J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Protokoll wurden von UT MD Anderson Cancer Center zugelassen. 1. Erzeugung von mTERT-ER Allel <ol><li> Einführung Knock-in-Targeting-Vektor, der die ERT2-LBD (Ligandenbindungsdomäne) vor und im Rahmen mit der mTERT genomische Sequenz (Exon 1 durch Intron 2) und eine Lox - PGK - Neo - Lox-Fragment (1A) in Maus-ES-Zellen mit Elektroporation. </li><li> Kultur die ES-Zellen in Neomycin für 6-10 Tage. Wählen Neomycin-resistenten Klone und in 48-Well-Platten erweitern. Entpacken Sie die genomischer DNA unter Verwendung eines kommerziellen Kits und bestätigen Sie die Knock-In-Allels durch Southern Blot. </li><li> Spritzen Sie zwei ES-Linien mit mehr als 95% normalen Karyotyp in C57BL / 6-Blastozysten mit einer Mikromanipulation Satz unter einem inversen Mikroskop. Implantieren die Blastozysten in die Gebärmutter der Leihmutter 23. Kamerad die hochwertigen männlichen Chimären (70-90%) auf C57BL / 6 feMänner. </li><li> Bestätigen Sie die Genotypisierung von heterozygot mTERT-ERneo Tiere durch Southern Blot. </li><li> Kamerad die heterozygot mTERT-ERneo Tiere und EIIA-Cre Tieren, die NeoR Kassette zu löschen. Kamerad die heterozygote Tiere in C57BL / 6 Tiere für mindestens drei Mal, und weitere inter Rasse heterozygot mTERT-ER Tiere Homozygotie zu generieren. </li></ol> 2. Erzeugung von LSL-mTERT Allel <ol><li> Führen Sie das Knock-in-Targeting-Vektor, der ein LoxP - Dreifach-Stopper - Neo - LoxP Fragment und die mTERT genomische Sequenz (zwischen Exon 1 und Intron 2, 1B) in Maus-ES-Zellen mit 23 Elektroporation. </li><li> Kultur die ES-Zellen in Neomycin für 6-10 Tage. Wählen Neomycin-resistenten Klone und in 48-Well-Platten erweitern. Entpacken Sie die genomischer DNA unter Verwendung eines kommerziellen Kits und bestätigen Sie die Knock-In-Allels durch Southern-Blot-23. </li><li> Inject zwei ES-Linien mit mehr als 95% normalen Karyotyp in C57BL / 6-Blastozysten mit einer Mikromanipulation Satz unter einem inversen Mikroskop. Implantieren die Blastozysten in die Gebärmutter der Leihmutter 23. Kamerad die hochwertigen männlichen Chimären (70-90%) auf C57BL / 6-Weibchen. </li><li> Bestätigen Sie die Genotypisierung von heterozygot LSL-mTERT Tiere durch Southern Blot. </li><li> Kamerad die heterozygote Tiere in C57BL / 6 Tiere für mindestens drei Mal, und weitere inter Rasse heterozygot LSL-mTERT Tiere Homozygotie zu generieren. </li></ol> 3. Reaktivierung der Telomerase in mTERT-ER und LSL-mTERT Mäusen in vivo Für mTERT-ER <ol><li> Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Injektion. </li><li> Anesthetize der Mäuse mit Isofluran Kammer (4% zur Einleitung, 2% zur Aufrechterhaltung) in 50% (v / v) Sauerstoff / 50% (v / v) Distickstoffmonoxid Gasgemisches. Oder betäuben Mäusen durch eine Ketamin-Xylazin-Gemisch (100 mg / kg Körpergewicht + 10 mg / kg Körpergewicht). </li><li> Nach tiefer Narkose erreicht ist, entfernen Sie den narkotisierten Tier aus der Induktionskammer, und halten Sie den Kopf in der Röhre auf die Isofluran Kammer (2%) verbunden sind. </li><li> Klemmen Sie die Dämpfer der Mäuse, um sicherzustellen, das Tier tief anästhesiert. Setzen Salbe auf beiden Augen, um die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. Reinigen Sie die Rückseite der Mäuse, die mit PVP-Jod-Lösung. </li><li> Spritzen Sie die langsam frei 4-OHT Pellet mit Präzision Trokar (10 G) unter die Haut des Rückens und drücken Sie den Pellet bis hin zu der Mittellinie zwischen zwei Schultern. </li><li> Verschließen Sie den Schnitt mit Wundklammerapplikations und Überwachung der Mäuse aus der Narkose. Die Clips 10 Tage später entfernen. Zusätzliche Wärme ist nicht erforderlich, weil das Verfahren kurz beendet. </li><li> Zeitraum der Behandlung mit 4-OHT Pellet sollte entsprechend dem Zweck der Untersuchung optimiert werden. </li></ol> Für LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> Tamoxifen (10 mg / ml, in Maisöl gelöst) intraperitoneal zwei aufeinanderfolgenden Tagen injiziert (200 ul / 25 g / Tag). </li></ol> 4. Isolierung von neuralen Stammzellen und Reaktivierung der Telomerase in vitro- <ol><li> Mäuse mit Kohlendioxid getötet und die Gehirne werden entfernt. Folgen Sie dem Protokoll von handelsüblichen Nervengewebe Dissoziation Kit nach Hersteller. </li><li> Resuspendieren gefriergetrocknetes Pulver in der Flasche für Lösung 4. beschriftet Lösung 4 mit 1 ml Zellkulturmedium nicht vortexen. Diese Lösung soll dann aliquotiert und bei -20 ° C für die spätere Verwendung gespeichert werden. </li><li> Vorwärmen des Gemischs bei 37 ° C für 15 min vor der Verwendung. </li><li> Stellen Enzyme Mix 1: Lösung 1 (50 ul) und Lösung 2 (1900 ul). Stellen Enzyme Mix 2: Lösung 3 (20 ul) und Lösung 4 (10 ul). </li><li> Bereiten 1950 ul Enzymmischung 1 für bis zu 400 mg Gewebe und Wirbel. Vorheizen des Gemisches bei 37 ° C für15 min vor der Verwendung. </li><li> Nehmen Sie die 1-Tages-Gehirn der Maus, und halten Sie die Vorderhirne durch Entfernen der Riechkolben und das Kleinhirn. Halten Sie die Vorderhirngewebe in 1 ml kaltem Kulturmedium, da die Entfernung und Speicherung in 4 ° C. Achten Sie auf die Nervengewebe innerhalb 1 Stunde zu verarbeiten. </li><li> Bestimmen Sie das Gewicht des Gewebes, um sicherzustellen, dass der Grenzwert von 400 mg pro Verdauung nicht überschritten wird. Stellen Sie das Gehirn auf den Deckel eines 35 mm Durchmesser Petrischale, und quetschen Sie das Gehirn mit einem Skalpell. </li><li> Mit einer 1 ml Pipettenspitze, 1 ml HBSS (w / o Ca / Mg) und Pipetten Stücke wieder in einen 15-ml-Tube. Spülen Sie mit HBSS (w / o Ca / Mg). Zentrifugation bei 300 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und saugen Sie den Überstand vorsichtig. </li><li> Hinzufügen 1.950 ul vorgewärmter Enzymmix 1 (Lösungen 1 und 2) je bis zu 400 mg Gewebe. Inkubieren in der 15-ml-Röhrchen für 15 min bei 37 ° C, Mischen durch Umdrehen oder Schütteln der Röhre im Abstand von 5 min. </li><li> Bereiten Sie 30 ul Enzymmischung 2 pro Gewebeprobe durch Zugabe von 20 &amp; #956; l Lösung 3 bis 10 &amp; mgr; l der Lösung 4. Dann auf Probe hinzuzufügen. Kehren Sie zum Mischen leicht. Nicht mit dem Vortex. </li><li> Distanzieren Gewebe mechanisch mit einer breiten bestückt, feuerpolierten Pasteur-Pipette pipettiert und ab 10-mal langsamer. Vermeiden Sie Luftblasen bilden. </li><li> Bei 37 ° C für 10 min, Umdrehen des Röhrchens alle 3 min. </li><li> Wiederholen Sie den Schritt Schritt 4.11 und 4.12, wenn die Gewebe sind größer als 200 mg. </li><li> Anwenden der Zellsuspension auf eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb, auf einem 50-ml-Röhrchen platziert. Übernehmen 10 ml PBS durch Zellsieb. Verwerfen Zellsieb zentrifugieren Zellsuspension bei 300 g für 20 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen vollständig. </li><li> Die Zellen mit Stammzellmedium auf das erforderliche Volumen für weitere Anwendungen. </li><li> Um Telomerase in LSL-mTERT NSCs aktivieren, behandeln Sie die Zellen mit 100 pM 4-OHT für zwei Tage. Um Telomerase in mTERT-ER NSCs zu aktivieren, halten Sie die Zellen in Kulturmedium mit 100 &amp; mgr; M 4-OHT. </li></ol> 5. Telomere FISH <ol><li> Bereiten Sie die Metaphasechromosomen aus kultivierten Zellen. </li><li> Für FFPE (Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten) Gewebeschnitte entparaffinieren in Xylol und rehydrieren in Ethanolreihe für jeweils 5 Minuten (100%, 90%, 70%, 50% Ethanol) und PBS für 5 min. </li><li> Post-Update in dem Methanol: Essigsäure (3: 1) für 1-2 Std. Entwässern in kaltem Ethanol Serie 5 min jeder (70%, 90%, 100% Ethanol) und an der Luft trocknen. Waschen in 1 × PBS bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Denaturieren Chromosomen in 4% Formaldehyd bei 37 ° C für 2 min. Entwässern in kaltem Ethanol Serie 5 min jeweils (70%, 90%, 100% Ethanol) und an der Luft trocknen. </li><li> Bewerben 12-25 ul der PNA Hybridisierungsmischung zu jeder Folie. (Hybridisierungsmischung: 70% Formamid, 0.06x SSC, 0,2% BSA, 0,5 ng / &amp; mgr; l tRNA, 0,5 ng / ul Telomer oder Centromersonden) </li><li> Dichten Sie das Deckglas mit Gummi-Zement. Post-denaturierte chromosomale Minipreps und Gewebeschnitte bei 80 ° C für 4 min. Die Hybridisierungs bei Raumtemperatur oder 37 ° C für 2-4 Stunden in der feuchten Kammer. </li><li> Bei Raumtemperatur mit Waschpuffer 2 x 15 min Waschen. (Waschpuffer: 70% Formamid, 0.06x SSC, pH 7,2). Mit PBST waschen bei Raumtemperatur 3 x 5 min. Gegenfärbung Objektträger mit DAPI oder weit rote Fluoreszenz für die mikroskopische Untersuchung. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Wir berichten hier die Erzeugung von zwei induzierbare murine Telomerase Allele und wie Telomerase in vivo und in vitro zu aktivieren. Der entscheidende Schritt zur Reaktivierung mTERT-ER-Aktivität ist es, eine kontinuierliche Konzentration von Tamoxifen zu halten, so dass wir uns entscheiden, 4-OHT Zeit-Release-Pellets von Innovative Research of America hergestellt zu verwenden. Die Pellets halten Freigabe 4OHT in einem stationären Zustand Blutspiegel von 1 ng / ml für bis zu 60 Tage. In einer früheren Untersuchung wurde gezeigt, dass die Reaktivierung Telomeraseaktivität mit dieser Strategie konnte die degenerative Phänotypen wie Stammzellenerschöpfung Beeinträchtigung der Gewebeverletzung antwortet und Organversagen in mehreren Organen, die durch Telomerdysfunktion in G4 mTERT ER / ER induziert wurden, zu verbessern Mäuse 20. Andere als die Untersuchung der Funktion der Telomerase in Alterung können diese beiden induzierbaren Telomerase Allele auch verwendet, um Krebs zu untersuchen. Frühere Studien habenVorteil dieser Allele, die Rolle der Telomere Abrieb und Telomerase Reaktivierung bei der Gestaltung der Genome und Auswirkungen auf die Biologie von T-Zell Thymuslymphom 21 und Prostatakrebs 22 erkunden. Diese beiden Studien zeigten, dass Telomerdysfunktion Ende Generation G4 Atm - / - mTERT ER / ER und G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L Mäusen stellt einen Mechanismus treibt die Übernahme von Anfang mutagene Ereignisse für Tumor-Initiation, noch verhindert Progression voll bösartigen Tumoren. Wenn die Telomerase wurde im Rahmen der Telomerdysfunktion induzierte genomische Instabilität, DNA-Schaden-Checkpoints und zügellose chromosomale Instabilität reaktiviert wurden unterdrückt, was die vollständige Progression von malignen Tumoren mit neuen biologischen Eigenschaften wie Knochenmetastasen von Prostatakrebs 21 und Gehirn Infiltration Thymi erlaubtc Lymphom 21. Ähnliche Phänomene wurden auch bei anderen Krebsarten wie Darmkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs (persönliche Kommunikation mit Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin und Ronald DePinho) beobachtet. Weil TERT-ER-Protein kann leicht zwischen Ein und Aus-Zuständen in Abhängigkeit davon, ob die Tiere mit Tamoxifen oder Vehikel behandelt umgeschaltet werden, können die Tumormodellen von mTERT-ER-Allel erzeugt verwendet werden, um anti-Telomerase-Therapie zu testen. In früheren Studie, in G4 Geldautomaten erzeugten Tumoren - / - mTERT ER / ER Tiere wurden von 4-OHT veröffentlicht; auf Telomerase Erschöpfung, Tumoren schließlich schrumpfte aufgrund der Wiedereinstellung von Telomerdysfunktion induzierten Checkpoints 21. Doch einige der erworbenen Resistenz in Reaktion Tumoren bis zur Ausrottung durch die Aktivierung eines alternativen Verlängerung von Telomeren (ALT) Mechanismus Telomerase. Die weitere Charakterisierung dieser ALT + resistenten Tumoren zeigte, dass they haben anomale Transkription von Genen im mitochondrialen Biologie und oxidative Abwehr mit einem Master-Regulator der Synthese und der mitochondrialen oxidativen Abwehr PGC-1β beteiligt. Knockdown von PGC-1β oder SOD2 (ein weiterer Regulator des oxidativen Abwehr) deutlich macht ALT + Tumorzellen, während halten Telomerase + Tumorzellen relativ intakt 21 bleiben. Eine Einschränkung dieser beiden Knock-in-Allele ist, dass sie sich nur leisten Reaktivierung Telomerase endogenen Spiegel, weil sie im nativen Locus des Telomerase-Gens sind. In den meisten Krebsarten geht Telomerase tatsächlich auf einem viel höheren Niveau überexprimiert. Um das Niveau der Telomerase zu verbessern, ist eine Modifikation können wir betrachten die mTERT-ER-Konstrukt mit einem stärkeren Promotor wie PGK (Phosphoglyceratkinase) -Promotor in Rosa26 Locus einzufügen. Abschließend die beiden neuartigen induzierbaren Maus Telomerase Allele bieten beispiellose genetic Werkzeuge, um die Funktionen der Telomerase in Alterung und Gewebshomöostase sowie die Tumorprogression insbesondere unter dem Hintergrund der zuvor erfassten Telomerdysfunktion induzierte genomische Instabilität studieren. Die mTERT-ER-Allel kann auch verwendet werden, um anti-Telomerase-Therapie durch die Kreuzung in andere tumor anfällig Maus-Modellen untersucht werden.

Telomerase ist ein für die Aufrechterhaltung der Telomere verantwortliche Enzym. Dies sind repetitive Sequenzen an den Enden der Chromosomen, die ihre Integrität zu schützen. Die Kernkomponenten von Telomerase-Holoenzym eine katalytische Untereinheit der Reversen Transkriptase (TERT) und eine RNA-Untereinheit (TERC), das als Vorlage dient zum Addieren des Telomerabschnitten 1,2. Während in der Regel in differenzierten Körperzellen unterdrückt, zeigt Telomerase robuste Aktivität und spielt eine wichtige Rolle bei der Keimzellen, Krebszellen und Stammzellen. mTERC und mTERT Knockout-Mäuse bieten große in vivo Modellsystemen, um die Funktionen der Telomerase in beiden Stammzellen und Krebs zu untersuchen. Die mTERC und mTERT Knockout-Mäusen (G1) brachte keine offensichtlichen Phänotypen aufgrund der langen Rücklage der Telomere bei Mäusen 3 zeigen. Allerdings seriell Kreuzung mTERC und mTERT Knockout-Mäusen zu spät Generation (G5-G6) führteprogressive Erosion der Telomere und schließlich provoziert schwere Degeneration der hoch proliferativen Gewebe 4. Späten Generation (G5-G6) mTERC - / - Mäuse sind unfruchtbar aufgrund der hohen Raten von Apoptose in Hoden und Keimzellverarmung. G5-G6 mTERC - / - Mäusen degenerative Phänotypen in hoch proliferativen Geweben wie Knochenmark, Darm und Haut weisen auch aufgrund der hohen Raten von Apoptose und defekte Selbsterneuerungsfähigkeit in Gewebe Stammzellen / Vorläuferzell Fächer 4. Hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark in der letzten Generation mTERC - / - Mäuse weisen Verlust der Teilungsfähigkeit, beeinträchtigt Selbsterneuerungsfähigkeit, verstärkte Apoptose und schließlich funktionale Erschöpfung 5,6. - / - Mäusen 7,8 Ebenso wurden schrittweise erhöht apoptotische Körper in Darmkrypten in jeder neuen Generation von G1-G6 mTERC beobachtet. Ter schädliche Wirkung von dysfunktionalen Telomeren scheint nicht zu einer hohen Fluktuation Gewebe, da sowohl die Proliferation von adulten neuralen Stammzellen in vitro und der Neurogenese in vivo wurden Ende Generation (G4-G5) stark beeinträchtigt begrenzt mTERC - / - Mäuse 9 . Die Rolle der Telomerase in Stammzellen wird durch die Ergebnisse in einem seltenen menschlichen Erbkrankheit Dyskeratosis congenita (DKC), die in gewisser Weise ähnelt vorzeitiger Alterung 10,11 unterstützt. DKC wird durch Mutationen im TERC, TERT, und Gene, die Dyskerin, einen Kern Telomerase-Untereinheit und andere Dyskerin assoziierte Proteine ​​codieren 12 verursacht. Im Durchschnitt Telomere in DKC Patienten sind kürzer als 99% der bei gleichaltrigen Kontrollen. Der Hauptmorbiditäts liegt an aplastischer Anämie, die durch mangelhafte Wartung von hämatopoetischen Stammzellen verursacht wird. Andere Aspekte der Krankheit, wie oralen Leukoplakie, Nageldystrophie, geistige retardatiauf, Hoden-Atrophie und Lungenkomplikationen alle schlagen Ende Generation von Telomerase-Knockout-Mäusen Funktionsstörungen von Gewebestammzellen und Vorläuferzellen 10, Erkenntnisse in enger Abstimmung mit diesen. DKC Patienten neigen zu myelodysplastischem Syndrom und haben eine erhöhte Prävalenz von malignen Neoplasmen Schleimhaut. So Mangel der Telomerase in menschlichen Patienten rekapituliert die Mängel der Stammzellfunktionen und Tumor Veranlagung, die Ende Generation Telomerase-Knockout-Mäusen beobachtet. Kurze Telomere und eine hohe Telomerase-Aktivität sind die Markenzeichen von Krebs. Als normal oder prämalignen Zellen teilen, die langsam oder gar nicht Telomerase-Aktivität führt zu eventuellen Erosion der Telomere und Aktivierung von zellulären Kontrollpunkten ähnlich denen von DNA-Doppelstrang-Brüche (DSBs) 13 ausgelöst. Wie klassische DSBen hat Telomerdysfunktion wurde gezeigt, dass p53 zu induzieren und zugehörige zelluläre Antworten, wie zum Beispiel Alterung und / oder apoptosis 14,15. Bei Mutations Inaktivierung von p53, sind Zellzyklus und das Überleben der Zellen in Zellen mit Telomer-Dysfunktion, die eine pro-karzinogene Mutator Mechanismus gekennzeichnet durch Translokationen und regionalen Amplifikationen und Deletionen 16,17 bietet verbesserte. Gleichzeitig weiterhin Telomerdysfunktion und zugehörige grassiert chromosomale Instabilität (auch in p53 Nullzellen) scheinen Voll malignen Progression derartiger Krebs beschränken. So spät Generation G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - Mäuse zeigten im Vergleich zu Ink4a / Arf-null-Mäusen durch Telomer-Abrieb erheblich reduziert Lymphoma-Inzidenz. In einer anderen Studie erweiterte adenomatöse Läsionen in G4 mTERT - / - APC min Mäusen wurden stark im Vergleich zu APC min Mäuse aufgrund erheblicher Wachstumsarrest und Apoptose 18,19 drückt. DieBeobachtung, dass Telomerdysfunktion induzierte genomische Instabilität hemmt Tumorprogression fordert den Spekulationen, dass die Aktivierung der Telomerase kann maligne Progression teilweise durch Niederschlagung genomische Instabilität auf ein Niveau mit Krebszelllebensfähigkeit und / oder Neutralisations p53-abhängige oder -unabhängige Checkpoint Mechanismen, zu ermöglichen. Um zu untersuchen, ob Telomerase Reaktivierung kann stoppen oder sogar umkehren Alterung von Stammzellen, und ob Telomerase Reaktivierung können die Tumorentstehung vor dem Hintergrund der genomische Instabilität fördern erzielten wir zwei induzierbaren Maus Telomerase-Allele. Die erste ist 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -induzierbaren TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) Fusion Knock-in-Allel. In Abwesenheit von 4-OHT, Mäuse, die homozygot für mTERT-ER (bezeichnet mTERT ER / ER) Telomerase-Aktivität defizient und aufrechtzuerhalten gleichen zytogenetischen und zellulären Phänotypen als herkömmliche mTERT oder mTERC Knockout-Modell. Nach 4-OHT Behandlung kann TERT-ER-Protein-Aktivität auf ein Niveau vergleichbar mit dem nativen Protein TERT 20, 21 wieder hergestellt werden. Die zweite Allel ist eine neuartige induzierbaren TERT Knock-in-Allel, das eine intro LoxP-Stopper-LoxP Kassette (LSL- mTERT); nach Cre-vermittelte Exzision LSL, mTERT unter endogene Expression Kontrollmechanismen 22 erneut zum Ausdruck gebracht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

Telomerdysfunktion bedingte Verlust der Genomintegrität und die damit verbundenen DNA-Schäden Signalisierung und Checkpoint Reaktionen sind gut etablierte Treiber, die Gewebedegeneration während der Alterung verursachen. Krebs, mit Inzidenzraten stark mit dem Alter zunimmt, wird durch kurze Telomerlängen und hohe Telomerase-Aktivität aus. Um die Rolle von Telomerdysfunktion und Telomerase-Reaktivierung in Alterung und Krebs zu untersuchen, zeigt das Protokoll, wie man zwei Mäuse induzierbaren Telomerase erzeugen Knock-in-Allele 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -induzierbaren TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) und Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Das Protokoll beschreibt die Verfahren zur Telomerdysfunktion induzieren und zu reaktivieren Telomerase-Aktivität in mTERT-ER und LSL-mTERT Mäusen in vivo. Die repräsentativen Daten zeigen, dass die Reaktivierung der Telomerase-Aktivität kann die Gewebe degenerative Phänotypen von Telomerdysfunktion induzierte verbessern. In order, um die Auswirkungen der Telomerase Reaktivierung auf die Tumorentstehung zu bestimmen haben wir einen Prostatatumor-Modell G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L und Thymus-T-Zell-Lymphom-Modell G4 Atm - / - mTERT ER / ER . Die repräsentativen Daten zeigen, dass die Telomerase-Reaktivierung in der Kulisse der genomische Instabilität durch Telomerdysfunktion induzierte eine wesentlich bessere Tumorgenese. Das Protokoll beschreibt auch verwendet werden, um neurale Stammzellen (NSCs) aus mTERT-ER und LSL-mTERT Mäusen zu isolieren und zu reaktivieren Telomerase-Aktivität in NSCs in vitro Verfahren. Die repräsentativen Daten zeigen, dass die Reaktivierung der Telomerase kann die Selbsterneuerungsfähigkeit und Neurogenese in vitro zu verbessern. Schließlich beschreibt das Protokoll der Modalitäten für die Durchführung der Telomere FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) auf beiden Maus FFPE (Formalin fixiert und Paraffin Embedded) Hirngewebe und Metaphasechromosomen von kultivierten Zellen.

Die Strategien murine mTERT-ER zu erzeugen und LSL-mTERT-Knock-in-Allele wurden in 1A und 1B beschrieben. Insbesondere wird ein LoxP - Dreifach Stopper - Neo - LoxP Fragment wurde zwischen Exon 1 und 2 von mTERT Locus eingefügt, um LSL-mTERT Allel zu generieren. Um mTERT-ER-Allel zu erzeugen, wurde ERT2-LBD-Domäne im Leseraster mit dem mTERT-Gen in den N-Terminus des Exons 1 eingeführt Wir haben gezeigt, dass, wenn die Telomerase wurde transient in Telomerdysfunktion Mäusen durch Behandlung mit 4-OHT-Pellets für 4 reaktiviert Wochen konnten die degenerative Phänotyp in mehreren Organen, wie Gehirn (2A) und Hoden (2B) gelindert werden. Um die Auswirkungen der Telomerase Reaktivierung auf Zellen in vitro kultiviert bestimmen isolierten wir neurale Stammzellen (NSC) von Ende Generation G4 LSL-mTERT und G4 mTERT-ER Mäusen. Wir haben gezeigt, dass, wenn die Telomerase wurde in Telomer dysfunktionalen NSC reaktiviert wurde das Selbsterneuerungsfähigkeit des NSC stark erhöht (Figur 3A) und in vitro-Neurogenese wurde ebenfalls signifikant verbessert (Abbildung 3B). Um die Wirkung der Telomerase Reaktivierung auf die Tumorgenese im Rahmen Telomerdysfunktion bestimmen erwirtschafteten wir PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L (Prostata-Tumor-Modell) und Geldautomaten - / - mTERT ER / ER (Thymus-T-Zell-Lymphom-Modell) späten Generation Kohorten. Wenn die Telomerase wurde durch Tamoxifen-Behandlung dieser Mäuse mit Injektion (Figur 4A) oder 4-OHT-Pellets für 8 Wochen (4B) reaktiviert wurde die Tumorgenese stark sowohl in Prostata-Tumormodell (4A) und Thymus-T-Zellen-Lymphom-Modell verbessert ( <strong&gt; 4B). Schließlich berichteten wir, die Protokolle zur Durchführung der Telomere FISH auf FFPE Maus Hirngewebe (Abbildung 5) und Metaphasechromosomen (Abbildung 5, Einschub). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Abbildung 1: (A) mTERT-ER Knock-in-Strategie. TV, Targeting-Vektor; WT, Wildtyp-Allel; KI, Knock-in-Allel; LA, linken Arm; RA, den rechten Arm; E1, Exon 1; E2, Exon 2; neo, pgk Promotor getriebene Neomycin-Resistenzgen; ER, modifizierten Östrogenrezeptor (ERT2) Ligandenbindungsdomäne; DT, dyphteria Toxin-Gen. (B) LSL-mTERT Knock-in-Strategie. TV, Targeting-Vektor; WT, Wildtyp-Allel; KI, Knock-in-Allel; LA, linken Arm; RA, den rechten Arm; E1, Exon 1; E2, Exon 2; neo, pgk Promotor getriebene Neomycin-Resistenzgen; STOPPER, drei sich wiederholenden Transkriptionsstoppsequenzen; DT, dyphteria Toxin-Gen. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Daten zur Telomerase Reaktivierung zeigen bessert degenerative Phänotypen von Organen Vertreter Bilder von Gehirnen (links). und Hoden (rechts) von G0 und G4 mTERT-ER-Mäusen mit Placebo oder 4-OHT für 4 Wochen behandelt. Maßstabsbalken zeigen 50 um. Re-Print mit Genehmigung von 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Abb. 3: Repräsentative Daten zur Telomerase Reaktivierung zeigen, steigert Selbsterneuerung und Neurogenese von neuralen Stammzellen in vitro (A) Repräsentative Bilder von neuronalen Stammzellens von G4 LSL-mTERT isoliert (oberes Bild) und G4 mTERT-ER (unteres Bild) wächst in der Stammzellmedium mit Fahrzeug oder 4-OHT behandelt. (B) Repräsentative Bilder der in vitro-Neurogenese (TuJ1 +) von neuronalen Stammzellen aus G4 mTERT-ER in Differenzierungsmedium kultiviert isoliert (mit 1% FBS) mit Fahrzeug-oder 4-OHT behandelt. Maßstabsbalken zeigen 100 um. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Abb. 4: Repräsentative Daten zur Telomerase Reaktivierung zeigen verbessert Tumorentstehung vor dem Hintergrund der genomische Instabilität (A) Repräsentative Bilder von Prostatatumoren von G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT seziert +/-, G4 PB Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT- / - Und G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L mit Tamoxifen behandelt. Re-Print mit Genehmigung von 22. (B) Repräsentative Bilder der Thymus-T-Zell-Lymphome aus G0 Atm seziert - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER mit Vehikel und G4 Atm - / - mTERT ER / ER mit 4- behandelt 8 Wochen OHT. Maßstabsbalken zeigen 1 cm. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Abbildung 5: Repräsentative Bilder der Telomer und Zentromer-FISH auf FFPE Maus Hirngewebe und Metaphase (kleines Bild). Rot bedeutet, DNA, grün zeigt Telomer-Färbung und Cyan zeigt centromere Färbung. Maßstabsbalken zeigen 1 mm.

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Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Verwendung Murine induzierbare Telomerase Allele in den Studien von Tissue Degeneration / Regeneration und Krebs

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Aufrufe.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 