This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium &#8220;Tolerage&#8221;, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-W&#252;rttemberg.

وقد اعتمدت هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات Regierungspräsidium كارلسروه. وتم إيواء جميع الحيوانات تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض محددة في مركز أبحاث السرطان الألماني (DKFZ). لجميع الجراء تجارب زراعة الماوس تتراوح 1-7 أيام من العمر استخدمت. 1. عزل mTECs من الغدة الصعترية ملاحظة: تم إجراء الخطوات التالية الهضم كما هو موضح سابقا 1 تحت ظروف معقمة مع بعض التعديلات على النحو التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع رأس الجراء الماوس وإزالة الغدة الصعترية. ضع التوتة على الجليد في طبق بتري تحتوي RPMI 1640 المتوسطة (التي تحتوي على 5٪ FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع التوتة في الدقيقة، وقطع صغيرة ووضعها في أنبوب أسفل مستديرة مع ~ 5-30 مل وسائل الاعلام RPMI ويحرك برفق باستخدام مغناطيس لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، صب طاف تحتوي أساسا thymocytes وهضم بالتتابع الأنسجة المتبقية مع جولة واحدة من collagenaحد ذاته نوع IV (0.2 ملغ / مل و 57 U / مل concentartion النهائي) لمدة 15 دقيقة لكل منهما على 37 درجة مئوية، تليها كولاجيناز / dispase (0.2 ملغ / مل وتركيز النهائي 1.2 U / مل) لمدة 25 دقيقة لكل منهما على 37 درجة C في حمام مائي مع التحريك المغناطيسي حتى التوتة يتم هضمها تماما. استخدام 1 مل انزيم في 02:58 التوتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستنهض الهمم الأنسجة مرة كل 7-10 دقيقة مع ماصة باستور. تجميع كولاجيناز / dispase الكسور وتصفية من خلال الشاش 70 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إثراء mTECs بواسطة الخلايا المغناطيسية الفرز (MACS). أداء تنقية mTECs بواسطة الخلايا المغناطيسية الفرز كما هو موضح سابقا 11، ومبين في الشكل 1. ملاحظة: للحصول على الفرز المغناطيسي للmTECs استخدمنا الأجسام المضادة التالية: مكافحة CD80-PE (16-10A1، استخدامها في التخفيف 1: 100) ومكافحة EpCAM الحيوية (G8.8، استخدامها في التخفيف 1: 100) (12). وقد تم تحديد mTECs غير ناضجة وناضجة تستخدم أجهزة ماكينتوش على النحو التالي: CD45 - EpCAM + CD80 - وCD45 - CD80 + respectivاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد MACS تنقية (نقاء mTECs غير ناضجة = 83.1 ± 6.3٪ وmTECs ناضجة = 79.23 ± 3.42٪)، والبذور وmTECs على الثقافات عضوي النمط كما هو موضح أدناه (القسم 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، mTECs الترتيب حسب FACS (باستخدام 100 ميكرون فوهة) بعد نضوب CD45 MACS باستخدام الأجسام المضادة التالية: مكافحة CD45-PerCP (30-F11، استخدم في التخفيف 1: 100)، ومكافحة Ly51-FITC (6C3، استخدم في 1 : 100 تمييع)، ومكافحة EpCAM-Alexa647 (G8.8، استخدم في 1: 500 تمييع) واستخدام الألغام المضادة للCD80-PE (16-10A1، في التخفيف 1: 100). استبعاد الخلايا الميتة باستخدام يوديد propidium (1: 5000) (يوم 4). وتم تحديد mTECs غير ناضجة وناضجة باستخدام FACS على النحو التالي: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - وPI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +، على التوالي. </li></ol> 2. 3D عضوي النمط المشارك الثقافات (OTCs) ملاحظة: بنيات-3D الجلدي للزراعة عضوي النمط من keratinocytأعدت وفاق كما هو موضح سابقا 9،13. في جميع الخطوات وحضنت الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. أعدت OTCs باستخدام mTECs مع تعديلات طفيفة على النحو التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا الليفية الإنسان ملاحظة: تم الحصول على الخلايا الليفية الجلدية الإنسان من الثقافات يزدرع من الأدمة-epidermised دي كما هو موضح سابقا 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باختصار، وقطع شرائح من جلد الإنسان (~ 5 سم طول) وعلاج مع thermolysin (0.5 ملغ / مل في المياه المالحة مع 10 ملي HEPES 7.4 درجة الحموضة) O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، فصل البشرة من الأدمة باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ناعما الأدمة إلى قطع صغيرة، ومكان في لوحة 10 سم بيتري والسماح ليجف لمدة 1-2 ساعة تحت تدفق الهواء المعقم. تكملة لل explants بانتظام مع DMEM تحتوي على 20٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الخلايا الليفية النمو بها عندما متموجة (عادة حوالي 3 أسابيع) باستخدام 0.1٪ التربسين والتأكد من أن إإكسبلنتس مواصلة الالتزام لوحة لمزيد من يخدعجولات secutive من ثمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيع الخلايا الليفية من نفس إإكسبلنتس لمدة تصل إلى 3 مرات في DMEM مع 10٪ FBS والبرد الحفاظ عليها 14. استخدام نفس دفعة من الخلايا الليفية لكل سلسلة التجريبية. ملاحظة: لم يتم المشع والخلايا الليفية لمجموعة المتابعة من حكمه عن طريق الجلد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سقالة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 0،4-0،6 مم فسكوزي سميكة، ومادة ليفية محبوكة (تفاصيل المنتج في دعم ورقة اكسل) إلى دوائر ترسيمها جيدا باستخدام حاد 11 مم المعادن الناخس لتناسب بالضبط في 12 جيدا مرشح تدرج. ثم وضعه في 12- جيدا إدراج مرشح (البوليستر المسام الشعرية الغشاء، 3 ميكرون حجم المسام)، وسقالة. وضع الإعداد مرشح الكامل في العقيمة لوحة 12-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير هلام الليفين باستخدام الفيبرين الغراء عدة لعملية جراحية تتكون من مزيج من الفيبرينوجين والثرومبين. قبل تمييع fibrinogen- فضلا عن الثرومبين مكون من مجموعة إلى 8 ملغ / مل و 10وحدة / مل على التوالي. للبئر واحدة من لوحة 12-جيدا المضي قدما على النحو التالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 100 ميكرولتر الفيبرينوجين (8 ملغ / مل) مع 100 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم، ودرجة الحموضة 7.0. تمييع 100 ميكرولتر الثرومبين (10 وحدة / مل) مع 100 ميكرولتر FCS التي تحتوي على 270،000 الليفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء عن 200 ميكرولتر من ثرومبين التي تحتوي على الخلايا الليفية خلية خلط على منصة الاعدام، التي تضيف 200 ميكرولتر الفيبرينوجين (1: 1 خليط)، مما أدى إلى تركيز النهائي من الفيبرينوجين من 2 ملغ / مل والثرومبين من 2.5 وحدة / مل. تخلط جيدا وتوزيعها بالتساوي على كامل منطقة السقالة من قبل pipetting لطيف (يوم 1). ملاحظة: بعد 30 دقيقة عند 37 ° C جلطة إحاطة الليفية سيكون قد شكلت، وملء تماما المساحات الداخلية للسقالة وتشكيل السطح العلوي على نحو سلس. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في الثقافة مع mTECs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمرحلة ما قبل الثقافة، submerse الثقافات الجهاز فيDMEM مع 10٪ FBS، 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك وL-1 نانوغرام / مل TGF-β1 مع تغيير المتوسط ​​كل يوم لمدة 4-5 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم MTEC البذر، استبدل المتوسطة التي كتبها rFAD المتوسطة (1: 1 + DMEM DMEM / F12) مع 10٪ FBS، 10 -10 M بكتيريا الكوليرا، 0.4 ملغ / مل الهيدروكورتيزون، 50 ميكروغرام / مل حمض L-الأسكوربيك، يجند RANK (0.1 ميكروغرام / مل) و 500 وحدة / مل من أبروتينين، وبالتالي منع انحلال الفيبرين المبكر من قبل البروتياز سيرين تفرزها الخلايا الليفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق 8/7 ساعة، انشاء والثقافات مشترك من بذر 250000 mTECs (إما mTECs كاملة، أو CD80 CD80 فرعية لو ومرحبا)، في حجم 100 ميكرولتر لكل بئر على أعلى سقالة الليفية. عد الخلايا باستخدام غرفة نويباور (يوم 4). ملاحظة: في جميع الأوقات مغمور الثقافات عضوي النمط 3D الصعترية في وسائل الإعلام على عكس OTCs الجلد التي هي من رفعت الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة الحضانة، وتزويد الثقافات مع المتوسط ​​(إجمالي التبادل المتوسط) على النحو المذكور أعلاه (الخطوة 2.3.2) الآن containiانخفاض نانوغرام مبالغ أبروتينين، 250 وحدة / مل (يوم 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تقييم النشاط التكاثري من mTECs، إضافة ايدو (6.7 ميكرومتر / مل، أي 10 ميكرومتر / جيد) لOTCs لمدة 4 ساعة قبل انتهاء الثقافات. أداء تلطيخ OTC البرد أقسام كما هو موضح في أدوات ايدو التصوير جنبا إلى جنب مع زملاء تلطيخ الكيراتين 14. تحديد مؤشرات التكاثري من mTECs، إما عن طريق عد خلايا K14 + ايدو + في قسمين من كل عينة الثقافة أو عن طريق التدفق الخلوي (EDU التدفق الخلوي، القسم 1.7 ولكن بدلا من Ly51-FITC استخدام CDR1-PB 15 في التخفيف 1: 100 و2.3.6.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 4-7 أيام من الثقافة المشتركة، إنهاء OTCs وعملية عزل الحمض النووي الريبي، البرد باجتزاء أو تحليل FACS (يوم 11/8). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء الثقافات باستخدام ملقط، وفصل ما يعادل سقالة / الجلد من مرشح من إدراج جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالبرد باجتزاء، تضمين OTC بأكملها في أكتوبر المجمع وتجميد في ليبخار النيتروجين مضغة قبل البرد باجتزاء. إعداد 5-7 ميكرون أقسام OTC سميكة باستخدام ناظم البرد وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. لالمناعية الكيمياء النسيجية من OTCs مقطوع البرد استخدام الألغام المضادة للالكيراتين 14 (AF64، استخدم في 1: 1000 تمييع)، ومكافحة vimentin (GP53، استخدم في 1: 100 تمييع) الأجسام المضادة. أداء غير مباشر تلطيخ المناعية الكيمياء النسيجية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الحمض النووي الريبي، إضافة 1 مل تغيير طبيعة الحل (التي تحتوي على الفينول وguanidinium ثيوسيانات) في سقف المسمار من أنبوب مجانا 2 مل ريبونوكلياز. قطع OTC كلها الى قطع مع مشرط وإضافة إلى الأنبوب الذي يحتوي الحل تغيير طبيعة. أجاد ميكانيكيا OTCs مع FastPrep أداة مرتين لمدة 30 ثانية بسرعة 6.0، ضع في بين على الجليد لمدة 2 دقيقة (يمكن تخزين العينة في -80 ° C بعد هذه النقطة). إذا المجمدة في -80 ° C، ذوبان الجليد على الجليد. أنابيب الطرد المركزي في 11،500-13،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف لنقل أنبوب جديد، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT ووollow بروتوكولات عزل الحمض النووي الريبي باستخدام حمض guanidinium استخراج ثيوسيانات الفينول كلوروفورم كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل FACS، إزالة السقالة وفصل الغشاء من الفيبرين / الليفية / MTEC هلام. قطع ناعما هلام مع مشرط وهضمه في أنبوب FACS ل~ 20 دقيقة أو حتى هضمها تماما مع 2 مل من كولاجيناز / dispase عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مع التحريك المغناطيسي. تستنهض الهمم الحل الانزيم مع ماصة باستور مرة واحدة كل 5 دقائق. بعد الهضم الكامل، تصفية تعليق الخلية من خلال مرشح 70 ميكرون. وصمة عار على تعليق خلية واحدة باستخدام الأجسام المضادة كما هو موضح في 1.7 و تحليل التدفق الخلوي. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self.">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li><li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+for+central+tolerance.">A central role for central tolerance.</a> Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).</li><li>Bonfanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+reprogramming+of+thymic+epithelial+cells+to+skin+multipotent+stem+cells.">Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells.</a> Nature. 466, 978-982 (2010).</li><li>Kont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Aire+regulates+the+expression+of+tissue-restricted+antigens.">Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens.</a> Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).</li><li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development.">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li><li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones.">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li><li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+homeostasis+in+long-term+scaffold-enforced+skin+equivalents.">Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).</li><li>Boehnke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fibroblasts+and+microenvironment+on+epidermal+regeneration+and+tissue+function+in+long-term+skin+equivalents.">Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents.</a> Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).</li><li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression.">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li><li>Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+and+the+developmental+dynamics+of+medullary+thymic+epithelial+cells.">Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells.</a> Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).</li><li>Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus:+a+cell+surface+glycoprotein+expressed+by+subcapsular+and+medullary+epithelium.">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).</li><li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+fibroblast+matrix+in+dermal+equivalents+normalises+epidermal+histogenesis+and+dermoepidermal+junction+in+organotypic+co-culture.">Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture.</a> Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).</li><li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts.">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li><li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells.">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).</li></ol>

الكتاب تعلن أي تضارب المالي أو التجاري للاهتمام.

جنبا إلى جنب مع RTOCs، وقد كان OTCs 3D من قبل أعلى بكثير من حيث التمايز TEC وفريق الخبراء الدائم صيانة / الاستقراء (الجدول 1) بالمقارنة مع غيرها (ط) &quot;ثقافات 3D مبسطة&quot; استخدام - الخلايا الليفية وحدها دون السقالة. (ب) نظم 2D باستخدام - الخلايا الليفية / التغذية شارك في تر...

thymocytes تطوير يشكلون نحو 98٪ من الغدة الصعترية، في حين تتكون المتبقية 2٪ من مجموعة متنوعة من الخلايا التي تؤلف مجتمعة سدى الغدة الصعترية (أي الخلايا الظهارية، والخلايا الجذعية، الضامة، والخلايا B، الخلايا الليفية والخلايا البطانية). الخلايا الظهارية القشرية الخارجية (cTECs) حصاد هجرة الخلايا الموالية-T من نخاع العظم، T نسب الخلية الاستقراء في الخلايا ما قبل-T متعددة القدرات واختيار الإيجابية للMHC الذاتي قيدت thymocytes غير ناضجة. وتشارك الخلايا النخاعية الداخلية الغدة الصعترية الظهارية (mTECs) في الحث التسامح من تلك thymocytes مع تقارب عالية TCR للمجمعات الببتيد الذاتي / MHC إما عن طريق إحداث اختيار سلبية أو انحرافها إلى الخلايا التائية التنظيمية النسب. في سياق الحث التسامح المركزي، mTECs هي فريدة من نوعها من حيث أنها تعبر عن طيف واسع من المستضدات الذاتية المقيدة الأنسجة (ترا) مما يعكس الطرفية النفس. وتسمى هذه الظاهرة منحل التعبير الجيني (فريق الخبراء الدائم)1،2. معظم الدراسات الحالية على هذا النوع من الخلايا رائعة تعتمد على الخلايا المعزولة خارج الحي، ومختلف النظم ثقافة 2D المدى القصير أدت دائما في خسارة فريق الخبراء الدائم والجزيئات منظم رئيسية مثل الطبقة MHC II، FoxN1 واير في غضون أيام 2 الأولى 3-6 . ومع ذلك فإنه لا يزال غير واضح، والتي مكونات وملامح شبكه 3D سليمة من الغدة الصعترية معينة في عداد المفقودين في نماذج 2D. كانت الثقافة الجهاز الغدة الصعترية إعادة التجميع (RTOC) حتى الآن هو النظام الوحيد الذي يسمح 3D دراسة تطوير الخلايا T، من جهة، وبيولوجيا الخلايا اللحمية، من ناحية أخرى، في المكروية الغدة الصعترية سليمة 7. بعد، RTOCs دينا بعض القيود، أي أنها تحتوي بالفعل خليط معقد من الخلايا، تتطلب مدخلات خلايا انسجة الجنين ويدوم فترة ثقافة القصوى من 5 إلى 10 أيام. عدم وجود اختزالية في نظم الاستزراع المختبر أعاق دراسةعدة جوانب T تطوير خلية والتوتة توالد ليس أقلها التنظيم الجزيئي للفريق الخبراء الدائم وعلاقته البيولوجيا التطورية من mTECs. نظرا لقرب القرابة للمنظمة تنظيما للخلايا الظهارية من الجلد والغدة الصعترية، اخترنا ثقافة عضوي النمط (OTC) نظام 3D التي وضعت أصلا لمحاكاة تمايز الخلايا القرنية في المختبر، وبالتالي خلق معادل الجلد. ويتكون النظام OTC من مصفوفة سقالة الخاملة مضافين مع الخلايا الليفية الجلدية التي المحاصرين في هلام الليفين، على الذي هي المصنفة الكيراتينية 8،9. هنا، فإننا استبدال الخلايا الكيراتينية مع mTECs تنقيته. مع الحفاظ على السمات الأساسية لهذا النموذج، ونحن الأمثل معايير معينة. في نموذج OTC اعتمدت انتشرت mTECs، خضع التمايز النهائي والحفاظ على الهوية MTEC وفريق الخبراء الدائم، ومحاكاة بالتالي عن كثب في الجسم الحي تطوير mTECs <sup&gt; 10. توفر هذه الملاحظة الفنية بروتوكول مفصلة السماح للالتدرجي انشاء لOTCs الصعترية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Charles River WIGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Microbeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)</td>
			<td>Ref. 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80-PE antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PerCP antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly51-FITC antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDR1-Pacific Blue</td>
			<td>Ref. 15</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>106-546-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen GmbH)</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10339">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</a></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10339">C10339</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10425">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit</a></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10425">C10425</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well filter inserts (thincerts)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jettex 2005/45</td>
			<td>ORSA, Giorla Minore, Italy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47302.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-049&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Gold</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>A11-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin (Trasylol)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>4032037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>G117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Seromed (Biochrom)</td>
			<td>K3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#223;1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG9214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>462-TR-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;T-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>TissueTek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep FP120</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV&#160;</td>
			<td>CellSystems</td>
			<td>LS004189</td>
			<td>0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrale Protease (Dispase)</td>
			<td>CellSystems</td>
			<td>LS002104</td>
			<td>0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 284 932 001</td>
			<td>25 &#181;g/ml final conc.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d organotypic co-culture model supporting medullary thymic epithelial cell proliferation, differentiation and promiscuous gene expression

وتتطلب التنمية الخلايا T داخل الغدة الصعترية لشبكه ثلاثي الأبعاد معقدة تتألف من خلايا انسجة مختلفة، أي خلايا غير-T. Thymocytes تجتاز هذه السقالة في النظام الزمني والمكاني منسق للغاية في حين يمر بالتتابع نقاط تفتيش إلزامية، أي T التزام النسب الخلية، تليها T مستقبلات الخلايا الجيل ذخيرة واختيار قبل تصديرها إلى الهامش. الاثنان أنواع الخلايا المقيمين الرئيسية تشكيل هذه السقالة هي الخلايا الظهارية الغدة الصعترية القشرية (cTECs) والنخاعية (mTECs). ومن السمات الرئيسية لmTECs هو ما يسمى التعبير منحل العديد من المستضدات المقيدة الأنسجة. يتم عرض هذه المستضدات المقيدة الأنسجة لغير ناضجة thymocytes بشكل مباشر أو غير مباشر عن طريق mTECs أو الخلايا الجذعية الغدة الصعترية، مما أدى على التوالي في التسامح مع النفس. مناسبة في المختبر نماذج محاكاة الممرات وظائف التنموية للcTECs وmTECs هي أمريكا اللاتينية والكاريبي حالياالملك. هذا النقص في نماذج تجريبية كافية وعلى سبيل المثال أعاق تحليل التعبير الجيني منحل، التي لا تزال غير مفهومة على المستوى الخلوي والجزيئي. نحن تكييفها لعضوي النمط نموذج التعاون ثقافة 3D لثقافة فيفو السابقين mTECs معزولة. وقد وضع هذا النموذج في الأصل لزراعة القرنية في مثل هذه الطريقة لتوليد ما يعادل الجلد في المختبر. نموذج 3D الحفاظ على ميزات وظيفية رئيسية من MTEC البيولوجيا: (ط) انتشار والتمايز النهائي من CD80 ها اير سلبية في CD80 مرحبا، اير إيجابية mTECs، (ب) الاستجابة لRANKL، و (ج) التعبير متواصلة من FoxN1، اير والجينات المقيدة الأنسجة في CD80 mTECs مرحبا.

اعتمدنا 3D عضوي النمط نموذج التعاون الثقافة (3D OTC) التي وضعت أصلا لفي المختبر ثقافة على المدى الطويل من الخلايا الكيراتينية 9. وكانت المصنفة mTECs MACS التخصيب (انظر MACS تخصيب مخطط الشكل 1) على سقالة تتألف من هلام الليفين والخلايا الليفية شرك. توفر الخلايا ...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression at JoVE.com

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D عضوي النمط المشارك الثقافة نموذج دعم النخاع التوتة الظهارية تكاثر الخلايا، التمايز ومختلط التعبير الجيني

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K Views.  German Cancer Research Center (DKFZ). Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression. 

Video: 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to tissue and cell-type specific regulation of gene expression during the cellular differentiation. Thus, their identification and further investigation is important in order to understand how cell fate is determined. Integration of gene expression data (e.g., microarray or RNA-seq) and results of chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based genome-wide studies (ChIP-seq) allows large-scale identification of these regulatory regions. However, functional validation of cell-type specific enhancers requires further in vitro and in vivo experimental procedures. Here we describe how active enhancers can be identified and validated experimentally. This protocol provides a step-by-step workflow that includes: 1) identification of regulatory regions by ChIP-seq data analysis, 2) cloning and experimental validation of putative regulatory potential of the identified genomic sequences in a reporter assay, and 3) determination of enhancer activity in vivo by measuring enhancer RNA transcript level. The presented protocol is detailed enough to help anyone to set up this workflow in the lab. Importantly, the protocol can be easily adapted to and used in any cellular model system.

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

التنبؤ والتحقق من جين تنظيم عناصر المنشط خلال الريتينويك حمض المستحثة الجنينية الجذعية تمايز الخلايا

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

العلاج الجيني الفيروسة الغدانية لمرضى السكري اعتلال القرنية: التأثيرات على شفاء الجروح ووقف علامة الخلية التعبير في الإنسان القرنيات الجهاز مثقف والخلايا الظهارية الحوفي

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

الترتيب الزمني للبيانات التعبير الحيوي من التعبير المكاني مفصل خرائط

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended effects that extrinsic patterning factors might introduce into human pluripotent stem cell (hPSC) models of brain development or pathophysiology, such as masking disease phenotype. Here, we present two cerebellar differentiation protocols for hPSCs, designed with simpler startup method, fewer patterning factors, and less material requirements than previous protocols. Recently, we developed culture procedures, which generate free-floating 3-dimensional (3D) products consistent with other brain &#34;organoid&#34; protocols, including morphologies relevant to modeling brain development such as sub/ventricular zone- and rhombic lip-like structures. The second uses an adherent, 2D monolayer procedure to complete differentiation, which is shown capable of generating functional cerebellar neurons, as products are positive for cerebellar-associated markers, and exhibit neuron-like calcium influxes. Together, these protocols offer scientists a choice of options suited to different research purposes, as well as a basic model for testing other types of streamlined neural differentiations.

We describe a simplified 3D differentiation protocol for hPSCs, using defined medium and reduced growth factors, capable of generating cell aggregates with early neuroepithelial structures and positive for cerebellar-associated markers, as well as an optional 2D modification for differentiating cells as a monolayer to generate functional neurons.

بروتوكول التمايز الدماغ 3D مبسطة مع التعديل 2D اختياري

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of hematological pathologies. Despite the most relevant data that can be acquired using in vivo models or primary cultures, the low abundance of hematopoietic stem and progenitor cells considerably restricts the pool of suitable techniques for their investigation. Therefore, the use of cell lines allows sufficient production of biological material for the performance of screenings or assays that require large cell numbers. Here we present a detailed description, readout, and interpretation of proliferation and differentiation assays which are used for the investigation of processes involved in myelopoiesis and neutrophilic differentiation. These experiments employ the 32D/G-CSF-R cytokine dependent murine myeloid cell line, which possesses the ability to proliferate in the presence of IL-3 and differentiate in G-CSF. We provide optimized protocols for handling 32D/G-CSF-R cells and discuss major pitfalls and drawbacks that might compromise the described assays and expected results. Additionally, this article contains protocols for lentiviral and retroviral production, titration, and transduction of 32D/G-CSF-R cells. We demonstrate that genetic manipulation of these cells can be employed to successfully perform functional and molecular studies, which can complement results obtained with primary hematopoietic stem and progenitor cells or in vivo models.

Here detailed protocols for culturing the murine myeloid precursor 32D/G-CSF-R cell line, performing viral infections, and carrying out proliferation and differentiation assays are presented. This cell line is suitable for studying myeloid cell development, and the role of genes of interest in myeloid cell growth and neutrophilic differentiation.

انتشار وتمايز السلائف النقوي موريني 32D/ز-CSF-R الخلايا

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

الأرقاء أعاده برمجه الخلايا الليفية البشرية عن طريق التعبير القسري من عوامل النسخ

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

نموذج تعبير كيميائي خارج الرحم لاختبار توظيف الضامة في فيفو

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...