هذه الطريقة يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التيلوميرات، مثل الخميرة التيلmeric noncoding الحمض النووي الريبي تيرا المترجمة، وأستطيع أن أصر على أنه تيلومير من أصل أو في عبر، وكروم مانت مختلفة الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يسمح للباحثين لتصور جزيئات تيرا التعبير عن من التيلومير واحد في الخلايا الحية. سيكون إثبات الإجراء هو كلاوديو أوس بيغور ونيكول بيتين، وهما طالبان دراسات عليا من مختبري. لبدء تنمو الخلايا AGS وفقا لبروتوكول النص.
ثم عندما تصل الخلايا 50 إلى 60٪ التقاء عبر الالتقاء لهم مع SgRNA Cas9 التعبير عن ناقلات وMS2 كاسيت. في اليوم التالي استبدال المتوسطة زراعة مع المتوسطة التي تحتوي على النيومايسين. بعد هذا إضافة 10 ميكرولترات من 0.25٪ Tripsyn إلى كل بئر من 96 بئر لوحة.
باستخدام المجهر وعلامة، وضع علامة على موقف كل استنساخ مرئية في الطبق. استبدال النيوميسين زراعة المتوسطة مع برنامج تلفزيوني ما يكفي لتشكيل طبقة رقيقة من السائل على استنساخ. باستخدام ماصة 10 ميكرولتر تحتوي على خمسة ميكرولترات من تريبسين، ببطء الافراج عن التربسين على المستعمرة.
السماح لـ Trypsin بفصل الخلايا لمدة دقيقة واحدة. كشط المستعمرة مع طرف، وامتص حتى في طرف. بعد ذلك، نقل الخلايا من مستعمرة إلى بئر من 96 لوحة البئر.
احتضان لوحة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم املأ البئر بـ 150 ميكرولترات من المتوسط الانتقائي. بعد ذلك، إضافة 100 ميكرولترات من الجيلاتين إلى كل بئر من ثلاث 96 لوحات جيدا.
احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، وغسل لوحات مع برنامج تلفزيوني مرتين. بعد أن تصل إلى استنساخ 90٪ التقاء، التعرق المتوسطة من كل بئر من لوحة، وغسل لوحة مع برنامج تلفزيوني. ثم إضافة 30 ميكرولترات من تريبسين إلى كل بئر، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك، إضافة 70 ميكرولترات من المتوسط الانتقائي لكل من الآبار. تعطيل الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. نقل 30 ميكرولترات من الخليط إلى بئر من لوحة الحمض النووي الجيلاتية التي تحتوي على 120 ميكرولترات من المتوسطة انتقائية.
ثم نقل 30 ميكرولترات من الخليط إلى لوحة تجميد الجيلاتينية التي تحتوي على 50 ميكرولترات من المتوسط. وضع الحمض النووي في الحاضنة، والسماح للخلايا لتنمو في 37 درجة مئوية حتى تصل إلى 90٪التقاء. بعد ذلك، إضافة 80 ميكرولترات من الجليد تجميد المتوسطة الباردة إلى كل بئر من لوحة تجميد.
ختم لوحة مع parafilm، واستبدال الغطاء، والتفاف لوحة في رقائق الألومنيوم. ثم الحفاظ على لوحات تجميد في 80 درجة مئوية. بعد أن تصل المستنسخات في لوحة الحمض النووي إلى 90٪ من الالتقاء ، اغسل اللوحة مع PBS مرتين.
ثم lyse الخلايا مع 50 ميكروليترس من العازلة Lysis. غطي الطبق بالبارا فيلم، واستبدل الغطاء، ولف الطبق في غلاف ساران. بعد هذا، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي إضافة 100 ميكرولترات من محلول كلوريد الصوديوم الإيثانول إلى كل بئر، والسماح للحمض النووي هطول الأمطار لمدة ست ساعات أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. ثم عكس لوحة وغسلها ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ في البئر. إضافة 20 ميكرولترات من RNase A حل لكل بئر من لوحة، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك، استخدم ثلاثة ميكرولترات من الحمض النووي الجينومي لتضخيم PCR، وإعداد جهاز PCR. تنمو استنساخ PCR إيجابية في ستة لوحات جيدا وفقا لبروتوكول النص. مرة واحدة في استنساخ تصل إلى 90٪ التقاء، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 250 ميكرولترات من العازلة تحلل مع البروتينات K إلى كل بئر.
استخدم مكشطة خلية لتكشط الخلايا، ونقل الLysate إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. احتضان ال ليسات في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. إضافة ملليلتر واحد من الإيثانول إلى ليسات، ويهز بقوة.
السماح للمستنسخين بالنمو في F-12K المتوسطة وفقا لبروتوكول النص. ثم إضافة الفيروس الغدي كريس التعبير عن الخلايا بمجرد أن تصل إلى التقاء 70٪. بعد 48 ساعة من العدوى، قسمت الخلايا إلى ثلاثة أطباق طولها 10 سنتيمترات.
ثم ثقافة الأطباق الثالثة لتجميد الخلية، واستخراج الحمض النووي الريبي. أولا، لوحة استنساخ TERRA-MS2 وخلايا AGS نوع البرية في أطباق القاع الزجاج. ثم إضافة بوليبرين وMS2-GFP التعبير عن الفيروس الرجعي إلى المتوسطة.
بعد 24 ساعة تجاهل المتوسطة التي تحتوي على الفيروس الرجعي، وإضافة المتوسطة الطازجة دون الحمراء الفينول إلى الخلايا. وأخيرا ، وذلك باستخدام المجهر المقلوب وصورة كاميرا حساسة الخلايا مع الهدف المناسب والفتحة. في هذا البروتوكول تم إنشاء استنساخ الخلايا السرطانية التي تحتوي على علامة تسلسل MS2 في فرعي واحد وصور.
تم فحص المستنسخات المقاومة للنيومايسين باستخدام PCR. وكانت الحيوانات المستنسخة الإيجابية مُثقَة في تحلل لاستخراج الحمض النووي الجينومي وتحليل البقعة الجنوبية. وقد أصيبت المستنسخات الإيجابية ل PCR وتحليل البقعة الجنوبية مع CRE-GFP التعبير عن الفيروس أدينو من أجل إزالة الجين Neomycin الموجودة في كاسيت MS2.
وبمجرد تأكيد القضاء على الجين المقاومة النيومايسين، تم اختبار الحمض النووي الريبي المستخرج من استنساخ للتعبير عن نصوص TERRA-MS2. من أجل تصور النصوص TERRA-MS2 في الخلايا الحية عن طريق المجهر confocal، تم إصابة المستنسخين المختارين بفيروس رجعي يعبر عن بروتين اندماج MS2-GFP. تم تصور نصوص TERRA-MS2 والتيلوميرات في وقت واحد في الخلايا الحية عن طريق المجهر confocal عن طريق المشاركة في التعبير عن بروتين الانصهار MS2-GFP وmCherry تنصهر بروتين الربط التيلومير، TRF2، في المستنسخات المختارة.
عند محاولة هذا الإجراء من المهم بذل كل جهد ممكن لتحديد استنساخ واحد بدلا من مجموعة مختلطة من المستنسخين. بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل FISH DNA على ينتشر الكروموسوم، من أجل تصور التكامل بين كاسيت MS2 في خلايا ثابتة. بعد تطورها ، قد تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التيلومير لاستكشاف التوطين الخلوي لجزيئات التيلومير TERRA الفردية في الخلايا البشرية الحية.
لا تنس أن العمل مع ناقلات الفيروسية والمواد المشعة يمكن أن تكون غير مؤكدة للغاية. وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء معاطف المختبر، والقفازات واستخدام دروع زجاج شبكي للحد من الإشعاع عند تنفيذ هذا الإجراء.
