים לחוט להט או לכל אזור (2 מ&quot;מ) של חוט להט. עושה זאת על ידי שימוש בכלי הציור הקשורים לתוכנה ששמשה לרכישת התמונות להתוות lamellae של חוט הלהט המקיף את האזור של חוט הלהט שבו השבבים היו לכמת. רוב תוכנות הדמיה confocal האפשרות לחשב את השטח של אזור שהותווה על התמונה. השתמש באפשרות בתוכנת ההדמיה שמאפשרת לך לעשות את זה כדי לרכוש את השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את השבבים נספרו על ידי האזור מחושב על ידי התוכנה להשיג מידה של שבבים ליחידת שטח (למשל, למ&quot;מ 2). </li></ol>

<ol>
	<li>Katoh, F., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+transformation+and+long-term+replacement+of+branchial+chloride+cells+in+killifish+transferred+from+seawater+to+freshwater,+revealed+by+morphofunctional+observations+and+a+newly+established+'time-differential+double+fluorescent+staining'+technique.">Short-term transformation and long-term replacement of branchial chloride cells in killifish transferred from seawater to freshwater, revealed by morphofunctional observations and a newly established 'time-differential double fluorescent staining' technique.</a> J. Exp. Biol. 206 (22), 4113-4123 (2003).</li><li>Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+branchial+chloride+cells+and+gas+transfer+in+freshwater+fish.">Relationships between branchial chloride cells and gas transfer in freshwater fish.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 119 (1), 9-16 (1998).</li><li>Sollid, J., Weber, R. E., Nilsson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+alters+the+respiratory+surface+area+of+crucian+carp+Carassius+carassius+and+goldfish+Carassius+auratus.">Temperature alters the respiratory surface area of crucian carp Carassius carassius and goldfish Carassius auratus.</a> J. Exp. Biol. 208 (6), 1109-1116 (2005).</li><li>Mitrovic, D., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+thermally+induced+gill+remodeling+on+ionocyte+distribution+and+branchial+chloride+fluxes+in+goldfish+(Carassius+auratus).">The effects of thermally induced gill remodeling on ionocyte distribution and branchial chloride fluxes in goldfish (Carassius auratus).</a> J. Exp. Biol. 212 (6), 843-852 (2009).</li><li>Tzaneva, V., Vadeboncoeur, C., Ting, J., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoxia-induced+gill+remodelling+on+the+innervation+and+distribution+of+ionocytes+in+the+gill+of+goldfish,+Carassius+auratus.">Effects of hypoxia-induced gill remodelling on the innervation and distribution of ionocytes in the gill of goldfish, Carassius auratus.</a> J. Comp. Neurol. 522 (1), 118-130 (2014).</li><li>Greco, A. M., Fenwick, J. C., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+soft-water+acclimation+on+gill+structure+in+the+rainbow+trout+Oncorhynchus+mykiss.">The effects of soft-water acclimation on gill structure in the rainbow trout Oncorhynchus mykiss.</a> Cell Tissue Res. 285 (1), 75-82 (1996).</li><li>Jonz, M. G., Nurse, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+mitochondria-rich+cells+and+associated+innervation+in+adult+and+developing+zebrafish.">Epithelial mitochondria-rich cells and associated innervation in adult and developing zebrafish.</a> J. Comp. Neurol. 497 (5), 817-832 (2006).</li><li>Laurent, P., Hebibi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gill+morphometry+and+fish+osmoregulation.">Gill morphometry and fish osmoregulation.</a> Can. J. Zool. 67 (12), 3055-3063 (1989).</li><li>Perry, S. F., Laurent, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptational+responses+of+rainbow+trout+to+lowered+external+NaCL+concentration:+contribution+of+the+branchial+chloride+cell.">Adaptational responses of rainbow trout to lowered external NaCL concentration: contribution of the branchial chloride cell.</a> J. Exp. Biol. 147, 147-168 (1989).</li><li>Evans, D. H., Piermarini, P. M., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifunctional+fish+gill:+dominant+site+of+gas+exchange,+osmoregulation,+acid-base+regulation,+and+excretion+of+nitrogenous+waste.">The multifunctional fish gill: dominant site of gas exchange, osmoregulation, acid-base regulation, and excretion of nitrogenous waste.</a> Physiol. Rev. 85 (1), 97-177 (2005).</li><li>Hwang, P. P., Lee, T. H., Lin, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+regulation+in+fish+gills:+recent+progress+in+the+cellular+and+molecular+mechanisms.">Ion regulation in fish gills: recent progress in the cellular and molecular mechanisms.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 301 (1), R28-R47 (2011).</li><li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Active+Uptake+of+Ions+into+Cells+and+Organisms.">The Active Uptake of Ions into Cells and Organisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 25 (6), 275-277 (1939).</li><li>Nilsson, G. E., Randall, D. J., Hoar, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+and+pharmacology+of+the+gills.">Innervation and pharmacology of the gills.</a> Fish Physiology. , 185-272 (1984).</li><li>Sundin, L., Nilsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branchial+innervation.">Branchial innervation.</a> J. Exp. Zool. 293 (3), 232-248 (2002).</li><li>Dymowska, A. K., Hwang, P. P., Goss, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+ionocytes+in+the+freshwater+fish+gill).">Structure and function of ionocytes in the freshwater fish gill).</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 184 (3), 282-292 (2012).</li><li>Witters, H., Berckmans, P., Vangenechten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+of+Na+/K+-ATPase+in+the+gill+epithelium+of+rainbow+trout,+Oncorhynchus+mykiss.">Immunolocalization of Na+/K+-ATPase in the gill epithelium of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss.</a> Cell Tissue Res. 283 (3), 461-468 (1996).</li><li>Bindon, S., Fenwick, J. C., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branchial+chloride+cell+proliferation+in+the+rainbow+trout,+Onchorhynchus+mykiss:+implications+for+gas+transfer.">Branchial chloride cell proliferation in the rainbow trout, Onchorhynchus mykiss: implications for gas transfer.</a> Can. J. Zool. 72 (8), 1395-1402 (1994).</li><li>Bradshaw, J. C., Kumai, Y., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+gill+remodeling+on+transepithelial+sodium+fluxes+and+the+distribution+of+presumptive+sodium-transporting+ionocytes+in+goldfish+(Carassius+auratus).">The effects of gill remodeling on transepithelial sodium fluxes and the distribution of presumptive sodium-transporting ionocytes in goldfish (Carassius auratus).</a> J. Comp. Physiol. B. 182 (3), 351-366 (2012).</li><li>Chou, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypothermia+on+gene+expression+in+zebrafish+gills:+upregulation+in+differentiation+and+function+of+ionocytes+as+compensatory+responses.">Effects of hypothermia on gene expression in zebrafish gills: upregulation in differentiation and function of ionocytes as compensatory responses.</a> J. Exp. Biol. 211 (19), 3077-3084 (2008).</li><li>Kaneko, T., Katoh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+chloride+cells+in+killifish+Fundulus+heteroclitus,+a+euryhaline+teleost+with+seawater+preference.">Functional morphology of chloride cells in killifish Fundulus heteroclitus, a euryhaline teleost with seawater preference.</a> Fisheries Science. 70 (5), 723-733 (2004).</li><li>Ouattara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+gill+ionocyte+morphology+and+function+following+transfer+from+fresh+to+hypersaline+waters+in+the+tilapia+Sarotherodon+melanotheron.">Changes in gill ionocyte morphology and function following transfer from fresh to hypersaline waters in the tilapia Sarotherodon melanotheron.</a> Aquaculture. 290 (1-2), 155-164 (2009).</li><li>Bindon, S., Gilmour, K., Fenwick, J., Perry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+branchial+chloride+cell+proliferation+on+respiratory+function+in+the+rainbow+trout,+Oncorhynchusmykiss.">The effects of branchial chloride cell proliferation on respiratory function in the rainbow trout, Oncorhynchusmykiss.</a> J. Exp. Biol. 197 (1), 47-63 (1994).</li><li>Dunel-Erb, S., Bailly, Y., Laurent, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+gill+innervation+in+two+teleosts,+the+perch+and+the+trout.">Pattern of gill innervation in two teleosts, the perch and the trout.</a> Can. J. Zool. 71, 18-25 (1993).</li><li>Jonz, M. G., Nurse, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+on+gill+innervation:+insights+from+a+model+vertebrate.">New developments on gill innervation: insights from a model vertebrate.</a> J. Exp. Biol. 211 (15), 2371-2378 (2008).</li><li>Jonz, M. G., Zaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+control+of+the+gills.">Nervous control of the gills.</a> Acta Histochem. 111 (3), 207-216 (2009).</li><li>Milsom, W. K., Reid, S. G., Rantin, F. T., Sundin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrabranchial+chemoreceptors+involved+in+respiratory+reflexes+in+the+neotropical+fish,+Colossoma+macropomum+(the+tambaqui).">Extrabranchial chemoreceptors involved in respiratory reflexes in the neotropical fish, Colossoma macropomum (the tambaqui).</a> J. Exp. Biol. 205 (12), 1765-1774 (2002).</li><li>Hwang, P., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+fish+ion+regulation+and+mitochondrion-rich+cells.">New insights into fish ion regulation and mitochondrion-rich cells.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 148 (3), 479-497 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> טכניקת צביעת ההפרש הזמן יכולה להיות כלי שימושי כדי להבין את הרגולציה הדינמית של ספיגת יון ולבחון חלוקה מחדש הזמנית של מעגלים משולבים בepithelia הזימים. למרות שהליך פשוט, יש מספר נקודות מפתח שהם חיוניים להצלחה של טכניקת צביעת ההפרש הזמן. דג הזהב צריך להיות חשוף לצבע mitochondrion העשיר לזמן המוקצב בפרוטוקול. חשיפות קצרות יותר יגרמו לספיגה ירודה של הצבע על ידי תאי mitochondrion עשיר (כלומר, ionocytes). במהלך קיבעון, רקמת הזימים יש להוציא במהירות והמשיכה בחושך כדי למנוע הלבנת תמונה. הרקמה חייבת להיות מעובד להדמיה בתוך 2 שבועות של קיבעון. במהלך הליך חתך עצב דו-צדדי להבטיח כי הדגים הוא גם מורדמים; העצבים וכלי דם מזוהים בבירור; והדגים יתחדש פונקצית opercular מלאה לפני שהוא עבר לטנק התאוששות. &quot;&gt; סביבת FW מציגה דגים עם האתגר הכפול של איזון הפסדי יון פסיביים ורווח מים האוסמוטי 14. איזון הפסדי יון פסיביים מתרחש באמצעות הספיגה הפעילה של מלח על פני המעגלים המשולבים המקומיים לfilamental וepithelia שבשבת שבו הם יכולים ליצור קשר ישיר עם הסביבה החיצונית 2,4,8,9,16. עם זאת, המיקום של המעגלים המשולבים בזימים אינו סטטי. בשלושת העשורים האחרונים מספר מחקרים הראו כי מספר מיני דגי FW, כאשר הוא מתמודד עם אתגר יוני ו / או טמפרטורה, להפיץ מחדש שבבי branchial מחוט הלהט או הבסיס של lamella לאזורי דיסטלי יותר של lamella 1,2,4,5,17-21. חלוקה מחדש כזה עשוי להגדיל את העובי של lamellae ש יכול להתפשר העברת גז (O 2, CO 2) על פני epithelia הזימים 22. חוקרים השתמשו בטכניקת צביעת ההפרש הזמן המתוארת בכתב היד הזה כדי לעקוב אחר רילוקיישן וemergencדואר של שבבים חדשים על epithelia הזימים בתנאים אלה שונים ניסיוניים (איור 1 ג) 1,4,5. הזימים, ומן הסתם שבבי branchial, מעוצבבים על ידי עצבי גולגולת IX ו- X 7,23-25. עצבים אלה לשאת שני efferent ותשומות מביא ומהזימים, בהתאמה. הם ממוקמים בצד הגב של החלל buccal מאחורי קשת הזימים 4 th. הנגישות של עצבים ואת הקלות שבה ניתן לבצע את הליך denervation הדו-צדדי היא מינים ספציפי. בפורל, למשל, את האנטומיה המחודדת והשטוחה של הראש מאפשרת לעצבים לשכב במישור אחד מאחורי קשת הזימים 4 th מתחת לשכבה דקה של רקמה. זה הופך את העצבים גלויים ונגישים לחוקר לבצע את הליך denervation. בניגוד לכך, יש לי דג זהב חוטם קצר וראש עגול. עצבי גולגולת IX ו- X של דג זהב לשקר עמוקים יותר לתוך si הגבדה של החלל לאחר קשת הזימים 4 th הכובש מישורים שונים. נטייה זו מגבילה את הנגישות לעצבים ודורשת גישה זהירה יותר לזהות ולנתק את העצבים המתאימים. מטרתו של נוהל denervation היא להסיר קלט מביא וefferent חושי ומהזימים, בהתאמה. Denervation של קשתות זימים גם יכול להיות בשילוב עם ניסויי שטף יונים באמצעות רדיואיזוטופים (למשל, 22 Na). טכניקות אלה יכולים לשמש במקביל ללמוד את תרומתם של קלט עצבים על תנועת יונים על פני epithelia הזימים. מגבלה נוספת להליך denervation היא חוסר היכולת להבחין בין נוירונים חושיים ומוטוריים, ובכך, כאשר ניתוק העצב צרור זה אפשרי ששני הסוגים של עצבוב מתבצעים הוסרו. ניתוק כל הנוירונים מוטוריים עשויה להשפיע על הזימים ותנועת opercular של הדגים. כך בעת ביצוע ניסויי denervation זימים חשוב גם כדי לפקח על אוורור לאחרדגים התאוששו מההליך כדי להבטיח שיש תנועת זימים מספיקה לשני גז וחילוף יונים. הפרוטוקולים שתוארו בבעלי החיים המבוגרים כתב היד הזה שימוש המשיכו אור 00:12: מחזור כהה וכדורי מזון המסחריים fed. ניתן לשנות שיטות אלה בכמה דרכים. ראשית, תקופת ההחלמה לאחר חשיפת צבע mitochondrion העשיר יכולה להיות מותאמת לדרישות של הפרוטוקול של החוקר (לדוגמא, 1, 3, 5, או 14 ימים). התקופה הארוכה ביותר של התאוששות לאחר חשיפת צבע mitochondrion העשיר במעבדה כבר 14 ימים 4,5. לא הייתה ירידה משמעותית בעוצמת הקרינה של הצבע mitochondrion העשיר אחרי 14 ימים של התאוששות. שנית, השימוש בα-5 הנוגדן הראשוני מוגבל לזיהוי רק תאי NKA העשיר ואינו מבחינים בין תת-הסוגים השונים של שבבי branchial. למרבה המזל, בדג זהב נקבע כי רוב השבבים שניהם mitochondrיון-עשיר (תווית עם MitoTracker) וNKA עשיר (תווית עם α-5) תאים אשר לא יכול להיות מקרה בכל מיני הדגים 4,27. ניסויים עתידיים יכולים להתמקד בבעקבות חלוקה מחדש הזמנית של תת IC הספציפי באמצעות נוגדנים מכוונים במיוחד נגד מגוון רחב של ערוצים, משאבות ומחליפות (לדוגמא, nhe, H + משאבה). מחקרים קודמים מצאו כי הרוב המכריע של ionocytes מוכתם בתערוכת צבע mitochondrion העשיר immunoreactivity NKA 4. עצבוב של המעגלים המשולבים יכול להיות מזוהה על ידי שימוש בנוגדן ראשוני נגד אנטיגן נגזר דג הזברה נוירון הספציפי (Zn-12). במחקר זה, α-5 ו- Zn 12 נוגדנים ראשוניים התגלו על ידי שימוש באותו נוגדנים משני (Alexa פלואוריד 488) לשניהם. הגבלה זו נובעת משני הנוגדנים העיקריים שהועלו במארח עכבר ולהתגבר על ידי העובדה שתאי NKA עשיר ונוירונים ניתן להבחין מורפולוגית למרות שהם לזרוח באותו צבע. צביעה רציפהעם נוגדנים שונים משני (למשל, α-5 הראשון עם אלקסה פלואוריד 488 אז Zn-12 עם אלקסה פלואוריד 594) יכול לשמש גם כדי למנוע את הבעיה של שיש שני סמני fluorescing באותו הצבע. לבסוף, פרוטוקול חתך עצב דו-צדדי המלא יכול להיות שונה כדי למקד את העצבים לקשתות זימים ספציפיים. לדוגמא, חתך עצב סלקטיבית יכול להתבצע על קשת הזימים הראשונה בעדינות על ידי הפרדת קשתות הזימים הראשונות ושנייה כדי לחשוף את העצבים שמוביל לקשת הזימים הראשונה בסוף הגב של סל הזימים (איור 2 ב-E). טכניקת ההפרש הזמן יכולה להיות מיושמת גם כדי ללמוד את חלוקת ionocytes בדגי דג הזברה זחל כפי שהם מפתחים ומעברי תחבורת יון מהעור לזימים.

מעגלים משולבים הם היחידה הפונקציונלית לרגולציה יונית בדגים ובנמצאים על משטחי אפיתל של חוטי הזימים וlamellae 4,6-8,10. למרות מגוון רחב של תת תוארו שיש תכונות ייחודיות, רב של השבבים מאופיינים בצפיפות גבוהה של מיטוכונדריה (ובכך הם ידועים גם בשם תאי mitochondrion העשיר) ו / או שפע של האנזים Na + / K + ATPase (NKA). בדרך כלל, בית שבבים אלה מגוון של משאבות אחרות, תעלות יונים ומחליפים מעורבות בויסות יון (למשל, Na + / H + מחליף, Na + / Cl - שיתוף טרנספורטר, H + משאבה) 2,10,11. חלוקה מחדש ושגשוגם של מעגלים משולבים כמנגנון פיצוי הוא מרכזיים לשמירה על הומאוסטזיס יון במיוחד בלחץ יוני (לדוגמא, חשיפה למים יון-עני) 4,8,9. מחקר זה מתאר techni צביעת ההפרש זמןque 1 לזהות ionocytes התרבו לאחרונה (ICs) בזימי דגים. טכניקה זו בשילוב עם denervation דו-צדדי מוחלט של קשתות זימים. דג זהב (Carassius auratus), המינים המשמשים במחקרים אלה, הוא גם מתאים ללמוד התפשטות של תאי אפיתל זימים כי יש להם יכולת מופלאה לשפץ מבני הזימים 2. שיפוץ גיל מתייחס לצמיחה או ההכחשה של מסת תאי interlamellar (ILCM) כאשר הדגים (בדרך כלל נשמרים ב15-30 מעלות צלזיוס) הם הסתגלו למים קרים (&lt;15 ° C) או היפוקסיה, בהתאמה 3. מחקרים קודמים תוך שימוש בטכניקת צביעת ההפרש הזמן על דג זהב התמקדו בחלוקה מחדש, העצבוב ושגשוגם של מעגלים משולבים בזימים בהקשר של זימים שיפוץ 4,5. transfe קאטו ו1 Kaneko פיתחו שיטה חדשנית זו כדי לחקור את השינוי והחלפה של שבבי branchial בנאוויות (Fundulus heteroclitus)rred מים מן הים (SW) למים מתוקים (FW). במחקר זה, הדגש הוא על ההתפשטות והעצבוב של שבבים בדג הזהב התאקלמו עד 25 ° C. שימוש בטכניקת צביעת ההפרש הזמן זה היה מראה כי, בהקשר של שיפוץ זימים, דג זהב לשמור על מספר קבוע של שבבים במהלך חשיפת חוסר חמצן והתאוששות normoxic שלאחר מכן, עם זאת, אחוז תאי innervated ירד במהלך תקופת התאוששות normoxic 5. הוצע לפני יותר מ -70 שנים שמנגנוני קליטה יוניות בדגים נמצאים בשליטה עצבית 12. הזימים החוליות הוא innervated על ידי עצבי פנים (VII), לשון או לוע (IX) ותועה (X) המכונים גם &quot;עצבי branchial&quot; 13,14. מחקרים על ידי Jonz ואחות (2003) בדג הזברה (Danio rerio) עצבוב זימים הראו כי מקורו של העצבוב הוא חיצוני (גוף תא של סיבי עצב הוא חיצוני לזימים), כמו גם פנימי (גוף תא שלסיבי עצב הוא מהותיים לזימים). אותם החוקרים הראו גם כי שבבי branchial מעוצבבים 7 extrinsically. במחקר זה, טכניקת צביעת ההפרש הזמן בשילוב עם denervation זימים דו-צדדי מלא הייתה בשימוש כדי לחקור את ההתפשטות של שבבים חסרי עצבוב חיצוני בדג זהב. denervation זימים דו-צדדי מלא מתייחס לניתוק IX עצבי גולגולת וX. שתי גישות אלה הן אפשריים בדג זהב בגלל הגודל שלהם גדול יחסית (30-200 ז) מפשט את ההליכים כירורגיים העדינים, וionocytes קלות מזוהות באמצעות טכניקות חיסוני histochemical סטנדרטיים. במחקר הנוכחי, שבבים היו דמיינו באמצעות צבע חיוני mitochondrion הספציפי (למשל, MitoTracker אדום) או נוגדן ראשוני נגד α-המקטע של Na + / K + -ATPase (α-5; התפתחותית מחקרי Hybridoma הבנק, אוניברסיטה איווה, Iowa City IA). פרוטוקול זה מספק metho פשוטד של הדמיה וניתוח חלוקה מחדש ושגשוגם של מעגלים משולבים בזימי הדגים.

<table><tbody><tr><td>MitoTracker Red</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma Alrdich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-5 primary antibody</td><td>Develompental Hybridoma Bank</td><td>a5</td><td></td></tr><tr><td>zn12 primary antibody</td><td>Develompental Hybridoma Bank</td><td>zn12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (anti mouse)</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Sigma Alrdich</td><td>E1501</td><td>4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>straight</td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11001-12</td><td>curved</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Tissue retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17009-07</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Alrdich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma Alrdich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish

ionocytes branchial (ICs) הם היחידות פונקציונליות לרגולציה יונית בדגים. אצל מבוגרים, הם נמצאים בfilamental וepithelia שבשבת של הזימים שבו הם יוני תחבורה כגון Na +, Cl - וCa 2 + באמצעות מגוון רחב של תעלות יונים, משאבות ומחליפות. הזימים החוליות הוא innervated extrinsically על ידי, לשון או לוע (IX) ותועים עצבים (X) פנים (VI). עצבי IX ו- X הם גם המקור החיצוני של עצבוב IC branchial. הנה, שתי טכניקות משמשות ללמוד עצבוב, התפשטות והפצה של מעגלים משולבים מתוארות: טכניקת צביעת ההפרש זמן וטכניקת denervation זימים דו-צדדית מלאה. בקצרה, דג זהב חשוף לצבע mitochondrion הספציפי חיוני (למשל, MitoTracker אדום) אשר תוויות (הקרינה אדומה) שבבים קיימים מראש. דגים הורשו גם להתאושש במשך 3-5 ימים או עברו denervation זימים דו-צדדי מלא באופן מיידי. לאחר 3-5 ימים של התאוששות, gחוליים נקצרים וקבועים אימונוהיסטוכימיה. הרקמה אז מוכתם בα-5 נוגדן ראשוני (יעדים Na + / K + ATPase המכיל תאים) בשיתוף עם נוגדנים משני שמתייג את כל (שניהם קיימים מראש החדש ו) הירוקים השבבים. השימוש בהדמית confocal, שהוכיח כי שבבים קיימים מראש מופיעים צהובים (שכותרתו עם שני לצבוע mitochondrion ספציפי קיימא וα-5) ושבבים חדשים מופיעים ירוק (שכותרתו עם α-5 בלבד). יכולות להיות מיושמות גם טכניקות המשמשות במקביל ללימודי עצבוב, הפצה והפצה של מעגלים משולבים בנימת הזימים דגים כאשר נחשפים לאתגרים סביבתיים.

איור 1 מדגים את שולחן הניתוחים להגדיר (איור 1 א), את המיקום של הדגים במהלך הניתוח (איור 1) ושלושת הצעדים החשובים ביותר לטכניקת צביעת ההפרש הזמן (איור 1 ג). בשלב 1, הדגים נשמרים למשך 30 דקות באמבט מים וסודה של 25 מעלות צלזיוס בחושך. במהלך תקופת 30 דקות, החוקר יכול להכין aliquot צבע mitochondrion העשיר בDMSO אשר מתווסף למים במהלך שלב 2 (איור 1 ג). תקופת הדגירה בשלב 2 מאפשרת ספיגה של הצבע mitochondrion עשיר מהמים לתוך תאי mitochondrion עשיר (כלומר, מעגלים משולבים). הדגים אז יכולים גם לעבור את ההליך מלא בין שתי המדינות denervation או הליך דמה שבו הדגים מורדמים וopercula מניפולציות אבל העצבים יישארו ללא שינוי. הוקם בשלב 3 מייצג חדר התאוששות מסופק עם מים זורמים לדגים שיש eiיס עבר denervation דו-צדדי מלא או הליך &quot;אחיזת עיניים&quot;. לאחר תקופת ההתאוששות, הדגים היו מורדמים והזימים היו נכרת וקבועים אימונוהיסטוכימיה. ההפצה הכוללת והעצבוב של שבבים בנימת הזימים של דגים שעברו הליך &quot;אחיזת עיניים&quot; מתוארת באיור 2. השבבים נמצאים בepithelia filamental כמו גם בבסיס אזורי interlamellar. מופעי איור 2 א שבבים קודם שכותרתו עם צבע mitochondrion העשיר (כלומר, שבבים אלה היו קיימים לפני נהלי denervation / הזיוף בוצעו). איור 2 מציג את סיבי עצב innervating שבבים קיימים מראש ושהוקמו זה עתה (מזוהה על ידי immunoreactivity NKA) של filamental ו epithelia שבשבת. לבסוף, מיזוג של שני התמונות (איור 2 ג) מגלה בבירור שבבים קיימים מראש (מופיע צהוב) ושבבים החדשים (מופיע בירוק).איור 2 ד הוא גרף נציג כימות IC לחוט הלהט המתואר באיור 2 א-ג. בנימה הספציפית הזה, נראה שיש מספר גדול יותר של שבבים התרבו לאחרונה למ&quot;מ 2 מ שבבים קיימים מראש (N = 1). כדי להסיר את המקור של עצבוב branchial חיצוני, עצבי IX ו- X גולגולת (עצבוב חיצוני) נותקו. איור 3 א מציג את אזור הגב של חלל opercular לאחר חוטי הזימים וepithelia מכסה את העצבים הוסרו כדי לחשוף את IX ו- X עצבי גולגולת (מסומנים בספרות רומית) שמשתרעים על פני משני גזעי עצב גדולים למעצבבים את כל ארבע קשתות (איור 3 א); קשתות זימים ממוספרות 1 עד 4. איור 3 ב-E להמחיש denervation סלקטיבית של קשת הזימים הראשונה. קשת הזימים הראשונה innervated על ידי שני עצבי גולגולת IX ו- X (איור 3) אשר ניתן להסירו מבלי להשפיע על העצבוב לשאר of קשתות זימים (איור 3 ג-ה). תוצאות מלאה בין שתי המדינות denervation באובדן הדרגתי של עצבוב חיצוני לחוטי זימים (איורים 4 א-ג). דגי בקרת תערוכת צרור עצבים ברורים אשר משתרע על פני האורך של חוט הלהט (איור 4 א). denervation דו-צדדי מלא הביא כמה אובדן העצבוב חיצוני אחרי 2 ימים של התאוששות (איור 4). היעלמות נוספת של עצבוב חיצוני צוינה לאחר 5 ימים של התאוששות מdenervation (איור 4C). כל עצבוב שנותר לשבבים לאחר 5 ימים של התאוששות כנראה נגזר מעצבים בגוף תא בתוך נימה הזימים (עצבוב פנימי; איור 4C). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" width="600" /> איור 1. ניסיוני להגדיר עבור הליך denervation והרצף של צעדים המשמשים בטכניקת צביעת ההפרש זמן. () שולחן ניתוחים שהוקם להליך denervation מראה טנקי הרדמה והתאוששות. (ב) דוגמא של המיקום של דגים מורדמים, מונשמים. (ג) שלבי מפתח בשימוש בטכניקת צביעת ההפרש הזמן. בשלב 1, הדגים ממוקם במבוקר טמפרטורת אמבטיה, סטטי סודה מים למשך 30 דקות. צבע mitochondrion העשיר מתווסף בשלב 2 לריכוז סופי של 0.1 מיקרומטר והדגים מותר לרחוץ בפתרון למינימום של 4 שעות. זרימת מים תופעל מחדש בשלב 3 ובשלב הדגים עוברים גם denervation מלא בין שתי המדינות של הזימים או ניתוח דמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg" width="600"<html> /&gt; איור 2. micrographs האור מייצג את טכניקת זמן צביעת ההפרש בדג זהב (התאקלמה עד 25 ° C) 2 ימים לאחר denervation דו-צדדי מלא. (א) חלוקת ionocytes קיים מראש (מעגלים משולבים; חיצים). בנימת זימים אחת מתגלה על ידי צביעת צבע mitochondrion העשיר (B) ההפצה של שבבי עצבים (חדשים וקיימים מראש) וbranchial (חיצים מקווקווים) מתגלה על ידי צביעה עם α-5 וZn-12 נוגדנים, בהתאמה. החיצים מצביעים על שבבים (C) החפיפה של (A) ו- (ב) מבחין שבבים קיימים מראש. (מופיע צהוב; שצוינו על ידי ראשי חץ) משבבים התרבו חדש (מופיע ירוק; מסומנים על ידי חצים). הכנס ב( C) הוא הגדלה של ionocyte קיים מראש innervated. גרף נציג של כימות IC לחוט הלהט מוצג בלוחות (AC) (D). בר N = 1. Scale בלוח (C) הוא 50 מיקרומטר וחל על כל הלוחות.&quot;Target =&quot; /ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" width="700" /> איור 3. נציגי תמונות המתארות את השלבים שונים של עצבוב הזימים. תצוגה הגבי () של חלל buccal מראה את עצבי גולגולת IX ו- X innervating כל 4 זימים הקשתות. קשתות זימים ממוספרות 1-4. חוטי הזימים והרקמה המכסה את העצבים הוסרו כדי להמחיש את העצבוב טוב יותר. (B) רח &#39;1 ו -2 קשתות הזימים nd מופרדים לחשוף את איבר החישה והסניפים של עצבי גולגולת IX ו- X innervating הזימים st 1 קשת. רצף (CE) של תמונות המציגות את denervation סלקטיבית של קשת הזימים st 1 על ידי ניתוק הסניפים של עצבי גולגולת IX ו- X. למחדש סכמטימצגת של עצבוב זימים של דגי חוליות, מתייחס לאיור 1 בMilsom et al 26 קווים הלבנים בתמונות הם השתקפות מים מאורות מיקרוסקופ.; הם לא מגדירים את כל מבנה המורפולוגי. בר סולם בפנל (E) הוא 4 מ&quot;מ והוא חל על כל הפנלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" width="700" /> איור 4. micrographs אור המתאר את החלוקה ועצבוב של ionocytes בנימה אחת של קשת הזימים -1 בדג זהב התאקלם עד 25 ° C. Ionocytes (מסומן בראשי חץ) הוכתמו נוגדן α-5 ועצבים (מצויינים בחיצי y) הוכתמו נוגדן Zn-12. (חוט להט) גיל של דגי שליטה מראים צרור עצבים מרכזי יש להניח שמקורו בעצבי IX ו- X (העצבוב חיצוני) עם שבשבת נרחבת הסתעפות. חלק מionocytes הצביע גם innervated (להוסיף) חוט להט. (B) זימים 2 ימים לאחר denervation דו-צדדי מלא. חל קיטון של צרור העצבים המרכזי תוך עצבוב שבשבת הופיע שלם ברובו. (C) זימים נימה 5 ימים לאחר denervation דו-צדדי מלא הוכחה כי עצבוב חיצוני היה במידה רבה נעדרים. ניתוח איכותי עולה כי denervation דו-צדדי מלא גורם להשפלה של עצבוב הזימים החיצוניים, תוך שמירה על עצבים עם גופי תא בנימת הזימים (עצבוב פנימי) יצירת רשת של עצבים באמצעות חוט הלהט ולlamellae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52548/52548fig4highres.jpg" target="_blank">אנא</a>לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish at JoVE.com

A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation.

טכניקת זמן דיפרנציאלי מכתים יחד עם גיל דו-צדדי מלא denervation ללמוד Ionocytes בדגים

Branchial ionocytes (ICs) are the functional units for ionic regulation in fish. In adults, they are found on the filamental and lamellar epithelia of the ...

a-time-differential-staining-technique-coupled-with-full-bilateral

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  University of Ottawa. This manuscript describes a protocol to track the re-distribution of branchial ionocytes and their innervation using a time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation. 

Video: A Time Differential Staining Technique Coupled with Full Bilateral Gill Denervation to Study Ionocytes in Fish

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Neuroscience

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo &#946;-Cell Function

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in &#946;-cell function are associated with hyperglycemia that can lead to diabetes. During the process of insulin secretion, &#946;-cells experience an influx of Ca2+. Thus, imaging the glucose-stimulated Ca2+ influx using genetically encoded calcium indicators (GECIs) provides an avenue to studying &#946;-cell function. Previously, studies showed that isolated zebrafish islets expressing GCaMP6s exhibit significant Ca2+ activity upon stimulation with defined glucose concentrations. However, it is paramount to study how &#946;-cells respond to glucose not in isolation, but in their native environment, where they are systemically connected, vascularized, and densely innervated. To this end, the study leveraged the optical transparency of the zebrafish larvae at early stages of development to illuminate &#946;-cell activity in vivo. Here, a detailed protocol for Ca2+ imaging and glucose stimulation to investigate &#946;-cell function in vivo is presented. This technique allows to monitor the coordinated Ca2+ dynamics in &#946;-cells with single-cell resolution. Additionally, this method can be applied to work with any injectable solution such as small molecules or peptides. Altogether, the protocol illustrates the potential of the zebrafish model to investigate islet coordination in vivo and to characterize how environmental and genetic components might affect &#946;-cell function.

Here, the study presents a protocol for calcium imaging and glucose stimulation of the pancreatic &#946;-cells of the zebrafish in vivo.

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

מדידה בזמן אמת וחוזרת ונשנית של גדילת שרירי השלד אצל דגי זברה חיים בודדים הנתונים לשינויים בפעילות החשמלית

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

הקלטת פעילות עצבית הנגרמת טמפרטורה באמצעות ניטור שינויי סידן נורה חוש הריח של<em&gt; Laevis Xenopus</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one of the first organs to start functioning during development. Mechanisms of blood vessel formation have become a subject of high scientific and clinical interest. In adults however, it is difficult to visualize the vasculature in most living animals due to their localization deep within other tissues. Nevertheless, visualization of blood vessels remains important for several studies such as endocrinology and neurobiology. While several transgenic lines have been developed in zebrafish, with blood vessels directly visualized through expression of fluorescent proteins, no such tools exist for other teleost species. Using medaka (Oryzias latipes) as a model, the current protocol presents a quick and direct technique to label blood vessels in brain and pituitary by perfusing through the heart with fixative containing DiI. This protocol allows improvement of our understanding on how brain and pituitary cells interact with blood vasculature in whole tissue or thick tissue slices.

The article describes a quick protocol for labeling blood vessels in a teleost fish by cardiac perfusion of DiI diluted in fixative, using medaka (Oryzias latipes) as a model and focusing on brain and pituitary tissue.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bioengineering

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Biology

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

הדמיה חיה של מיחזור שלפוחית סינפטית בצומת העצבי-שרירי של דג זברה זחל מנותח

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

טכניקת זמן דיפרנציאלי מכתים יחד עם גיל דו-צדדי מלא denervation ללמוד Ionocytes בדגים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca^{2 +} הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית