J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

NOTE: Toutes les étapes de ce protocole ont été approuvés par UT MD Anderson Cancer Center. 1. Génération de mTERT-ER allèle <ol><li> Introduire knock-in vecteur de ciblage contenant la ERT2-LBD (Ligand Binding Domain) en amont et en cadre avec la séquence génomique mTERT (de l&#39;exon 1 à l&#39;intron 2) et une Lox - PGK - Neo - fragment Lox (figure 1A) dans des cellules ES de souris avec électroporation. </li><li> Culture des cellules ES à la néomycine pour 6-10 jours. Choisissez clones résistantes à la néomycine et à élargir en plaques à 48 puits. Extraire l&#39;ADN génomique en utilisant un kit commercial et confirmer le knock-in allèle par buvardage de Southern. </li><li> Injecter deux ES lignes avec plus de 95% des caryotypes normales en C57BL / 6 blastocystes avec un kit de micromanipulation sous un microscope inversé. Implanter les blastocystes dans l&#39;utérus de mères porteuses 23. Accoupler les chimères mâles de haut grade (70-90%) à C57BL / 6 femâles. </li><li> Confirmez le génotypage des animaux hétérozygotes mTERT-ERNEO par buvardage de Southern. </li><li> Accoupler les animaux hétérozygotes mTERT-ERNEO et animaux EIIa-Cre de supprimer la cassette NéoR. Accoupler les animaux hétérozygotes pour C57BL / 6 animaux pendant au moins trois fois, et d&#39;autres inter-race hétérozygotes animaux mTERT-ER pour générer homozygotie. </li></ol> 2. Génération de LSL-mTERT allèle <ol><li> Introduire le knock-in vecteur de ciblage contenant une LoxP - triple Stopper - Neo - fragment LoxP et la séquence génomique mTERT (1 entre l&#39;exon et l&#39;intron 2, figure 1B) dans des cellules ES de souris avec 23 l&#39;électroporation. </li><li> Culture des cellules ES à la néomycine pour 6-10 jours. Choisissez clones résistantes à la néomycine et à élargir en plaques à 48 puits. Extraire l&#39;ADN génomique en utilisant un kit commercial et confirmer le knock-in allèle par buvardage de Southern 23. </li><li> Inject deux ES lignes avec plus de 95% des caryotypes normaux dans C57BL / 6 blastocystes avec un kit de micromanipulation sous un microscope inversé. Implanter les blastocystes dans l&#39;utérus de mères porteuses 23. Accoupler les chimères mâles de haut grade (70-90%) à C57BL / 6 femelles. </li><li> Confirmez le génotypage des animaux hétérozygotes LSL-mTERT par buvardage de Southern. </li><li> Les animaux hétérozygotes se accoupler à des souris C57BL / 6 animaux pendant au moins trois fois, et en outre entre les races d&#39;animaux hétérozygotes LSL-mTERT pour générer homozygotie. </li></ol> 3. La réactivation de la télomérase dans mTERT-ER et Souris LSL-mTERT In Vivo Pour mTERT-ER <ol><li> Stériliser tous les instruments chirurgicaux avant l&#39;injection. </li><li> Anesthésier les souris avec de l&#39;isoflurane chambre (4% pour l&#39;induction, 2% pour le maintien) à 50% (v / v) d&#39;oxygène / 50% (v / v) de mélange de gaz de monoxyde de diazote. Ou anesthésier la souris par un mélange de kétamine-xylazine (100 mg / kg de poids corporel + 10 mg / kg de poids corporel). </li><li> Après anesthésie profonde est atteint, retirez l&#39;animal anesthésié de la chambre de l&#39;induction, et garder la tête à l&#39;intérieur du tube relié à la chambre de l&#39;isoflurane (2%). </li><li> Pincez les coussinets plantaires des souris afin de se assurer que l&#39;animal est profondément anesthésié. Mettez la pommade sur les deux yeux afin d&#39;éviter les yeux de sécher. Essuyez le dos des souris avec une solution de povidone-iode. </li><li> Injecter la libération lente culot 4-OHT avec trocart de précision (10 G) sous la peau du dos et pousser le culot tout le chemin à la ligne médiane entre les deux épaules. </li><li> Sceller l&#39;incision avec clip de la plaie applicateur et surveiller la souris pour la récupération de l&#39;anesthésie. Retirez les clips 10 jours plus tard. Chaleur supplémentaire ne est pas nécessaire parce que la procédure est terminée sous peu. </li><li> Période de traitement avec du 4-OHT pastille doit être optimisée en fonction du but de l&#39;étude. </li></ol> Pour LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> Le tamoxifène (10 mg / ml, dissous dans l&#39;huile de maïs) est injectée par voie intrapéritonéale deux jours consécutifs (200 ul / 25 g / jour). </li></ol> 4. Isolement de cellules souches neurales et la réactivation de la télomérase in vitro <ol><li> Les souris sont euthanasiées avec du dioxyde de carbone et les cerveaux sont prélevés. Suivre le protocole du kit disponible dans le commerce de dissociation de tissu neural selon fabricant. </li><li> Remettre en suspension la poudre lyophilisée dans le flacon étiqueté avec une solution de 4 ml de milieu de culture cellulaire pour la solution 4. Ne vortex. Cette solution doit ensuite être réparti en portions aliquotes et stocké à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. </li><li> Préchauffer le mélange à 37 ° C pendant 15 min avant utilisation. </li><li> Faire Enzyme Mix 1: Solution 1 (50 ul) et la solution 2 (1900 pi). Assurez-Enzyme Mix 2: Solution 3 (20 pi) et Solution 4 (10 pi). </li><li> Préparer 1950 ul mélange enzymatique 1 jusqu&#39;à 400 mg de tissu et le vortex. Pré-chauffer le mélange à 37 ° C pendant15 min avant utilisation. </li><li> Sortez les cerveaux de souris 1-jour, et de garder les cerveaux antérieurs en enlevant les bulbes olfactifs et le cervelet. Gardez les tissus du cerveau antérieur dans 1 ml de milieu de culture froide car l&#39;enlèvement et le ranger dans 4 ° C. Assurez-vous de traiter le tissu neural dans les 1 h. </li><li> Déterminer le poids de tissu pour se assurer que la limite de 400 mg par la digestion ne est pas dépassée. Placer le cerveau sur le couvercle d&#39;une boîte de 35 mm de diamètre Petri, et écraser le cerveau à l&#39;aide d&#39;un scalpel. </li><li> En utilisant une pointe de pipette de 1 ml, ajouter 1 ml de HBSS (w / o Ca / Mg) et des morceaux de pipettes arrière dans un tube de 15 ml. Rincer avec du HBSS (w / o Ca / Mg). Centrifuger à 300 g pendant 2 min à température ambiante et aspirer le surnageant attentivement. </li><li> Ajouter 1950 pi de mélange d&#39;enzymes préchauffé (1 Solutions 1 et 2) par jusqu&#39;à 400 mg de tissu. Incuber dans le tube de 15 ml pendant 15 min à 37 ° C, le mélange ou l&#39;agitation par retournement du tube toutes les 5 min. </li><li> Préparer 30 ul mélange enzymatique 2 par échantillon de tissu en ajoutant 20 &amp; #956; l de Solution 3-10 ul de Solution 4. Puis ajouter à l&#39;échantillon. Inversez doucement pour mélanger. Ne pas vortex. </li><li> Dissocier tissus mécaniquement à l&#39;aide d&#39;un large pointe, pipette Pasteur polie au feu par pipetage de haut en bas 10 fois lentement. Éviter la formation de bulles d&#39;air. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 10 min, en inversant le tube toutes les 3 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 4.11 et 4.12 étape si les tissus sont plus grandes que 200 mg. </li><li> Appliquer la suspension de cellules à un tamis cellulaire de 70 pm, placé sur un tube de 50 ml. Appliquer 10 ml de PBS par tamis cellulaire. Jeter tamis cellulaire et centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 20 min à température ambiante. Aspirer le surnageant complètement. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec du milieu de cellules souches au volume requis pour d&#39;autres applications. </li><li> Pour activer télomérase dans LSL-mTERT CNS, traiter les cellules avec 100 uM 4-OHT pendant deux jours. Pour activer la télomérase dans les mTERT-ER CNS, maintenir les cellules dans un milieu de culture avec 100 uM 4-OHT. </li></ol> 5. télomères FISH <ol><li> Préparer les chromosomes métaphasiques de cellules cultivées. </li><li> Pour FFPE (fixés au formol et inclus dans la paraffine), des coupes de tissus dans du xylene Déparaffiner et réhydrater en série de l&#39;éthanol pendant 5 minutes à chaque fois (100%, 90%, 70%, 50% d&#39;éthanol) et du PBS pendant 5 min. </li><li> Post-fix dans le methanol: acide acétique (3: 1) pendant 1-2 heures. Déshydrater en série de l&#39;éthanol froid pendant 5 minutes chacune (70%, 90%, 100% d&#39;éthanol) et l&#39;air sec. Laver à 1x PBS à 37 ° C pendant 5 min. </li><li> Dénaturer chromosomes dans 4% de formaldéhyde à 37 ° C pendant 2 min. Déshydrater en série de l&#39;éthanol froid 5 min chacun (70%, 90%, 100% d&#39;éthanol) et l&#39;air sec. </li><li> Appliquer 12 à 25 pi du mélange d&#39;hybridation PNA à chaque diapositive. (Mélange d&#39;hybridation: 70% de formamide, 0.06x SSC, 0,2% de BSA, / ul d&#39;ARNt, 0,5 ng / ul télomères ou sondes centromériques 0,5 ng) </li><li> Sceller la lamelle avec du ciment de caoutchouc. Post-dénaturer préparations chromosomiques et des coupes de tissus à 80 ° C pendant 4 mdans. Hybrider à la température ambiante ou à 37 ° C pendant 2-4 heures dans la chambre humide. </li><li> Laver à température ambiante avec un tampon de lavage 2 x 15 min. (Tampon de lavage: 70% de formamide, SSC 0.06x, pH 7,2). Laver à la température ambiante 3 x 5 min avec du PBST. Diapositives contre-coloration avec DAPI ou de la fluorescence rouge lointain pour l&#39;examen microscopique. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ici, nous rapportons la génération de deux allèles de la télomérase murin inductibles et comment réactiver la télomérase in vivo et in vitro. L&#39;étape critique pour réactiver l&#39;activité mTERT-ER est de garder une concentration continue du tamoxifène, donc nous avons choisi d&#39;utiliser 4-OHT granulés à libération fabriqués par Innovative Research of America. Les pastilles garder libérant 4OHT à un niveau sanguin de l&#39;état d&#39;équilibre de 1 ng / ml jusqu&#39;à 60 jours. Dans une étude précédente, nous avons montré que la réactivation de l&#39;activité de la télomérase avec cette stratégie a réussi à améliorer les phénotypes dégénératives telles que l&#39;épuisement des cellules souches, la dépréciation des réponses de lésions tissulaires et la défaillance d&#39;organes dans de multiples organes qui ont été induite par un dysfonctionnement des télomères dans G4 mTERT ER / ER 20 souris. Autre que l&#39;étude de la fonction de la télomérase dans le vieillissement, ces deux allèles de la télomérase inductibles peuvent également être utilisés pour étudier le cancer. Des études antérieures ontavantage de ces allèles d&#39;explorer le rôle des télomères et de la télomérase attrition réactivation dans l&#39;élaboration des génomes et impact de la biologie de lymphome thymique des lymphocytes T 21 et 22 cancer de la prostate. Ces deux études ont montré que le dysfonctionnement des télomères à la fin de la génération G4 Atm - / - mTERT ER / ER et G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L souris fournit un mécanisme alimentant l&#39;acquisition d&#39;événements mutagènes début pour l&#39;initiation de la tumeur, mais prévenir la progression de tumeurs malignes pleinement. Lorsque la télomérase a été réactivée dans le contexte de l&#39;instabilité génomique télomères dysfonction induite, dommages à l&#39;ADN des points de contrôle et rampante instabilité chromosomique ont été supprimées, ce qui a permis la pleine progression des tumeurs malignes avec de nouvelles propriétés biologiques telles que les métastases osseuses du cancer de la prostate 21 et le cerveau infiltration de thymic lymphome 21. Des phénomènes similaires ont également été observés dans d&#39;autres types de cancer, dont le cancer du côlon et le cancer du pancréas (communications personnelles avec les Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin et Ronald DePinho). Parce que la protéine TERT-ER peut être facilement basculé entre on et off états selon que les animaux sont traités avec le tamoxifène ou le véhicule, les modèles de tumeurs générées par mTERT-ER allèle peuvent être utilisés pour tester la thérapie anti-télomérase. Dans l&#39;étude précédente, les tumeurs générées dans G4 Atm - / - mTERT ER animaux / ER ont été libérés de 4-OHT; sur la télomérase épuisement, les tumeurs ont diminué par la suite en raison de la réintégration des points de contrôle induite dysfonction-télomères 21. Cependant, certaines des tumeurs résistance acquise en réponse à la télomérase l&#39;extinction par l&#39;activation d&#39;un allongement des télomères alternative (ALT) mécanisme. Une caractérisation plus poussée de ces tumeurs ALT + résistants montré que they avoir la transcription aberrante des gènes impliqués dans la biologie mitochondriale et la défense oxydatif comprenant un régulateur maître de la synthèse et à l&#39;oxydation mitochondriale défense PGC-1β. Knockdown de PGC-1β ou SOD2 (un autre régulateur de la défense oxydatif) élimine considérablement cellules ALT + tumorales tout garder les cellules tumorales de la télomérase + restent relativement intacte 21. Une limitation de ces deux allèles knock-in, ce est qu&#39;ils ne peuvent se permettre la réactivation de la télomérase au niveau endogène parce qu&#39;ils sont dans le locus natif du gène de la télomérase. Dans la plupart des cancers humains, la télomérase est surexprimée effectivement à un niveau beaucoup plus élevé. Afin d&#39;améliorer le niveau de la télomérase, une modification nous pouvons considérer est d&#39;insérer la construction mTERT-ER avec un promoteur plus fort tel que PGK (phosphoglycérate kinase), le promoteur en locus Rosa26. En conclusion, ces deux nouveaux allèles inductibles de la télomérase murines fournissent genette sans précédentic outils pour étudier les fonctions de la télomérase dans le vieillissement et l&#39;homéostasie tissulaire ainsi que la progression de la tumeur, en particulier dans le contexte de l&#39;instabilité génomique induite télomères de la dysfonction-pré-acquise. L&#39;allèle mTERT-ER peut également être utilisé pour étudier la thérapie anti-télomérase par passage dans d&#39;autres modèles tumoraux de souris sujettes.

La télomérase est une enzyme responsable du maintien de télomères. Il se agit de séquences répétées à l&#39;extrémité des chromosomes qui protègent leur intégrité. Les composants de base de la télomérase holoenzyme sont une sous-unité catalytique de la transcriptase inverse (TERT) et une sous-unité de l&#39;ARN (TERC) qui sert de matrice pour additionner le télomérique répète 1,2. Bien que généralement supprimée dans les cellules somatiques différenciées, présente une activité télomérase robuste et joue un rôle important dans les cellules germinales, les cellules cancéreuses et les cellules souches. souris knock-out mTERC mTERT et offrent une grande dans les systèmes de modèle in vivo pour étudier les fonctions de la télomérase dans les cellules souches et le cancer. Le mTERC et mTERT souris knockout (G1) ne ont montré aucun phénotypes évident en raison de la longue réserve des télomères chez la souris 3. Cependant, intercroisement série souris knock-out mTERC et mTERT à la fin génération (G5-G6) a entraînél&#39;érosion progressive des télomères et finalement provoqué la dégénérescence sévère des tissus hautement prolifératives 4. Late génération (G5-G6) mTERC - / - souris sont infertiles en raison des taux élevés de l&#39;apoptose dans les cellules germinales des testicules et de l&#39;épuisement. G5-G6 mTERC - / - souris présentent également phénotypes dégénératives dans les tissus hautement prolifératives, y compris la moelle osseuse, l&#39;intestin et de la peau en raison de taux élevés de l&#39;apoptose et la capacité d&#39;auto-renouvellement défectueuse dans la tige de tissu / compartiments de cellules progénitrices 4. Les cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse de la fin génération mTERC - / - souris de perte d&#39;exposition du potentiel de prolifération, capacité d&#39;auto-renouvellement compromis, apoptose accrue et, éventuellement épuisement fonctionnelle 5,6. De même, progressivement augmenté corps apoptotiques dans cryptes intestinales ont été observées dans chaque génération successive de G1-G6 mTERC souris - / - 7,8. Til effet délétère des télomères dysfonctionnels ne semble pas être limitée aux tissus de roulement élevé depuis la fois la prolifération des cellules souches neurales adultes in vitro et la neurogenèse in vivo ont été gravement affaiblies à la fin de la génération (G4-G5) mTERC - / - souris 9 . Le rôle de la télomérase dans les cellules souches est en outre corroborée par les conclusions d&#39;une rare maladie génétique humaine dyskératose congénitale (DKC), qui ressemble à certains égards, le vieillissement prématuré de 10,11. DKC est causée par des mutations dans TERC, TERT, et les gènes qui codent pour dyskérine, une télomérase sous-unité de base, et d&#39;autres protéines associées à des dyskérine 12. En moyenne, les télomères chez les patients DKC sont plus courtes que 99% des témoins appariés selon l&#39;âge. La majeure de morbidité de la maladie est due à l&#39;anémie aplastique, qui est causée par l&#39;entretien défectueux de cellules souches hématopoïétiques. Autres aspects de la maladie tels que la leucoplasie orale, une dystrophie des ongles, retardati mentalesur, les testicules et l&#39;atrophie des complications pulmonaires suggèrent toutes les fonctions des cellules souches de tissus et de cellules progénitrices 10, conclusions en étroite accord avec ceux facultés affaiblies dans la production tardive de la télomérase souris knock-out. DKC patients sont sujettes au syndrome myélodysplasique et ont une prévalence accrue de tumeurs malignes de la muqueuse. Ainsi, la carence de la télomérase chez des patients humains récapitule les défauts de fonctionnement des cellules souches et prédisposition tumorale qui sont observés chez les souris knock-out télomérase fin de production. Courts télomères et une forte activité de la télomérase sont caractéristiques du cancer. Comme les cellules normales ou précancéreuses divisent, les résultats faibles ou absentes activité de la télomérase dans l&#39;érosion éventuelle des télomères et l&#39;activation des points de contrôle cellulaires similaires à ceux provoqués par des doubles-sauts échoués ADN (CDB) 13. Comme CDB classiques dysfonctionnement des télomères a été démontré, pour induire et p53 associé réponses cellulaires telles que la sénescence et / ou apoptosis 14,15. Après inactivation mutationnelle de p53, le cycle cellulaire et la survie cellulaire sont améliorées dans les cellules présentant un dysfonctionnement des télomères, qui prévoit un mécanisme de mutation pro-cancérigènes caractérisé par translocations et amplifications régionaux et suppressions 16,17. Dans le même temps, suite un dysfonctionnement des télomères et l&#39;instabilité chromosomique associée rampante (même dans les cellules nulles p53) semblent limiter la progression maligne complet de ces cancers. Par exemple, la fin de la génération G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - souris ont montré l&#39;incidence du lymphome considérablement réduite par rapport à Ink4a / Arf souris nulle en raison de l&#39;attrition des télomères. Dans une autre étude, les lésions adénomateux plus avancés dans G4 mTERT - / - souris min APC ont été fortement réprimées en comparaison avec des souris min APC due à un arrêt de croissance significatif et l&#39;apoptose 18,19. Leobservation que télomère dysfonctionnement induit par une instabilité génomique inhibe la progression tumorale invite la spéculation que l&#39;activation de la télomérase peut permettre la progression maligne en partie par la répression de l&#39;instabilité génomique à un niveau compatible avec la viabilité de cellules cancéreuses et / ou une neutralisation p53-dépendante ou mécanismes de point de contrôle -indépendante. Afin d&#39;étudier si la réactivation de la télomérase peut arrêter ou même inverser le vieillissement des cellules souches, et si la réactivation de la télomérase peut favoriser la tumorigenèse dans le contexte de l&#39;instabilité génomique, nous avons généré des deux allèles de la télomérase murins inductibles. Le premier est le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) inductible par TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) fusion knock-in allèle. En l&#39;absence de 4-OHT, les souris homozygotes pour mTERT-ER (ER mTERT / ER désigné) sont l&#39;activité télomérase déficiente et soutenir mêmes phénotypes cytogénétiques et cellulaires que mTERT ou m conventionnelleModèle KO TERC. Sur 4-OHT traitement, activité de la protéine TERT-ER peut être restauré à des niveaux comparables à la protéine TERT natif 20, 21. La deuxième allèle est un roman TERT inductible knock-in allèle contenant une cassette LoxP-Bouchon-LoxP intronique (LSL- mTERT); lors de l&#39;excision médiée par Cre-LSL, mTERT est ré-exprimé sous des mécanismes de contrôle de l&#39;expression endogène 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

Pilotes bien établis qui provoquent la dégénérescence des tissus au cours du vieillissement télomères perte de l&#39;intégrité du génome et sa signalisation de dommages à l&#39;ADN et les réponses associées aux points de contrôle sont dysfonction induite. Cancer, les taux d&#39;incidence augmente considérablement avec l&#39;âge, se caractérise par des longueurs de télomères courts et une forte activité de la télomérase. Pour étudier les rôles de dysfonctionnement des télomères et de la télomérase réactivation dans le vieillissement et le cancer, le protocole montre comment générer deux télomérase inductible murin knock-in allèles 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) inductible par TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) et Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Le protocole décrit les procédures à induire un dysfonctionnement des télomères et de réactiver l&#39;activité de la télomérase dans les souris mTERT-ER et LSL-mTERT in vivo. Les données représentatives montrent que la réactivation de l&#39;activité télomérase peut améliorer les phénotypes dégénératives des tissus induites par un dysfonctionnement des télomères. Dans order de déterminer l&#39;impact de la télomérase réactivation sur la tumorigenèse, nous avons généré la prostate modèle de tumeur G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L et thymique modèle de lymphome T G4 Atm - / - mTERT ER / ER . Les données représentatives montrent que la télomérase réactivation dans le contexte d&#39;instabilité génomique induite par un dysfonctionnement des télomères peut grandement améliorer la tumorigenèse. Le protocole décrit également les procédures utilisées pour isoler des cellules souches neurales (NSC) de souris mTERT-ER et LSL-mTERT et réactiver l&#39;activité de la télomérase dans les CNS in vitro. Les données représentatives montrent que la réactivation de la télomérase peut améliorer la capacité d&#39;auto-renouvellement et la neurogénèse in vitro. Enfin, le protocole décrit les procédures pour effectuer des télomères FISH (Fluorescence In Situ Hybridation) sur les deux FFPE de la souris (fixés au formol et ParafEmbarqués) tissus cérébraux communs et chromosomes métaphasiques de cellules cultivées.

Les stratégies pour générer murin mTERT-ER et LSL-mTERT knock-in allèles ont été décrits dans la figure 1A et 1B. Plus précisément, un LoxP - triple Stopper - Neo - fragment LoxP a été inséré entre l&#39;exon 1 et l&#39;exon 2 du locus mTERT pour générer LSL-mTERT allèle. Pour générer mTERT-ER allèle, domaine ERT2-LBD dans le cadre avec le gène mTERT a été inséré dans l&#39;extrémité N-terminale de l&#39;exon 1. Nous avons montré que, lorsque la télomérase a été transitoirement réactivé chez les souris de dysfonctionnement des télomères en les traitant avec des pastilles 4-OHT pour 4 semaine, le phénotype dégénérative pourraient être améliorés dans plusieurs organes tels que le cerveau (figure 2A) et les testicules (figure 2B). Afin de déterminer l&#39;impact de la télomérase réactivation sur des cellules cultivées in vitro, nous avons isolé des cellules souches neurales (NSC) de fin de génération G4 LSL-mTERT et G4 mTERT-er Souris. Nous avons montré que lorsque la télomérase a été réactivé en télomères NSCs dysfonctionnelles, la capacité d&#39;auto-renouvellement du CNS a été considérablement augmenté (figure 3A), et dans la neurogenèse vitro a également été considérablement amélioré (figure 3B). Afin de déterminer l&#39;impact de la télomérase réactivation sur la tumorigenèse dans le contexte de dysfonctionnement des télomères, nous avons généré PB-Cre4 Pten L mTERT LSL-/ L (modèle de tumeur de la prostate) / L p53 L / L L et Atm - / - mTERT ER / ER (cellules T modèle de lymphome thymique) des cohortes de la dernière génération. Lorsque la télomérase a été réactivé par un traitement au tamoxifène chez ces souris avec une injection (figure 4A) ou pastilles 4-OHT pendant 8 semaines (figure 4B), la tumorigénèse a été grandement améliorée à la fois dans le modèle de tumeur de la prostate (figure 4A) et du thymus modèle de lymphome des cellules T ( <strong&gt; Figure 4B). Enfin, nous avons présenté les protocoles de l&#39;exécution des télomères FISH sur FFPE tissus cérébraux de souris (figure 5) et les chromosomes en métaphase (figure 5, médaillon). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Figure 1: (A) mTERT-ER knock-in stratégie. TV, vecteur de ciblage; WT, allèle sauvage; KI, knock-in allèle; LA, le bras gauche; RA, bras droit; E1, exon 1; E2, l&#39;exon 2; néo, pgk promoteur-gène de résistance à la néomycine entraînée; ER, récepteur des oestrogènes modifié (ERT2) ligand domaine de liaison; DT, dyphteria gène de la toxine. (B) LSL-mTERT stratégie knock-in. TV, vecteur de ciblage; WT, allèle sauvage; KI, knock-in allèle; LA, le bras gauche; RA, bras droit; E1, exon 1; E2, l&#39;exon 2; néo, pgk promoteur-gène de résistance à la néomycine entraînée; STOPPER, trois séquences d&#39;arrêt de la transcription répétitives; DT, dyphteria gène de la toxine. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Figure 2: Les données représentatives pour afficher télomérase réactivation améliore phénotypes dégénératives des organes représentatifs des images de cerveaux (à gauche). et les testicules (à droite) de souris G0 et G4 mTERT-ER traités avec un placebo ou 4-OHT pendant 4 semaines. Barres d&#39;échelle indiquent 50 um. Re-print avec la permission de 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Figure 3:. Les données représentatives de montrer une réactivation de la télomérase améliore l&#39;auto-renouvellement et la neurogenèse de cellules souches neurales in vitro (A) images représentatifs de cellules souches neuraless isolé du G4 LSL-mTERT (panneau supérieur) et G4 mTERT-ER (panneau inférieur) de plus en plus dans le milieu de cellules souches traités avec le véhicule ou 4-OHT. (B) des images représentatives de la neurogénèse in vitro (Tuj1 +) des cellules souches neurales isolées à partir G4 mTERT-ER cultivées dans un milieu de différenciation (avec 1% de FBS) traités avec le véhicule ou 4-OHT. Barres d&#39;échelle indiquent 100 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Figure 4:. Les données représentatives pour montrer une réactivation de la télomérase améliore la tumorigenèse dans le contexte de l&#39;instabilité génomique (A) des images représentatives de tumeurs de la prostate disséqués à partir G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT +/-, G4 PB Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT- / -, Et G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L traitées par le tamoxifène. Re-imprimer avec la permission de 22. (B) des images représentatives de lymphomes à cellules T thymiques disséqués à partir G0 Atm - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER traités avec le véhicule, et G4 Atm - / - mTERT ER / ER traité avec 4- OHT pendant 8 semaines. Barres d&#39;échelle indiquent une cm. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Figure 5: images représentatifs de télomérique et FISH centromérique sur les tissus du cerveau de la souris et FFPE métaphase (en médaillon). Le rouge indique l&#39;ADN, le vert indique télomères coloration, et cyan indique CEntromere coloration. Barres d&#39;échelle indiquent une mm.

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Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Utilisant murin inductible télomérase allèles dans les études de la dégénérescence des tissus / Régénération et cancer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K vues.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Une méthode pour isoler l&#39;îlot murin et transplantation rénale sous-capsulaires

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

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Médecine

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modèle orthotopique de cancer de la vessie murin

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

Coloration immunohistochimique de B7-H1 (PD-L1) sur la paraffine Diapositives de tissus adénocarcinome pancréatique

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

Un préclinique modèle murin de métastases hépatiques

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Une<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle dormance du cancer du sein sensible aux œstrogènes dans la moelle osseuse: un outil pour les études de mécanisme moléculaire et Hypothèse Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

Le bm12 inductible modèle du lupus érythémateux disséminé (SLE) dans C57BL / 6

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Pré-clinique Orthotopique modèle murin de cancer de la prostate humaine

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Analyse Effets bénéfiques des suppléments nutritionnels sur les fonctions épithéliales intestinales barrière Pendant Experimental Colite

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Génération d’un modèle de Cancer du sein métastatique orthotopique murin et effectuant une mastectomie radicale Murine

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescence Étiquetage des pièges extracellulaires de l'homme et de la murine Neutrophil dans les tissus paraffins

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...