Name: utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
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J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

注：このプロトコルのすべてのステップは、UT MDアンダーソンがんセンターによって承認されている。 mTERT-ER対立遺伝子の1世代<ol><li>マウスのES細胞に液体酸素断片（ 図1A） - PGK - - ネオノックインERT2-LBD（リガンド結合ドメイン）を含むベクトル上流とmTERTゲノム配列（イントロン2を通じてエクソン1） および LOXとインフレームでをターゲットに紹介エレクトロポレーションを持つ。 </li><li> 6-10日間の培養のネオマイシンでES細胞。ネオマイシン耐性クローンをピックアップし、48ウェルプレートで展開します。市販のキットを用いてゲノムDNAを抽出し、サザンブロットによってノックイン対立遺伝子を確認する。 </li><li>倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレーションキットをC57BL / 6胚盤胞に95％以上の正常な核型を持つ2のESラインを注入します。代理母23の子宮に胚盤胞を移植。 C57BL / 6 FEにハイグレード男性キメラ（70から90パーセント）をメイト男性。 </li><li>サザンブロットによってヘテロ接合mTERT-ERneo動物の遺伝子型判定を確認してください。 </li><li>のNeoRカセットを削除するには、ヘテロ接合mTERT-ERneo動物とEIIA-CRE動物メイト。ホモ接合を生成するために少なくとも3倍、さらにインターブリードヘテロ接合mTERT-ERの動物C57BL / 6動物にヘテロ接合性動物を交尾。 </li></ol> LSL-mTERT対立遺伝子の2世代<ol><li> トリプルストッパー - - ネオ -エレクトロポレーション23と、マウスのES細胞へのLoxP断片と（エクソン1およびイントロン2の間に、 図1B）mTERTゲノム配列ノックインのLoxPを含むベクトルをターゲットを導入する。 </li><li> 6-10日間の培養のネオマイシンでES細胞。ネオマイシン耐性クローンをピックアップし、48ウェルプレートで展開します。市販のキットを用いてゲノムDNAを抽出し、サザンブロット23でノックイン対立遺伝子を確認する。 </li><li>麟蹄倒立顕微鏡下でマイクロマニピュレーションキットをC57BL / 6胚盤胞へのCTの95％以上が正常な核型を持つ2のESラインを。代理母23の子宮に胚盤胞を移植。 C57BL / 6雌ハイグレード男性キメラ（70から90パーセント）をメイト。 </li><li>サザンブロットによってヘテロ接合LSL-mTERT動物の遺伝子型判定を確認してください。 </li><li>ホモ接合性を生成するには、少なくとも3回のC57BL / 6匹、さらにインターブリードヘテロ接合LSL-mTERT動物とヘテロ接合動物メイト。 </li></ol> インビボでのmTERT-ERとLSL-mTERTマウスにおけるテロメラーゼの3。再活性化 mTERT-ERの場合<ol><li>注射の前に、すべての手術器具を滅菌する。 </li><li> 50％（v / v）の酸素/ 50％（v / v）の一酸化二窒素のガス混合物中のイソフルラン室（誘導に4％、維持に2％）を有するマウスを麻酔。またはケタミン - キシラジン混合物（100メートルによりマウスを麻酔グラム/ kg体重+は10mg / kg体重）。 </li><li>深い麻酔に達した後、誘導室から麻酔した動物を削除し、イソフルラン室（2％）に接続されたチューブの内側に頭を維持する。 </li><li>動物が深く麻酔していることを確認するために、マウスの足のパッドをピンチ。乾燥から目を防ぐために、両眼に軟膏を入れてください。ポビドンヨード溶液を用いてマウスの背中を拭いてください。 </li><li>背中の皮膚の下に精密トロカール（10g）でペレット化し、すべての方法2肩の間正中線にペレットをプッシュ遅い放出4-OHTを注入。 </li><li>創傷クリップアプライヤーとの切開を密封し、麻酔からの回復のためのマウスを監視します。 10日後にクリップを削除します。手順がまもなく終了したので、補足熱は必要ありません。 </li><li> 4-OHTのペレットを用いた治療の期間は、研究の目的に応じて最適化されるべきである。 </li></ol> LSL-mTERTの場合 &lt;OL&gt; <li>タモキシフェン（10mg / mlの、コーン油に溶解した）（200μlの/ 25 g /日）を腹腔内に2日間連続注入する。 </li></ol> 4.神経幹細胞の単離およびインビトロでテロメラーゼの再活性化<ol><li>マウスは二酸化炭素で安楽死させ、脳を除去する。メーカーごとのような市販の神経組織解離キットのプロトコールに従ってください。 </li><li>ボルテックスしないソリューション4.のための細胞培養培地1mlで溶液4ラベルバイアル中に凍結乾燥粉末を再懸濁ください。次いで、この溶液を分注し、後の使用のために-20℃で保存されるべきである。 </li><li>プレヒート使用前に15分間37℃で混合物。 </li><li>溶液1（50μL）と溶液2（1900μL）：酵素ミックス1を加えます。解決策3（20μL）および溶液4（10μL）：酵素ミックス2を加えます。 </li><li>最大400 mgの組織と渦のために1,950μlの酵素混合物1を準備します。 37℃で混合物を予備加熱する使用前に15分。 </li><li> 1日のマウスの脳を取り出し、そして嗅球と小脳を除去することによって、前脳を保つ。 4℃で除去し、店舗以来、冷たい培養液1ml中の前脳組織にしてください。 1時間以内に神経組織を処理することを確認してください。 </li><li>消化あたり400 mgの限界を超えていないことを確認するために組織の重量を決定します。直径35mmのペトリ皿の蓋の上に脳を置き、メスを用いて脳をつぶす。 </li><li>を1mlピペットチップを用いて、バック15mlチューブにHBSS（ワット/ oののCa / Mg）をピペット片を1ml加える。 HBSS（W / OのCa / Mg）ので洗い流してください。室温で2分間、300×gで遠心し、慎重に上清を吸引。 </li><li>予熱された酵素混合物1の1950μlを加える（ソリューション1および2）、400 mgの組織まで当り。 5分ごとに反転するか、チューブを振とうすることにより混合し、37℃で15分間、15mlチューブ中でインキュベートする。 </li><li> 20＆＃を追加することによって、組織サンプルあたり30μlの酵素ミックス2を準備956;溶液4の10μlに解決策3のlはその後に追加するサンプル。混合する優しく反転。ボルテックスしないでください。 </li><li>機械的にゆっくりと上下にピペッティング10倍ワイド先端、火災研磨パスツールピペットを用いて組織を解離。気泡を形成することは避けてください。 </li><li>チューブを3分毎に反転し、10分間37℃でインキュベートする。 </li><li>ステップ4.11を繰り返し、組織が200ミリグラムより大きくしている場合は、4.12ステップ。 </li><li> 50mlチューブに載置された70μmのセルストレーナーに細胞懸濁液を適用する。セルストレーナーを通して10mlのPBSを適用します。室温で20分間300gで細胞濾過、遠心細胞懸濁​​液を破棄する。完全に上清を吸引。 </li><li>さらなる用途のために必要な体積の幹細胞培地で細胞を再懸濁する。 </li><li> LSL-mTERTのNSCでテロメラーゼを有効にするには、2日間の100μM4-OHTで細胞を処理する。 100μM4で培養液中で細胞を維持し、mTERT-ERのNSCにおけるテロメラーゼを有効にするには-OHT。 </li></ol> 5.テロメアFISH <ol><li>培養細胞からの中期染色体を準備します。 </li><li> FFPE（ホルマリン固定およびパラフィン包埋）組織切片を、キシレンで脱パラフィン化し、5分間エタノール系で再水和する各（100％、90％、70％、50％エタノール）およびPBSで5分間。 </li><li>メタノールでポストフィックス：酢酸（3：1）1〜2時間のために。各5分（70％、90％、100％エタノール）、空気乾燥、冷エタノールシリーズで脱水する。 5分間37℃で1×PBSで洗浄します。 </li><li> 2分間37℃にて4％ホルムアルデヒド中で染色体を変性させる。冷たいエタノール系列で5分間ずつ（70％、90％、100％エタノール）及び空気乾燥を脱水。 </li><li>各スライドにPNAのハイブリダイゼーション混合物の12〜25μLを適用します。 （ハイブリダイゼーション混合物：70％ホルムアミド、0.06xのSSC、0.2％のBSA、0.5 ng /μLでのtRNA、0.5 ng /μLでテロメアまたはセントロメアプローブ） </li><li>ラバーセメントでカバースリップをシール。 4メートル、80℃で後変性の染色体の調製物及び組織切片インチ湿潤チャンバーで2-4時間室温または37℃でハイブリダイズする。 </li><li>洗浄バッファー2×15分間、室温で洗浄する。 （洗浄緩衝液：70％ホルムアミド、0.06xのSSC、pHは7.2）。 PBSTで室温で3×5分を洗ってください。顕微鏡検査のためのDAPIまたは遠赤色蛍光で対比染色スライド。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここで、我々は2つの誘導性マウステロメラーゼアレルとどのようにインビボおよびインビトロでテロメラーゼを再活性化するの生成を報告している。 mTERT-ER活性を再活性化するための重要なステップは、タモキシフェンの継続的な濃度を維持することですので、我々はアメリカの革新的な研究によって製造4-OHT時間放出ペレットを使用することを選択。ペレットは最大60日間、1 ng / mlの定常状態血中レベル4OHTを放出保つ。以前の研究では、この戦略にテロメラーゼ活性を再活性化は、そのような幹細胞の消耗、G4 mTERT ER / ERにおいてテロメア機能不全によって誘導された複数の器官における組織損傷応答および臓器不全の障害などの変性表現型を改善することができることを示したマウス20。 老化テロメラーゼの機能を研究する以外には、これらの2つの誘導性テロメラーゼ対立遺伝子はまた、癌を研究するために使用することができる。これまでの研究では、かかったこれらの対立遺伝子の利点は、ゲノムを成形し、T細胞胸腺リンパ腫21と前立腺癌22の生物学に影響を与えるにテロメア消耗とテロメラーゼ活性化の役割を探求する。 - / - mTERT ER / ERおよびG4 PB-Cre4のPten L / Lである p53 L / Lの LSL-mTERT L / Lマウスについての早期の変異原性のイベントの取得を給油の機構を提供するこれらの二つの研究は遅れて世代G4 気圧におけるテロメア機能不全があることを示した腫瘍の開始、まだ完全に悪性腫瘍の進行を予防する。テロメラーゼは、テロメア機能不全によって誘発されるゲノム不安定性、DNA損傷チェックポイントおよび横行染色体不安定性との関連で再活性化されたときに、前立腺癌21の骨転移および胸腺の脳の浸潤などの新しい生物学的特性を有する悪性腫瘍の完全な進行を可能にした、抑制されたCリンパ腫21。同様の現象はまた、大腸癌および膵臓癌（DRS。Haoqiang英、アダムBoutinとロナルドDePinhoとの個人的なコミュニケーション）を含む他の癌種で観察された。 TERT-ERタンパク質が容易に動物タモキシフェンまたはビヒクルで処置されているかに応じて、オン状態とオフ状態との間で切り替えることができるので、mTERT-ER対立遺伝子によって生成された腫瘍モデルは、抗テロメラーゼ療法を試験するために利用することができる。以前の研究では、G4 気圧で生成された腫瘍は、 - / - mTERT ER / ER動物は、4-OHTから解放された。テロメラーゼ枯渇すると、腫瘍は最終的に起因するテロメア機能不全誘発性のチェックポイント21の復職に縮小した。しかし、応答に耐性を獲得した腫瘍の一部は、テロメア（ALT）機構の代替長くすると活性化することによって消滅をテロメラーゼ。これらのALT +耐性腫瘍のさらなる特徴は、Tことを示したちょっとミトコンドリアの合成と酸化的防御PGC-1βのマスターレギュレータを含むミトコンドリアの生物学と酸化的防御に関与する遺伝子の異常な転写を持っている。テロメラーゼ+腫瘍細胞は21比較的無傷のまま維持しながら、PGC-1βまたはSOD2（酸化的防御の別のレギュレータ）のノックダウンは大幅にALT +腫瘍細胞を排除する。 これら二つのノックイン対立遺伝子の1つの制限は、彼らがテロメラーゼ遺伝子の天然の遺伝子座にあるため、彼らは唯一の内因性レベルのテロメラーゼの再活性化を余裕ができることです。ほとんどのヒト癌において、テロメラーゼは、実際にははるかに高いレベルで過剰発現される。テロメラーゼのレベルを高めるために、我々は考えることができるつの改変は、Rosa26遺伝子座へのPGK（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターなどの強力なプロモーターを有するmTERT-ERコンストラクトを挿入することである。 結論として、これらの2つの新規な誘導性マウステロメラーゼ対立遺伝子は、前例のないジェネットを提供特に事前取得テロメア機能不全によって誘発されるゲノム不安定性の背景の下で、加齢および組織恒常性ならびに腫瘍進行におけるテロメラーゼの機能を研究するためのツールでIC。 mTERT-ER対立遺伝子はまた、他の腫瘍を起こしやすいマウスモデルに交差することにより、抗テロメラーゼ治療を研究するために使用することができる。

テロメラーゼは、テロメアの維持に関与する酵素である。これらは、それらの完全性を保護する染色体の末端での反復配列である。テロメラーゼホロ酵素のコアコンポーネントは、テロメア1,2を繰り返し追加するための鋳型として働く逆転写酵素触媒サブユニット（TERT）及びRNAサブユニット（TERC）である。一般に、分化した体細胞では抑制されている間、テロメラーゼは、堅牢な活性を示し、生殖細胞において重要な役割を果たし、癌細胞および幹細胞。 mTERCとmTERTノックアウトマウスは、幹細胞および癌の両方におけるテロメラーゼの機能を研究するためのin vivoモデル系で大きな提供する。 mTERCとmTERTノックアウトマウス（G1）は、マウス3におけるテロメアの長い準備のために、明白な表現型を示さなかった。しかし、連続的に後半世代（G5-G6）にmTERCとmTERTノックアウトマウスをインターは、以下のような結果に最終的には進歩的なテロメアの侵食とは、高度に増殖性の組織4の深刻な変性を引き起こした。後期世代（G5-G6）mTERC - / -マウスは、精巣および生殖細胞枯渇におけるアポトーシスの高い率に不妊である。 G5、G6 mTERC - / -マウスはまた、アポトーシスおよび組織幹/前駆細胞コンパートメント4内の欠陥の自己再生能力の高い速度に骨髄、小腸および皮膚を含む高度に増殖性の組織における変性表現型を示す。後期世代mTERCの骨髄中の造血幹細胞- / -マウスの増殖能の低下を示すので、妥協自己再生能力、強化されたアポトーシスと、最終的に機能的な枯渇5,6。 - / -マウス7,8同様に、腸の陰窩において徐々に増加アポトーシス小体は、G1-G6 mTERCの各連続世代で観察された。 T機能不全のテロメアの彼悪影響インビトロにおいて成体神経幹細胞の増殖及びin vivoでの神経新生の両方が厳しく後期世代で損なわれたためmTERC（G4、G5）の高代謝回転の組織に限定していないように見える- / -マウス9 。幹細胞におけるテロメラーゼの役割は、いくつかの点で10,11老化時期尚早に似ている稀なヒトの遺伝性疾患の先天性角化異常症（DKC）における知見によって支持される。 DKCはジスケリン、コアテロメラーゼサブユニット、およびその他のジスケリン関連タンパク質12をコード化TERC、TERT、及び遺伝子の変異によって引き起こされる。平均では、DKC患者のテロメアは、年齢をマッチさせた対照の短い99％以上である。疾患の主な罹患率は、造血幹細胞の欠陥の維持によって引き起こされる再生不良性貧血、によるものである。そのような口腔白板症、爪ジストロフィー、精神retardati疾患の他の態様すべての精巣萎縮および肺合併症には、テロメラーゼノックアウトマウスの後期世代のものと密接に一致した所見を組織幹細胞および前駆細胞10の機能障害を示唆する。 DKC患者は、骨髄異形成症候群になりやすいですし、悪性の粘膜新生物の有病率の増加を持っている。従って、ヒト患者におけるテロメラーゼの欠乏は、後期世代テロメラーゼノックアウトマウスで観察された幹細胞の機能および腫瘍の素因の欠陥を再現する。 短いテロメアと高テロメラーゼ活性は、癌の特徴である。正常または前癌細胞が分裂するように、DNA二本鎖切断（DSB）13によって引き起こされるものと同様のテロメアおよび細胞チェックポイントの活性化の最終的な浸食が低いかまたは存在しないテロメラーゼ活性をもたらす。古典的なDSBは同様に、テロメア機能不全は、p53などの老化および/またはapoptosiなどの関連細胞応答を誘導することが示されている14,15だ。 p53の変異による不活性化されると、細胞周期と細胞の生存は、転座および地域の増幅および欠失16,17によって特徴づけプロ発癌性ミューテーターメカニズムを提供テロメア機能不全、を持つ細胞で増強されている。同時に、テロメア機能不全を続け、（さえp53ヌル細胞において）に関連横行染色体不安定性は、そのような癌の完全な悪性の進行を制約するように思われる。例えば、後期の世代のG4-G5 mTERC - / - INK4A / Arfの- / -マウスは、テロメアの消耗にINK4A / Arfの欠損マウスと比較して有意に減少したリンパ腫の発生率を示した。別の研究では、より高度な腺腫性病変G4 mTERTに- / - APCの分マウスは大幅に起因する大幅な増殖停止およびアポトーシス18,19へのAPC 分のマウスと比較して抑制された。ザ·テロメア機能不全によって誘発されるゲノムの不安定性は、腫瘍の進行はテロメラーゼの活性化は、癌細胞の生存および/またはp53依存性または非依存性チェックポイント機構を中和すると互換性のレベルにゲノムの不安定性を鎮圧によって部分的に悪性の進行を可能にし得るという推測を促す阻害することを観察。 テロメラーゼの再活性化を停止する、あるいは幹細胞の老化を逆転し、テロメラーゼ活性化は、ゲノムの不安定性を背景腫瘍形成を促進することができるかどうかことができるかどうかを調べるために、我々は2つ​​の誘導性マウステロメラーゼ対立遺伝子を生成した。最初の1は4-ヒドロキシ（4-OHT）誘導性TERT-エストロゲン受容体（mTERT-ER）融合はノックイン対立遺伝子である。 4-OHTの非存在下では、mTERT-ER（指定mTERT ER / ER）についてホモ接合性のマウスは、テロメラーゼ活性が欠損している、従来のmTERT又はmと同じ細胞遺伝学と細胞表現型を維持するTERCノックアウトモデル。 4-OHTの処理の際に、TERT-ERタンパク質の活性とは、天然TERTタンパク質20、21に匹敵するレベルに復元することができる。第二 ​​の対立遺伝子は、新規な誘導性TERTノックインイントロンのLoxP-ストッパー-のLoxPカセットを含有する対立遺伝子（LSL-あるmTERT）; LSLの切除をCre介在時に、mTERTは内因性発現制御機構22で再表現される。

<table><tbody><tr><td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Life technologies</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane vaporizer</td><td>Veterinary Anesthesia Systems</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>ketamine-xylazine mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT pellet</td><td>Innovative Research of America</td><td>Custermized</td><td></td></tr><tr><td>Precision Trochar (10 Gauge)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>wound clip applier</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>clip</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>xylene</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA telomere probe</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA centromere probe</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>rubber cement</td><td>Walmart</td><td>Elmer&#039;s</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

テロメア老化中の組織の変性を引き起こす十分に確立されたドライバは、ゲノムの完全性およびその関連DNA損傷シグナル伝達およびチェックポイント応答の喪失である機能障害が誘発される。発生率が大幅に年齢とともに増加した癌は、短いテロメアの長さおよび高テロメラーゼ活性によって特徴付けられる。老化や癌におけるテロメア機能不全とテロメラーゼ活性化の役割を研究するために、プロトコルは、2つのマウス誘導性テロメラーゼを生成する方法を示しノックイン対立遺伝子4-ヒドロキシ（4-OHT）誘導性TERT-エストロゲン受容体（mTERT-ER）および LOX -Stopper-LOX TERT（LSL-mTERT）。プロトコルは、テロメア機能不全を誘導し、 生体内でmTERT-ERとLSL-mTERTマウスにおいて、テロメラーゼ活性を再活性化する手順について説明します。代表的なデータは、テロメラーゼ活性の再活性化は、テロメア機能不全によって誘発される組織の変性表現型を改善することができることを示している。 ORDで小胞体は腫瘍形成におけるテロメラーゼ活性化の影響を決定するために、我々は、前立腺を生成した腫瘍モデルG4のPB-Cre4のPten L / Lである p53 L / L LSL-mTERT L / Lおよび胸腺T細胞リンパ腫モデルG4 気圧- / - mTERT ER / ER 。代表的なデータは、テロメア機能不全により誘発されるゲノムの不安定性の背景におけるテロメラーゼの再活性化が大幅に腫瘍形成を増強することができることを示している。プロトコルは、mTERT-ERとLSL-mTERTマウスから神経幹細胞（NSCの）を分離し、in vitroでのNSCでテロメラーゼ活性を再活性化するために使用する手順について説明します。代表的なデータは、テロメラーゼの活性化は、インビトロで自己再生能及び神経発生を増強できることを示している。最後に、プロトコルは、両方のマウスFFPEにテロメアFISH（in situハイブリダイゼーション蛍光）を実行するための手順を説明します（ホルマリン固定し、パラフィンフィン組み込み）は、脳組織および培養細胞の中期染色体。

ノックイン対立マウスmTERT-ERおよびLSL-mTERTを生成するための戦略は、 図1Aおよび1Bに記載した。具体的には、 のLoxP - トリプルストッパー - ネオ - LoxP配列フラグメントはLSL-mTERT対立遺伝子を生成するためにエクソン1およびmTERT遺伝子座のエクソン2の間に挿入した。 mTERT-ER対立遺伝子を生成するために、mTERT遺伝子とインフレームでERT2-LBDドメインはエキソン1のN末端 ​​に挿入した我々は、テロメラーゼ一過4、4-OHTペレットで処理することにより、テロメア機能不全マウスにおいて再活性化されたときことを示した週間、退行性の表現型は、脳（ 図2A）および精巣（ 図2B）などの複数の臓器に改善することができた。後期世代G4 LSL-mTERT及びG4 mTERTからインビトロで培養細胞にテロメラーゼ活性化の影響を決定するために、我々は、単離された神経幹細胞（NSC）-ERマウス。我々は、テロメラーゼはテロメア機能不全のNSCで再活性化されたときに、NSCの自己再生能力は非常に有意に（ 図3B）増強された（ 図3A）の増加、およびインビトロで神経発生にされたことを示した。 - / - mTERT ER /テロメア機能不全との関連で腫瘍形成におけるテロメラーゼの再活性化の影響を決定するために、我々は、PB-Cre4のPten L / Lである p53 L / Lの LSL-mTERT L / L（前立腺腫瘍モデル）と気圧を生成後半世代コホート（胸腺T細胞リンパ腫モデル）ER。テロメラーゼは、8週間（ 図4B）が注入（ 図4A）又は4-OHTのペレットと、これらのマウスにタモキシフェン処理によって再活性化されたときに、腫瘍形成が大幅に両方の前立腺腫瘍モデル（ 図4A）および胸腺T細胞リンパ腫モデルにおいて増強された（ <stronG&gt;図4B）。最後に、FFPEマウス脳組織にテロメアFISHを行うプロトコル（ 図5）、中期染色体（ 図5の挿入図）を報告した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> 図1：（A）mTERT-ERノックイン戦略を。ターゲティングベクターテレビ; WT、野生型対立遺伝子。 KI、ノックイン対立遺伝子。 LA、左腕。 RA、右腕。 E1、エクソン1。 E2、エクソン2;ネオ、PGKプロモーター駆動ネオマイシン耐性遺伝子; ER、修正されたエストロゲン受容体（ERT2）リガンド結合ドメイン; DT、dyphteria毒素遺伝子。 （B）LSL-mTERTノックイン戦略。ターゲティングベクターテレビ; WT、野生型対立遺伝子。 KI、ノックイン対立遺伝子。 LA、左腕。 RA、右腕。 E1、エクソン1。 E2、エクソン2;ネオ、PGKプロモーター駆動ネオマイシン耐性遺伝子;ストッパー、3反復的な転写停止配列; DT、dyphteria毒素遺伝子。 <pキープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt;：FOクラス= &quot;jove_content&quot; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> 図2：代表的なデータは、テロメラーゼ活性化を表示するには、臓器の退行性の表現型を改善する脳の代表的な画像（左）。 4週間のプラセボまたは4-OHTで処置したG0とG4 mTERT-ERマウスの精巣（右）。スケールバーは、50μmを示す。再印刷20から許可を得て。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> 図3：神経幹細胞の代表的なデータは、テロメラーゼの再活性化は、インビトロで神経幹細胞の自己再生および神経発生を増強示す（A）代表的な画像G4のLSL-mTERTから分離S（上パネル） そしてG4 mTERT-ER（下パネル）は、車両または4-OHTで処理した幹細胞培地中で増殖する。神経幹細胞のin vitroでの神経新生（のTuj1 +）の（B）代表的な画像は、車両または4-OHTで処置した（1％FBSを含む）、分化培地で培養G4 mTERT-ERから単離した。スケールバーは、100μmを示す。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> 図4：テロメラーゼ活性化を表示する代表的なデータは、ゲノム不安定性を背景に腫瘍形成を強化する （A）/ Lの p53のL / L LSL-mTERT G0 PB-Cre4のPten Lから切開前立腺腫瘍の代表的な画像+/-、G4 PB- Cre4のPten L / Lである p53 L / Lの LSL-mTERT- / - 、およびG4 PB-Cre4のPten L / L p53 をタモキシフェンで処置したL / Lの LSL-mTERT L / L。 22から許可を得て再印刷。 （B）G0 気圧から切除胸腺T細胞リンパ腫の代表的な画像- / - mTERT + / ER、G4現金自動支払機- / - mTERT ER / ERは、ビークルで処理し、G4 現金自動支払機- / - mTERT ER / ERは 、4-で処理8週間OHT。スケールバーは1cmに示している。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> 図5：FFPEマウス脳組織および中期にテロメアとセントロメアFISHの代表的な画像（挿入図）。赤緑テロメア染色を示し、DNAを示し、シアンのceを示しntromere染色。スケールバーは1ミリメートルを示している。

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Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

組織の変性/再生と癌の研究におけるマウス誘導テロメラーゼ対立遺伝子を利用

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K ビュー.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

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Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis and to identify novel therapeutic targets. To investigate molecular events that drive the progression from primary cancer to metastasis, we have developed a bitransgenic mouse model, RIP-Tag; RIP-tva. In this mouse model, the rat insulin promoter (RIP) drives the expression of the SV40 T antigen (Tag) and the receptor for subgroup A avian leukosis virus (tva) in pancreatic &#946; cells. The mice develop pancreatic neuroendocrine tumors with 100% penetrance through well-defined stages that are similar to human tumorigenesis, with stages including hyperplasia, angiogenesis, adenoma, and invasive carcinoma. Because RIP-Tag; RIP-tva mice do not develop metastatic disease, genetic alterations that promote metastasis can be identified easily. Somatic gene transfer into tva-expressing, proliferating pancreatic &#946; premalignant lesions is achieved through intracardiac injection of avian retroviruses harboring the desired genetic alteration. A titer of &#62;1 x 108 infectious units per ml is considered appropriate for in vivo infection. In addition, avian retroviruses can infect cell lines derived from tumors in RIP-Tag; RIP-tva mice with high efficiency. The cell lines can also be used to characterize the metastatic factors. Here we demonstrate how to utilize this mouse model and cell lines to assess the functions of candidate genes in tumor metastasis.

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

We present a protocol to demonstrate a novel somatic gene transfer system utilizing RIP-Tag; RIP-tva mouse model to study the function of genes in metastasis. The avian retroviruses are delivered intracardiacally to ensure gene transfer into pre-malignant, noninvasive lesions of pancreatic &#946; cells in adult mice.

同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析RIP tvaマウスモデル

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

がん研究

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

遺伝学

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

医学

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented with increasing depth, the incidence rate of cutaneous melanoma has shown a rapid and continuous increase during recent decades. In order to find effective preventative methods, it is important to understand the early steps of melanoma initiation in the skin. Previous data has demonstrated that follicular melanocyte stem cells (MCSCs) in the adult skin tissues can act as melanoma cells of origin when expressing oncogenic mutations and genetic alterations. Tumorigenesis arising from melanoma-prone MCSCs can be induced when MCSCs transition from a quiescent to active state. This transition in melanoma-prone MCSCs can be promoted by the modulation of either hair follicle stem cells&#39; activity state or through extrinsic environmental factors such as ultraviolet-B (UV-B). These factors can be artificially manipulated in the laboratory by chemical depilation, which causes transition of hair follicle stem cells and MCSCs from a quiescent to active state, and by UV-B exposure using a benchtop light. These methods provide successful spatial and temporal control of cutaneous melanoma initiation in the murine dorsal skin. Therefore, these in vivo model systems will be valuable to define the early steps of cutaneous melanoma initiation and could be used to test potential methods for tumor prevention.

The following procedure describes a method for spatial and temporal control of melanocytic tumor initiation in murine dorsal skin, using a genetically engineered mouse model. This protocol describes macroscopic as well as microscopic cutaneous melanoma initiation.

変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdeff) in Cancers

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription elongation (TE)&#8212;we call such cancers as TEdeff. Notably, TEdeff cancers are characterized by spurious transcription and faulty mRNA processing in a large set of genes, such as interferon/JAK/STAT and TNF/NF-&#954;B pathways, leading to their suppression. The TEdeff subtype of tumors in renal cell carcinoma and metastatic melanoma patients significantly correlate with poor response and outcome in immunotherapy. Given the importance of investigating TEdeff cancers&#8212;as it portends a significant roadblock against immunotherapy&#8212;the goal of this protocol is to establish an in vitro TEdeff mouse model to study these widespread, non-genetic transcriptional abnormalities in cancers and gain new insights, novel uses for existing drugs, or find new strategies against such cancers. We detail the use of chronic flavopiridol mediated CDK9 inhibition to abrogate phosphorylation of serine 2 residue on the C-terminal repeat domain (CTD) of RNA polymerase II (RNA Pol II), suppressing the release of RNA Pol II into productive transcription elongation. Given that TEdeff cancers are not classified under any specific somatic mutation, a pharmacological model is advantageous, and best mimics the widespread transcriptional and epigenetic defects observed in them. The use of an optimized sublethal dose of flavopiridol is the only efficacious strategy in creating a generalizable model of non-genetic widespread disruption in transcription elongation and mRNA processing defects, closely mimicking the clinically observed TEdeff characteristics. Therefore, this model of TEdeff can be leveraged to dissect, cell-autonomous factors enabling them in resisting immune-mediated cell attack.

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects TEdeff in Cancers

The protocol details an in vitro murine carcinoma model of non-genetic defective transcription elongation. Here, chronic inhibition of CDK9 is used to repress productive elongation of RNA Pol II along pro-inflammatory response genes to mimic and study the clinically observed TEdeff phenomenon, present in about 20% of all cancer types.

癌における広範な非遺伝的転写伸長欠損(TE)を研究する慢性CDK9阻害のマウス細胞株ベースモデル

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Spontaneous Murine Model of Anaplastic Thyroid Cancer

Anaplastic thyroid cancer (ATC) is a rare but lethal malignancy with a dismal prognosis. There is an urgent need for more in-depth research on the carcinogenesis and development of ATC, as well as therapeutic methods, since standard treatments are essentially depleted in ATC patients. However, low prevalence has hampered thorough clinical studies and the collection of tissue samples, so little progress has been achieved in creating effective treatments. We used genetic engineering to create a conditionally inducible ATC murine model (mATC) in a C57BL/6 background. The ATC murine model was genotyped by TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53ex2-10/ex2-10 and induced by intraperitoneal injection with tamoxifen. With the murine model, we investigated the tumor dynamics (tumor size ranged from 12.4 mm2 to 32.5 mm2 after 4 months of induction), survival (the median survival period was 130 days), and metastasis (lung metastases occurred in 91.6% of mice) curves and pathological features (characterized by Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67, and Caspase-3 immunohistochemical staining). The results indicated that spontaneous mATC possesses highly similar tumor dynamics and immunological microenvironment to human ATC tumors. In conclusion, with high similarity in pathophysiological features and unified genotypes, the mATC model resolved the shortage of clinical ATC tissue and sample heterogeneity to some extent. Therefore, it would facilitate the mechanism and translational studies of ATC and provide an approach to investigate the treatment potential of small molecular drugs and immunotherapy agents for ATC.

Here, we present a standard pipeline to obtain murine ATC tumors by spontaneous genetically engineered mouse models. Further, we present tumor dynamics and pathological information about the primary and metastasized lesions. This model will help researchers to understand tumorigenesis and facilitate drug discoveries.

未分化甲状腺癌の自発的マウスモデル

Anaplastic thyroid cancer (ATC) is a rare but lethal malignancy with a dismal prognosis. There is an urgent need for more in-depth research on the ...

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

乳がんの転移における肺胞マクロファージの役割を学びます

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable model for tracing tumor progression and angiogenesis simultaneously in a visual and sensitive manner. Bioluminescence imaging displays its unique superiority in living imaging due to its advantages of high sensitivity, strong specificity, and accurate measurement. Presented here is a protocol to establish a tumor-bearing mouse model by injecting a Renilla luciferase-labeled murine breast cancer cell line 4T1 into the transgenic mouse with angiogenesis-induced Firefly luciferase expression. This mouse model provides a valuable tool to simultaneously monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging in a single mouse. This model may be widely applied in anti-tumor drug screening and oncology research.

This protocol describes the establishment of a tumor-bearing mouse model to monitor tumor progression and angiogenesis in real-time by dual bioluminescence imaging.

腫瘍進行と血管新生の二重生物発光イメージング

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by crossing the &#39;Tet-On&#39; system oTet-Cre mouse with a novel reverse tetracycline transactivator (rtTA) transgene linked to the Tert promoter, which we have demonstrated marks a novel population of adult brain stem cells. Here, administration of the tetracycline derivative doxycycline to mTert-rtTA::oTet-Cre mice will indelibly mark a population of cells that express a 4.4 kb fragment of the promoter region of the gene Tert. When combined the Rosa-mTmG reporter, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG mice will express membrane tdTomato (mTomato) until doxycycline treatment induces the replacement of mTomato expression with membrane EGFP (mGFP) in cells that also express Tert. Therefore, when these triple-transgenic lineage tracing mice receive doxycycline (the &#34;pulse&#34; period during which TERT expressing cells are marked), these cells will become indelibly marked mGFP+ cells, which can be tracked for any desirable amount of time after doxycycline removal (the &#34;chase&#34; period), even if Tert expression is subsequently lost. Brains are then perfusion-fixed and processed for immunofluorescence and other downstream applications in order to interpret changes to stem cell activation, proliferation, lineage commitment, migration to various brain niches, and differentiation to mature cell types. Using this system, any rtTA mouse can be mated to oTet-Cre and a Rosa reporter to conduct doxycycline-inducible &#34;pulse-chase&#34; lineage&#160;tracing experiments using markers of stem cells.

The ability to permanently mark stem cells and their progeny with a fluorophore using an inducible transgenic lineage tracing mouse line allows for spatial and temporal analysis of activation, proliferation, migration, and/or differentiation in vivo. Lineage tracing can reveal novel information about lineage commitment, response to intervention(s), and multipotency.

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...