Name: 3d organotypic co-culture model supporting medullary thymic epithelial cell proliferation, differentiation and promiscuous gene expression
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression at JoVE.com

This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium &#8220;Tolerage&#8221;, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-W&#252;rttemberg.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Regierungspräsidium Karlsruhe zugelassen. Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) untergebracht ist. Für alle Kulturexperimenten Maus Jungtieren, die von 1 bis 7 Tage alt verwendet. 1. Isolierung von mTEZ aus Thymus HINWEIS: Die folgenden Schritte Verdauung wurden wie zuvor 1 unter sterilen Bedingungen mit einigen Modifikationen wie folgt beschrieben durchgeführt. <ol><li> Enthaupten die Maus Welpen und nehmen Sie den Thymus. Setzen Sie den Thymi auf Eis in einer Petri Platte mit RPMI 1640-Medium (enthaltend 5% FCS). </li><li> Schneiden Sie die Thymi in feine, kleine Stücke schneiden und in einem Rundrohr mit ~ 5-30 ml RPMI-Medium und sanft umrühren mit einem Magneten für 10 min bei RT. </li><li> Danach dekantiert die überstehende, die hauptsächlich Thymozyten und verdauen die verbleibende Gewebe nacheinander mit einer Runde collagenaSE-Typ IV (0,2 mg / ml und 57 U / ml Endkonzentration concentartion) für 15 min bei 37 ° C, gefolgt von Collagenase / Dispase (0,2 mg / ml und 1,2 U / ml Endkonzentration) für jeweils 25 min bei 37 &amp; deg; C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren bis zum Thymi vollständig verdaut. Verwenden Sie 1 ml Enzym pro zwei vor drei Thymi. </li><li> Man schüttelt das Gewebe einmal alle 7-10 min mit einer Pasteurpipette. Bündeln die Kollagenase / Dispase Fraktionen und durch ein 70 &amp; mgr; m Gaze. </li><li> Bereichern die mTEZ durch magnetische Zellsortierung (MACS). Führen die Reinigung von mTEZ durch magnetische Zellsortierung wie zuvor 11 beschrieben und in Abbildung 1 dargestellt. HINWEIS: Bei Magnetsortierung mTEZ verwendeten wir die folgenden Antikörper: anti-CD80-PE (16-10A1, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) und Anti-EpCAM-bio (G8.8, Einsatz bei Verdünnung 1: 100) 12. Unreifen und reifen mTEZ mit MACS wurden wie folgt definiert: CD45 - EpCAM + CD80 - und CD45 - CD80 + JEWEILIGENEly. </li><li> Nach Reinigung MACS (Reinheit von unreifen mTEZ = 83,1 ± 6,3% und reifen mTEZ = 79,23 ± 3,42%), die Samen mTEZ auf die organotypischen Kulturen, wie unten beschrieben (Abschnitt 2.3). </li><li> Alternativ Art mTEZ durch FACS (unter Verwendung von 100 &amp; mgr; m Düse) nach CD45 MACS Erschöpfung mit den folgenden Antikörpern: anti-CD45-PerCP (30-F11, Einsatz bei 1: 100 Verdünnung), Anti-Ly51-FITC (6C3, verwenden Sie bei 1 : 100-Verdünnung), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, Verwendung einer 1: 500 Verdünnung) und Anti-CD80-PE (16-10A1, Verwendung bei 1: 100 Verdünnung). Ausschließen toten Zellen mit Propidiumiodid (1: 5.000) (Tag 4). Unreifen und reifen mTEZ mit FACS wurden wie folgt definiert: - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - und PI - CD45 - Ly51 - PI EpCAM + CD80 + sind. </li></ol> 2. 3D Organotypische Co-Kulturen (OTCs) HINWEIS: Die 3D-Hautkonstrukte für organotypischen Kultivierung keratinocytes wurden wie zuvor beschrieben hergestellt, 9,13. Bei allen Schritten wurden die Zellen bei 37 ° C inkubiert und 5% CO 2. Die OTCs Verwendung mTEZ wurden mit leichten Modifikationen, wie folgt hergestellt. <ol><li> Herstellung von menschlichen Fibroblasten HINWEIS: Die humanen Hautfibroblasten wurden aus Explantatkulturen von de-epidermised Dermis wie zuvor 9 beschrieben, erhalten. <ol><li> Kurz gesagt, geschnittenen Streifen der menschlichen Haut (~ 5 cm Länge) und behandle mit Thermo (0,5 mg / ml in Kochsalzlösung mit 10 mM Hepes pH 7,4) O / N bei 4 ° C. </li><li> Danach trennen Sie die Epidermis von der Dermis mit einer Pinzette. </li><li> Fein in einer 10 cm Petrischale schneiden die Lederhaut in kleine Stücke, Ort und lassen Sie sie für 1-2 Stunden unter einem sterilen Luftstrom trocknen. Ergänzen die Explantate regelmäßig mit DMEM, das 20% FBS. </li><li> Teilen Sie die aus wachsenden Fibroblasten bei konfluenten (in der Regel etwa 3 Wochen) mit 0,1% Trypsin, sicherzustellen, dass die Explantate weiterhin auf die Platte für weitere con haftenaufeinander folgenden Runden der Auswuchs. </li><li> Erweitern Sie die Fibroblasten aus dem gleichen Explantate für bis zu 3-mal in DMEM mit 10% FBS und Kryo-bewahren 14. Verwenden Sie die gleiche Charge von Fibroblasten für jede Versuchsreihe. HINWEIS: Die Fibroblasten wurden nicht für den Aufbau der Hautäquivalente bestrahlt. </li></ol></li><li> Vorbereitung des Scaffold <ol><li> Schneiden Sie die 0,4-0,6 mm dicken Viskose, Vliesfasermaterial (Produktdetails bei der Unterstützung der Excel-Tabelle) in gut abgegrenzten Kreise mit einem scharfen 11 mm Durchmesser Metall Puncher genau in 12-Well-Filtereinsätze passen. Dann legen Sie sie in den 12-Well-Filtereinsatz (Polyester kapillare Porenmembran, 3 &amp; mgr; m Porengröße) als Gerüst. Setzen Sie den kompletten Filter-Setup in eine sterile 12-Well-Platte. </li><li> Vorbereiten des Fibringels Verwendung eines Fibrinkleber-Kit für die Chirurgie bestehend aus einer Kombination von Fibrinogen und Thrombin. Pre-Verdünnung des Fibrinogen- sowie die Thrombin-Komponente des Kits bis 8 mg / ml und 10Einheiten / ml. Für eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte wie folgt vorgehen. <ol><li> 100 ul verdünnte Fibrinogen (8 mg / ml) mit 100 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ und Mg 2+, pH 7,0. Verdünnter 100 ul Thrombin (10 Einheiten / ml) mit 100 ul FCS enthaltenden 270.000 Fibroblasten. </li><li> Verzichtet werden 200 ul Thrombin Fibroblasten enthaltende zell mischen auf das Stützgerüst, wozu 200 &amp; mgr; l Fibrinogen hinzuzufügen (1: 1-Mischung), was zu einer Endkonzentration von Fibrinogen von 2 mg / ml und Thrombin von 2,5 Einheiten / ml. Gut mischen und gleichmäßig zu verteilen über die gesamte Fläche des Gerüsts durch vorsichtiges Pipettieren (Tag 1). HINWEIS: Nach 30 Minuten bei 37 ° C ein Gerinnsel umschließt den Fibroblasten gebildet haben, Füllen vollständig die Innenräume des Gerüsts und eine glatte obere Oberfläche. </li></ol></li></ol></li><li> Co-Kultur mit mTEZ <ol><li> Für Vorkultur, Tauchen Sie das Organkulturen inDMEM mit 10% FBS, 50 &amp; mgr; g / ml L-Ascorbinsäure und 1 ng / ml TGF-β1 mit einem Mediumwechsel alle zwei Tage für 4-5 Tage. </li><li> Am Tag der Aussaat mTEC Ersetzen des Mediums durch RFAD Medium (1: 1 DMEM + DMEM / F12) mit 10% FBS, 10 -10 M Choleratoxin, 0,4 mg / ml Hydrocortison, 50 &amp; mgr; g / ml L-Ascorbinsäure, RANK-Ligand (0,1 ug / ml) und 500 Einheiten / ml Aprotinin, wodurch frühreifen Fibrinolyse von Serinproteasen durch Fibroblasten sezerniert. </li><li> 7-8 Stunden später, die Co-Kulturen Set-up durch Impfen 250.000 mTEZ (entweder komplett mTEZ oder CD80 lo und CD80 hallo Untergruppen) in einem Volumen von 100 ul pro Vertiefung auf der Oberseite des Fibroblasten-Gerüst. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Neubauer Kammer (Tag 4). HINWEIS: Zu allen Zeiten der Thymus 3D organotypischen Kulturen werden in den Medien im Gegensatz zu Haut OTCs, die Klima aufgehoben sind untergetaucht. </li><li> Nach 24 Stunden Inkubation, liefern die Kulturen mit Medium (insgesamt Trägeraustausch) wie oben (Schritt 2.3.2) genannte jetzt haltendeng reduzierten Mengen Aprotinin, 250 Einheiten / ml (Tag 5). </li><li> Um die proliferative Aktivität von mTEZ beurteilen, fügen EdU (6,7 &amp; mgr; M / ml, das heißt 10 &amp; mgr; / Vertiefung) zu OTCs für 4 Stunden vor der Beendigung der Kultur. Führen Sie die Färbung von OTC Kryo-Abschnitte, wie in der EdU Imaging Kit in Kombination mit Co-Färbung von Keratin 14 in zwei Abschnitte einer jeden Kultur Probe oder durch Strömungs beschrieben Bestimmen Sie die proliferative Indizes mTEZ, entweder durch Zählen der K14 + EdU + Zellen Durchflusszytometrie (EDU Durchflusszytometrie, Abschnitt 1.7, aber statt Ly51-FITC verwendet CDR1-PB 15 bei einer 1: 100 Verdünnung und 2.3.6.4). </li><li> Nach 4-7 Tagen der Co-Kultur, kündigen die OTCs und Verfahren zur RNA-Isolierung, Kryo-Schnitte oder FACS-Analyse (Tag 8-11). <ol><li> Beenden der Kulturen mit einer Pinzette, Abtrennen der Gerüst / dermales Äquivalent vom Filter des Bohrlochs Einfügen. </li><li> Für Kryo-Schnitte, betten die gesamte OTC in OCT-Verbindung und frieren in liquid Stickstoffdampf vor dem Kryo-Schnitte. Bereiten Sie 5-7 um dicke OTC Abschnitte mit einem Kryostaten und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Für Immuno-Histochemie von Kryo-geschnitten OTCs ein anti Keratin 14 (AF64, Verwendung einer 1: 1000 Verdünnung) und anti-Vimentin (GP53, die Verwendung einer 1: 100 Verdünnung) Antikörper. Führen Sie die indirekte Immunhistochemie Färbung mit entsprechenden Sekundärantikörper. </li><li> Für die RNA-Isolierung, 1 ml Denaturierungslösung (enthält Phenol und Guanidiniumthiocyanat) in einer Schraubkappe eines 2 ml RNase frei Rohr. Schneiden Sie die gesamte OTC in Stücke mit einem Skalpell und fügen Sie in das Röhrchen mit Denaturierungslösung. Mechanisch zerkleinern das OTCs mit FastPrep Instrument zweimal für 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 6,0, legen Sie in zwischen auf Eis für 2 min (die Probe bei -80 ° C nach diesem Punkt gespeichert werden). Wenn bei -80 ° C eingefroren, aufgetaut auf Eis. Zentrifugieren der Rohre an 11,500-13,000 Upm 10 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein frisches Röhrchen, Inkubation für 5 min bei RT und follow RNA Isolation Protokolle unter Verwendung von sauren Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion, wie vom Hersteller beschrieben. </li><li> Für die FACS-Analyse, entfernen Sie das Gerüst und trennen Sie die Membran aus dem Fibrin / Fibroblasten / mTEC Gel. Feinschnitt das Gel mit einem Skalpell und verdauen in einem FACS-Röhrchen für ~ 20 min oder bis vollständig mit 2 ml Collagenase / Dispase bei 37 ° C in einem Wasserbad unter magnetischem Rühren verdaut. Rühren der Enzymlösung mit einer Pasteurpipette einmal alle 5 min. Nach der vollständigen Verdauung, filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 &amp; mgr; m-Filter; Flecken auf der Einzelzellsuspension mit den Antikörpern, wie in 1.7 beschrieben, und mittels Durchflusszytometrie analysiert. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self.">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li><li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+for+central+tolerance.">A central role for central tolerance.</a> Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).</li><li>Bonfanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+reprogramming+of+thymic+epithelial+cells+to+skin+multipotent+stem+cells.">Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells.</a> Nature. 466, 978-982 (2010).</li><li>Kont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Aire+regulates+the+expression+of+tissue-restricted+antigens.">Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens.</a> Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).</li><li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development.">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li><li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones.">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li><li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+homeostasis+in+long-term+scaffold-enforced+skin+equivalents.">Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).</li><li>Boehnke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fibroblasts+and+microenvironment+on+epidermal+regeneration+and+tissue+function+in+long-term+skin+equivalents.">Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents.</a> Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).</li><li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression.">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li><li>Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+and+the+developmental+dynamics+of+medullary+thymic+epithelial+cells.">Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells.</a> Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).</li><li>Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus:+a+cell+surface+glycoprotein+expressed+by+subcapsular+and+medullary+epithelium.">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).</li><li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+fibroblast+matrix+in+dermal+equivalents+normalises+epidermal+histogenesis+and+dermoepidermal+junction+in+organotypic+co-culture.">Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture.</a> Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).</li><li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts.">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li><li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells.">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanzielle oder kommerzielle Interessenkonflikt.

Neben RTOCs, haben die 3D-OTCs weit überlegen in Bezug auf die TEC Differenzierung und PGE Wartung / Induktion (Tabelle 1) im Vergleich zu anderen (i) &quot;vereinfachte 3D-Kulturen&quot; mit Hilfe gewesen - Fibroblasten allein, ohne das Gerüst; (Ii) 2D-Systeme mit - Fibroblasten / Feeder-Zellen co-kultiviert mit TECs 10, (iii) 3T3-J2-Zellen bei TEC Klone zu entwickeln, aber pGE verloren geht, (iv) Matrigel oder (v) ECM-Komponenten (unveröffentlichte Daten). PGE wurde für bis zu 7 Tage in der 3D-OTCs gehalten, 4 Tage ist das optimale Zeitpunkt danach beginnt pGE zu sinken. Andere morphologische Eigenschaften TEC wurden für bis zu 14 Tage gehalten. Interessanterweise die OTCs unterstützte das Endstadium der mTEC Differenzierung von den gelegentlich gebildet Hassall artigen Strukturen 10 zu sehen. Die für OTCs verwendet Thymi wurden von jungen postnatalen Mäusen, da sie eine höhere Neigung zu in Kultur überleben im Vergleich zu erwachsenen Thymi. TECs abgeleitet from embryonalen Thymi noch nicht in OTCs getestet. Mehr noch, nach der langen Verdauungszeit (nicht unter Verwendung von Trypsin durch Spaltung bestimmter Epitope) die Zellen erschienen mehr lebensfähig mit MACS anstatt FACS-Sortierung Zellen. Mit Hilfe eines zweistufigen positive Bereicherung Protokoll über MACS Säulen (anti-PE Perlen) der CD80 + mTEZ zusätzlich verbessert TEC Reinheit. Für die OTC-Setup ist es wichtig, sicherzustellen, dass der Viskose, Vliesfasermaterial in scharfe, gut abgegrenzte Kreise ohne lose Fragmente Enden abgeschnitten oder gezackt, wie oben angegeben, dass genau in 12-Well-Kultureinsätze passen. Alternativ können Gerüste wie BEMCOT- Viskose Wischer M-3 (http://www.bemliese.com) ebenfalls verwendet werden. Die gut Größe für den OTC ist auch entscheidend und sollte überprüft werden, wenn andere als 6-Loch-und 12-Well-Formate Plattenformate verwendet werden. Die Fibrin-Gel sollten darauf vorbereitet sein, dass die Fibrinogen und Thrombin-Komponenten nicht in contac komment miteinander, bevor sie auf dem OTC eingestellt, stellen Sie sicher, um die Pipettenspitze auszutauschen. Mischen Sie die beiden Komponenten gründlich in der Platte über das Gerüst, um eine glatte Oberfläche zu bilden. Immer in einem gut vorbereiten einen Test Gel neben ohne Gerüst, um eine ordnungsgemäße Gerinnselbildung zu prüfen und um eine gute Schätzung der Zeit für die Blutgerinnung erforderlich ist. Stellen Sie sicher, dass das Fibrin-Gel in der OTC vollständig, bevor die Versorgung der Kulturen mit Medien geronnen. Bei Beendigung der Kulturen die gesetzten mTEZ kann leicht durch enzymatische Verdauung (Kollagenase / Dispase) des Fibrin-Gel, die zur Charakterisierung von kultivierten mTEZ zB verwendet werden können abgerufen werden, durch Durchflusszytometrie oder PCR. Die hierin beschriebenen 3D OTCs hat das Potenzial, einige Parameter TEC nämlich studieren oder zu manipulieren: 1) zu untersuchen und / oder zu manipulieren (via siRNA, Morpholino Oligos) Entwicklungswege und Funktionen der mTEZ; 2) um die Rolle des mTEZ in T-Zell-Entwicklung zu untersuchenment; 3) die Kultur CTEC; 4), um die Vorläufer Potenzial der Thymus-Stammzellen zu testen; 5), um die menschliche Kultur TECs und Stammzellen; 6) Einzel TEC klonale Assays durchzuführen. Die 3D-OTCs stellen eine aufwendige Kulturtechnik Emulation Teil der in vivo-Mikroumgebung Thymus. Es sollte betont werden, dass zusätzliche Assays TECs im aktuellen OTC Einrichtung angewendet werden müssen gründlich getestet und separat optimiert werden.

Entwicklung von Thymozyten machen etwa 98% des Thymus, die restlichen 2% bestehen aus einer Vielzahl von Zellen, die zusammen bilden den Thymus-Stroma (dh Epithelzellen, dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen, Fibroblasten, Endothelzellen). Die äußeren kortikalen Epithelzellen (CTEC) beschaffen Einwanderung von Pro-T-Zellen aus dem Knochenmark, T-Zell-Linie Induktion in multi pre-T-Zellen und positive Selektion von selbst MHC beschränkt unreifen Thymozyten. Die inneren Mark Thymusepithelzellen (mTEZ) in Toleranzinduktion dieser Thymozyten mit einer hochaffinen TCR Selbst Peptid / MHC-Komplexen durch entweder induzierende negative Selektion oder deren Abweichung in den regulatorischen T-Zelllinie beteiligt. Im Zusammenhang mit der zentralen Toleranzinduktion sind mTEZ, daß sie ein breites Spektrum von gewebe beschränkt Selbst-Antigene (TAA), die so Spiegeln des peripheren selbst exprimieren einzigartig. Dieses Phänomen wird als Promiscuous Genexpression (pGE)1,2. Die meisten aktuellen Studien zu diesem faszinierenden Zelltyp verlassen sich auf ex vivo isolierten Zellen, wie verschiedene kurzfristige 2D-Kultursystemen unweigerlich zum Verlust von PGE und Schlüsselregulator Moleküle wie MHC-Klasse II, FOXN1 und Aire in den ersten 2 Tagen 3-6 geführt . Es blieb jedoch unklar, welche bestimmte Komponenten und Funktionen des intakten 3D Geflecht des Thymus in 2D-Modelle fehlt. Die Reaggregation Thymus-Organkultur (RTOC) bisher das einzige 3D-System, das die Untersuchung der T-Zell-Entwicklung ermöglicht, einerseits und stromal cell biology, auf der anderen Seite war, in einer intakten Thymus Mikro 7. Dennoch haben RTOCs bestimmte Beschränkungen, das heißt sie enthalten bereits eine komplexe Mischung von Zellen, erfordern die Eingabe von fötalen Stromazellen und ertragen einer maximalen Kultivierungsdauer von 5 bis 10 Tagen. Der Mangel an reduktionistischen in vitro Kultursystemen hat das Studium behindertmehrere Aspekte der T-Zell-Entwicklung und Thymus Organogenese nicht zuletzt die molekulare Regulation von PGE und seiner Beziehung zu der Entwicklungsbiologie mTEZ. Durch die enge Bezogenheit der strukturierten Organisation der Epithelzellen der Haut und der Thymus, entschieden wir uns für ein 3D organotypische Kultur (OTC) System, das ursprünglich entwickelt worden war, um die Differenzierung von Keratinozyten in vitro nachzuahmen und so eine dermale Äquivalent. Die OTC-System besteht aus einem inerten Gerüstmatrix mit dermalen Fibroblasten, die in einem Fibrin-Gel, auf die Keratinozyten ausgesät 8,9 gefangen sind überlagert. Hier ersetzt wir Keratinozyten mit gereinigtem mTEZ. Und dabei die grundlegenden Merkmale dieses Modells optimierten wir bestimmte Parameter. In der angenommenen OTC Modell mTEZ vermehrt unterzog terminalen Differenzierung und gepflegt mTEC Identität und PGE, somit eng in vivo mTEZ Entwicklung nachahmt <sup&gt; 10 ist. Dieses Datenblatt ein detailliertes Protokoll, das die schrittweise Einrichtung von Thymus OTCs.

<table><tbody><tr><td>Pregnant C57BL/6 mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Microbeads, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)</td><td>Ref. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD80-PE antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PerCP antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pacific Blue</td><td>Ref. 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratin 14 antibody</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin antibody</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab&#039;)2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&amp;nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Molecular Probes (Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>12-well filter inserts (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td>657631</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, Italy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin (Trasylol)</td><td>Bayer</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Seromed (Biochrom)</td><td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;szlig;1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&amp;nbsp;T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV&amp;nbsp;</td><td>CellSystems</td><td>LS004189</td><td>0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.</td></tr><tr><td>Neutrale Protease (Dispase)</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.</td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 &amp;micro;g/ml final conc.</td></tr></tbody></table>

3d organotypic co-culture model supporting medullary thymic epithelial cell proliferation, differentiation and promiscuous gene expression

Intra-Thymus-T-Zell-Entwicklung erfordert ein kompliziertes dreidimensionales Maschenwerk aus verschiedenen Stromazellen, dh Nicht-T-Zellen. Thymocyten durchqueren dieses Gerüst in einem hoch koordinierten zeitliche und räumliche Ordnung, während sequentiell vorbei obligatorischen Kontrollpunkte, dh T-Zelllinie Engagement, gefolgt von T-Zell-Rezeptor-Repertoire und Auswahl vor der Ausfuhr in die Peripherie. Die beiden wichtigsten ansässigen Zelltypen bilden dieses Gerüst sind kortikalen (CTEC) und Mark Thymusepithelzellen (mTEZ). Ein Schlüsselmerkmal der mTEZ ist die sogenannte Promiscuous Expression zahlreicher gewebe beschränkten Antigenen. Diese gewebe beschränkten Antigenen präsentiert werden, um Thymozyten direkt oder indirekt durch unreife mTEZ oder Thymus-dendritische Zellen, die jeweils resultierenden Selbsttoleranz. Geeignete in vitro Modelle emuliert die Entwicklungswege und Funktionen der CTEC und mTEZ liegen noch lacKönig. Dieser Mangel an angemessenen experimentellen Modellen hat zum Beispiel beeinträchtigt die Analyse der Promiscuous Genexpression, die immer noch schlecht auf zellulärer und molekularer Ebene verstanden wird. Wir angepasst 3D organotypischen Co-Kultur-Modell zur Kultur ex vivo isolierten mTEZ. Dieses Modell wurde ursprünglich entwickelt, um Keratinozyten derart zu kultivieren, um eine Hautäquivalents in vitro zu erzeugen. Das 3D-Modell beibehalten wichtigsten Funktionsmerkmale mTEC Biologie: (i) die Proliferation und terminale Differenzierung von CD80 lo, Aire-negative in CD80 hallo, Aire-positive mTEZ, (ii) Reaktionsfähigkeit auf RANKL, und (iii) nachhaltige Ausdruck FOXN1, Aire und gewebe eingeschränkt Gene in CD80 hallo mTEZ.

Wir nahm eine 3D organotypischen Co-Kultur-Modell (3D OTC), die ursprünglich für die in-vitro-Langzeitkultur von Keratinozyten 9 entwickelt hatte. MACS-angereicherten mTEZ (siehe MACS Anreicherung Schema Abbildung 1) wurden auf ein Gerüst aus einer Fibrin-Gel und eingeschlossene Fibroblasten ausgesät. Die Fibroblasten stellen die wesentlichen extrazellulären Matrix (ECM), welche mTEZ in vitro. MTEZ wurden in OTCs für 4-14 Tage in Gegenwart von RANKL in Submerskulturen Gegensatz Keratinozyten, die Luft ausgesetzten imitiert ihre in vivo-Umgebung (siehe OTC-Set-up-Schema Abbildung 2) sind kultiviert. Beide Teilmengen mTEC hier analysiert (dh CD80 lo und CD80 hallo mTEZ) überlebt während der gesamten Kulturdauer von bis zu 14 Tagen. MTEZ wurden von Keratin 14-Expression identifiziert und waren leicht von Vimentin-positive Fibroblasten (Abbildung <strong&gt; 3A, 3B). Interessanterweise stieg unreifen und reifen mTEZ in verschiedene Muster in der Kultur. Die CD80 lo mTEZ typischerweise gebildet Doppelschichten (in engem Kontakt mit Fibroblasten), während CD80 hallo mTEZ eher kompakten Zellaggregate durch Fibroblasten begrenzt zu bilden. Diese Muster waren sehr gut reproduzierbar. Gang MTEC Teilmengen nicht nur überlebt, sondern auch unter 3D OTC Bedingungen vermehrt wie von Edu Einbau (Abbildung 3c, 3d) bewertet. Interessanterweise proliferierte die CD80 lo mTEZ mit einer höheren Rate in Anwesenheit von RANKL, während das Umgekehrte für CD80 hallo mTEZ 10 betrug. Zusätzlich CD80 lo mTEZ in CD80 hallo mTEZ in Anwesenheit von RANKL innerhalb von 4 Tagen Kultur unterschieden, da durch die starke Hochregulierung von CD80 gekennzeichnet. Die differenzierten mTEZ die Expression von Aire, FOXN1 (Gen und p erhalten auchrotein) sowie wahllos Ausdruck Aire-unabhängigen und -abhängigen TRAs 10. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52614/52614fig1.jpg" /> Abbildung 1. MACS Anreicherung von TECs. Nach dem Filtrieren wurden mTEZ aus dem Thymus Einzelzellsuspension unter Verwendung von magnetischen Zellsortierung (MACS) angereichert. Zunächst wurden die hämatopoetischen Zelllinien unter Verwendung von anti-CD45 Microbeads verarmt. Die CD45 - Zellen wurden dann mit anti-CD80 PE Antikörper inkubiert, gefolgt von Anti-PE Microbeads. Das Eluat, das CD80 + -mature mTEZ direkt auf der OTCs kultiviert, während die Durchfluss enthaltenen CD80 - unreife mTEZ und andere Stromazellen. MTEZ wurden weiter unter Verwendung von anti-EpCAM-bio-Antikörper und Streptavidin-Mikroperlen angereichert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52614/52614fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </a&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52614/52614fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schema für die schrittweise Einstellung des 3D-OTCs. Gerüstmatrix wurde in eine 12-Well-Filtereinsatz platziert. Die dermalen Fibroblasten aus explantierten Haut (270.000 Zellen / OTC Vertiefung) wurden in ein Fibringel (: 1 Verhältnis von Fibrinogen und Thrombin, die aus 1) beimpft. Diese dermalen Äquivalente wurden für 4-5 Tage mit DMEM + Nährstoffen aufrechterhalten, bis mTEZ (250.000 Zellen / OTC Vertiefung) wurden auf ausgesät und mit Medium mit unterschiedlichen Nährstoff (RFAD + Nährstoffe) angereichert kultiviert. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52614/52614fig3.jpg" /> Abbildung 3. Wachstumsmuster und die Proliferation von mTEZ im OTCs. Das angereicherte CD80 lo mTEZ neigen als bi-Schicht in engem Kontakt mit den Fibroblasten (A), wachsen wh<html> ereas die differenzierte CD80 hallo mTEZ wachsen als Zellaggregate oder engen Clustern (B). OTCs wurden am Tag 4 der Kultur mit anti-Keratin-14 (rot) und anti-Vimentin-Antikörper (grün) sowie eine Kernfärbung (Hoechst, blau) markiert. Die Proliferation von mTEZ zu bewerten, wurden die OTCs mit EdU gepulst (6,7 &amp; mgr; M / ml, das heißt 10 &amp; mgr; / Vertiefung) für 4 Stunden vor der Beendigung der Kultur. Die OTC Kryo-Schnitte wurden dann mit Anti-Keratin 14 (grün) angefärbt und EDU-Klicken-iT Reaktionsmischung (magenta) zusammen mit Kernfärbung (Hoechst, blau). Repräsentative Bilder zeigen wuchernden EdU + CD80 lo mTEZ (C) und EdU + CD80 hallo mTEZ (D) gezeigt sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52614/52614fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Reaggregation Thymus Organkulturen (RTOC) </td><td> Organotypischen Co-Kulturen (OTC) </td></tr><tr><td> Nützliches System zur zellulären Interaktionen, die leicht überwacht und manipuliert mit einem weitgehend intakten Thymus 3D-Architektur werden zu studieren; entwickelt sich zu einer gut organisierten Struktur nach Transplantation. </td><td> Nützliches System für die Entwicklung und Differenzierung von angereichertem / gereinigte Thymusepithelzellen in einer künstlichen 3D Geflecht durch menschliche Hautfibroblasten in einem Fibrin-Gerüst eingeschlossen erzeugt studieren. </td></tr><tr><td> Für die Untersuchung der Entwicklung des Thymusepithelzellen und Thymozyten mit Inhibitoren oder Modifikatoren, die die Kapsel eindringen gut etabliert. </td><td> Zugänglich Thymus Epithelienentwicklung manipulieren oder Thymocyten-Entwicklung in Co-Kultur mit TECs studieren. </td></tr><tr><td> Da das Systemluft angehoben wird, wird die Porengröße der Membran (0,8 um) entscheidende Faktoren bei der Zuführung zu der RTOC: größere Moleküle können nicht durch die Membran und / oder Kapsel eindringen. </td><td> Kultur wird in Medien, die Aufnahme von Stoffen / Faktoren erleichtert getaucht (mit Morpholino-Oligos erfolgreich getestet). </td></tr><tr><td> Erwachsene und postnatale TECs oder Thymozyten können in fetalen RTOCs versetzt werden. </td><td> Post-Natal TECs wachsen besser als erwachsene TECs; fetale TECs noch nicht getestet. </td></tr><tr><td> Erfordern embryonalen E14-14.5 Thymi (optimal) zur Reaggregation und Integration des Mehr gewünschte Population zu ermöglichen; schwierig, den fetalen Thymus (Akzeptor) Zellzusammensetzung zu steuern; RTOCs erfordern Zellen entweder von fluoreszenzmarkierten oder kongenen Mäusen als Donor oder Akzeptor-Zellen. </td><td> Möglich, einzelne Zellen / Klone zu studieren; nur &quot;Verunreinigungen&quot; sind Menschen erforderlich, um ECM, die TECs zu unterstützen Haut-Fibroblasten. </td></tr><tr><td> Imaging limited, um Tiefe von Live-Zwei-Photonen-Mikroskopie Penetration; zugänglich FACS-Analyse oder Sortieren; Genexpressionsstudien erfordern FACS-Sortierung der gewünschten Zelltyp nach Kultur. </td><td> Uneingeschränkt zugänglich Bildgebung; geeignet für die FACS-Analyse, Immunhistochemie und Genexpressionsstudien. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Vergleich zwischen zwei 3D-Thymus-Kultursystemen.

Watch this Scientific Journal Video about 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression at JoVE.com

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K Aufrufe.  German Cancer Research Center (DKFZ). Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression. 

Serie: 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Forschung

Krebsforschung

Reaggregate Thymus Cultures

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

In this video the preparation of 2-dGuo-treated reaggregate thymus cultures is demonstrated.

Reaggregieren Thymus Kulturen

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and ...

Biologie

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Biotechnik

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Entwicklungsbiologie

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed in order to create testicular organoids. Many of these methods rely upon extracellular matrix (ECM) to promote de novo tissue assembly, however, there are differences between methods in terms of biomimetic morphology and function of tissues. Moreover, there are few direct comparisons of published methods. Here, a direct comparison is made by studying differences in organoid generation protocols, with provided outcomes. Four archetypal generation methods: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free, and (4) 3D ECM culture are described. Three primary benchmarks were used to assess the testicular organoid generation. These are cellular self-assembly, inclusion of major cell types (Sertoli, Leydig, germ, and peritubular cells), and appropriately compartmentalized tissue architecture. Of the four environments tested, 2D ECM and 3D ECM-free cultures generated organoids with internal morphologies most similar to native testes, including the de novo compartmentalization of tubular versus interstitial cell types, the development of tubule-like-structures, and an established long-term endocrine function. All methods studied utilized unsorted, primary murine testicular cell suspensions and used commonly accessible culture resources. These testicular organoid generation techniques provide a highly accessible and reproducible toolkit for research initiatives into testicular organogenesis and physiology in vitro.

Here, four methods for generating testicular organoids from primary neonatal murine testicular cells are described i.e., extracellular matrix (ECM) and ECM-free 2D and 3D culture environments. These techniques have multiple research applications and are especially useful for studying testicular development and physiology in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell repertoire. In vitro models to study T lineage commitment and development have provided valuable insights into this process. However, these systems lack the complete three-dimensional thymic milieu necessary for T cell development and, therefore, are incomplete approximations of in vivo thymic selection. Some of the challenges related to modeling T cell development can be overcome by using in situ models that provide an intact thymic microenvironment that fully supports thymic selection of developing T cells. Thymic slice organotypic cultures complement existing in situ techniques. Thymic slices preserve the integrity of the thymic cortical and medullary regions and provide a platform to study development of overlaid thymocytes of a defined developmental stage or of endogenous T cells within a mature thymic microenvironment. Given the ability to generate ~20 slices per mouse, thymic slices present a unique advantage in terms of scalability for high throughput experiments. Further, the relative ease in generating thymic slices and potential to overlay different thymic subsets or other cell populations from diverse genetic backgrounds enhances the versatility of this method. Here we describe a protocol for the preparation of thymic slices, isolation and overlay of thymocytes, and dissociation of thymic slices for flow cytometric analysis. This system can also be adapted to study non-conventional T cell development as well as visualize thymocyte migration, thymocyte-stromal cell interactions, and TCR signals associated with thymic selection by two-photon microscopy.

We describe the preparation of thymic slices that, in combination with flow cytometry, can be used to model positive and negative selection of developing T cells. Thymic slices can also be adapted for the in situ analysis of thymocyte migration, localization, and signaling via immunofluorescence and two-photon microscopy.

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

Thymic selection proceeds in a unique and highly organized thymic microenvironment resulting in the generation of a functional, self-tolerant T cell ...

Immunologie und Infektion

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nachbildung der Thymus-Mikroumgebung mit iPSC-abgeleiteten Organoiden

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the properties of its extracellular matrix (ECM). Thymic epithelial cells (TECs) are crucial in thymopoiesis, nurturing and selecting developing T cells by filtering self-reactive clones. TECs have been empirically demonstrated to be particularly sensitive to physical and chemical clues supplied by the ECM and classical monolayer cell culture leads to a quick loss of functionality until their death. Because of this delicate maintenance combined with relative rarity, and despite the high stakes in modeling thymus biology in vitro, models able to faithfully mimic the TEC niche at scale and over time are still lacking. Here, we describe the formation of a multicellular human thymic organoid model, in which the TEC compartment is derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC) and reaggregated with primary early thymocyte progenitors in a three-dimensional (3D) fibrin-based hydrogel. This model answers current needs for a scalable culture system that reproduces the thymic microenvironment ex vivo and demonstrates functionality, i.e., the ability to produce T cells and to support thymus organoid growth over several weeks. Thus, we propose a practical in vitro model of thymus functionality through iPSC-derived organoids that would benefit research on TEC biology and T cell generation ex vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung von Thymus-Epithelzellen und T-Zell-Forschung mit humanen Thymus-Organoiden

Here, we describe a protocol for the formation of human iPSC-derived thymus organoids grown in 3D fibrin hydrogels aiming to support thymic epithelial cell (TEC) maturation and prolonged maintenance, as well as thymopoiesis in vitro.

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

3D Organotypische Cokulturmodell Unterstützung Mark Thymusepithel Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression Promiscuous

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Reaggregieren Thymus Kulturen

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Herstellung und Bedeutung von Organotypischen Thymic Scheibe Kulturen

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen

Bildung humaner Thymus-Organoide in dreidimensionalen Fibrin-Hydrogelen