This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium &#8220;Tolerage&#8221;, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-W&#252;rttemberg.

Bu çalışma Regierungspräsidium Karlsruhe etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Bütün hayvanlar, Almanya Kanser Araştırma Merkezi (DKFZ), spesifik patojenden serbest durumlar altında muhafaza edildi. Yaş 1 ila 7 gün arasında değişen tüm kültür deneyleri fare yavrular için kullanılmıştır. Timustan mTECs 1. izolasyonu Not: aşağıdaki gibi bazı modifikasyonlar ile, steril koşullar altında, daha önce tarif edildiği gibi 1, aşağıdaki sindirim adımları uygulandı. <ol><li> Fare yavrular başını kesmek ve timus çıkarın. RPMI 1640 ortamı (% 5 FCS ihtiva eden) ihtiva eden bir petri plakası buz üzerinde Thymi yerleştirin. </li><li> ~ 5-30 ml RPMI ortamı ile bir yuvarlak tabanlı tüp içinde ince, küçük parçalar ve yerine Thymi kesin ve oda sıcaklığında 10 dakika süre ile bir mıknatıs kullanılarak karıştırılmıştır hafifçe. </li><li> Bundan sonra, özellikle timositleri içeren süpernatant süzün ve collagena bir yuvarlak kalan doku sırayla sindirmek37 ° C&#39;de 25 dakika her biri için kolajenaz / dispaz (0.2 mg / ml ile 1.2 U / ml nihai konsantrasyon), ardından 37 ° C&#39;de her biri için (0.2 mg / ml ve son konsantrasyonu, dağılışı 57 U / ml), 15 dakika boyunca se tip IV, Thymi kadar manyetik karıştırma ile bir su banyosu içinde Cı tamamen sindirilir. Üç Thymi ikiye 1 ml enzim kullanın. </li><li> Dokuya Pasteur pipeti ile bir kez her 7-10 dakikada bir çalkalayın. Kollajenaz / dispase fraksiyonları havuzu ve 70 mikron gazlı süzülür. </li><li> Manyetik hücreye sıralama (MACS) tarafından mTECs zenginleştirin. Daha önce, 11 tarif edilen ve Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, ayırma, manyetik hücre tarafından mTECs arıtılmasını gerçekleştirin. NOT: anti-CD80-PE (16-10A1, 1 at kullanımı: 100 seyreltme) ve (1 at G8.8, kullanımı: 100 seyreltme), anti-EpCAM-bio 12 mTECs manyetik sıralama için aşağıdaki antikorları kullanılmıştır. MACS kullanarak Olgunlaşmamış ve olgun mTECs olarak tanımlandı: CD45 - EpCAM + CD80 - ve CD45 - CD80 + respectively. </li><li> Aşağıdaki (Bölüm 2.3) açıklandığı gibi MACS saflaştırma (olgunlaşmamış mTECs saflığı = 83.1 ± 6.3% ve olgun mTECs = 79,23 ± 3.42%) ardından, organotipik kültürlerinin üzerine mTECs tohum. </li><li> Alternatif olarak, CD45 MACS tükenmesi sonrasında (100 mikron memesi kullanarak) FACS sıralama mTECs aşağıdaki antikorlar kullanılarak: Anti-CD45-PerCP (30-F11, 1 at kullanımı: 100 seyreltme), anti-Ly51-FITC (6C3, 1 de kullanmak : 100 seyreltme), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, 1 ile kullanımı: 500 oranında seyreltilmiş) ile 1 anti-CD80-PE (16-10A1, kullanımı: 100 seyreltme). (Gün 4): propidium iyodür (5,000 1) kullanılarak ölü hücreleri hariç. Sırasıyla EpCAM + CD80 + - CD45 - - Ly51 - EpCAM + CD80 - ve PI - CD45 - Ly51 PI: FACS kullanarak Olgunlaşmamış ve olgun mTECs olarak tanımlandı. </li></ol> 2. 3D Organotipik Co-kültürler (OTC) NOT: keratinocyt ve organotipik ekimi için 3D-dermal yapılarDaha önce tarif edildiği gibi 9,13 es hazırlandı. Tüm adımlar da hücreler, 2, 37 ° C de inkübe edildi ve% 5 bulundu. Şöyle mTECs kullanılarak OTC küçük değişiklikler ile hazırlandı. <ol><li> Insanlara özgü fibroblastlar hazırlanması Not: daha önce tarif edildiği gibi, 9, insan dermal fibroblastları de-epidermised dermişin eksplant kültürleri elde edildi. <ol><li> Kısaca, insan cildi (~ 5 cm uzunluğunda) şeritler kesildi ve termolisin, 4 ° C&#39;de, O / N (10 mM Hepes, pH 7.4 ile birlikte tuzlu su içinde 0.5 mg / ml) ile tedavi. </li><li> Bundan sonra, forseps kullanarak dermis epidermis ayırın. </li><li> İnce 10 cm&#39;lik petri plakasında küçük parçalar yerine dermis kesilir ve steril bir hava akımı altında 1-2 saat boyunca kurumaya bırakılır. DMEM% 20 FBS içeren düzenli eksplantlar tamamlayın. </li><li> Out büyüyen fibroblastlar bölmek zaman konfluent eksplantlar ileri con plakaya uymak devam emin% 0.1 tripsin kullanarak (genellikle yaklaşık 3 hafta)akıbet ardışık mermi. </li><li> Kadar DMEM 3 kat% 10 FBS aynı eksplantlardan fibroblastlar genişletin ve onları 14 cryo-korumaktadır. Her bir deney serisi için fibroblastlar aynı toplu kullanın. NOT: fibroblastlar dermal eşdeğeri set-up için ışımaya değildi. </li></ol></li><li> İskele hazırlanması <ol><li> Tam 12 iyi filtre ekler uyması için keskin bir 11 mm çaplı metal zımba kullanarak iyi sınırlı, çevrelerin içine 0.4-0.6 mm kalınlığında viskon, dokunmamış lifli malzeme (excel sayfasını destekleyen ürün detay) kesin. Sonra bir iskele olarak 12- kuyu filtre elemanı (polyester kılcal gözenek membran 3 mikron gözenek boyutu) içine yerleştirin. Steril 12 oyuklu plaka içine komple filtre setup yerleştirin. </li><li> Fibrinojen ve trombin bir kombinasyonundan oluşan cerrahi bir fibrin yapışkan, fibrin jel kiti kullanılarak hazırlanır. Fibrinogen- olarak 8 mg / ml ve 10 kit trombin bileşeni önceden seyreltinsırasıyla birim / ml. Aşağıdaki gibi, bir 12-kuyucuklu plaka tek bir oyuk için devam edin. <ol><li> Ca2 + ve Mg + 2, pH 7.0, 100 ul olmayan fibrinojen 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) ile (8 mg / ml) ile seyreltilir. 270.000 fibroblastlar içeren 100 ul FCS ile 100 ul trombin (10 birim / ml) ile seyreltilir. </li><li> 2 mg / ml ve 2.5 ünite / ml trombin fibrinojen bir nihai konsantrasyonu ile sonuçlanan, (1 karışımı 1) 200 ul fibrinojen ekleme fibroblastlar iskele üzerine hücre-karışımı ihtiva eden trombin 200 ul için koyun. İyice karıştırın ve yumuşak pipetleme (Gün 1) ile iskele bütün alana eşit dağıtın. NOT: 37 ° C&#39;de 30 dakika sonra fibroblastlar kuşatan bir pıhtı, tamamen iskele iç boşlukları dolduran ve düzgün bir üst yüzey oluşturan, meydana gelmiş olacaktır. </li></ol></li></ol></li><li> MTECs ile ortak kültür <ol><li> Ön kültür için organ kültürleri daldırılmasıBir değiştirilen ortam içinde% 10 FBS, 50 ug / ml L-askorbik asit ve 1 ng / ml TGF-β1 ile DMEM, 4-5 gün süre ile her gün. </li><li> Mtec tohumlama gününde, rFAD medyumla yerine (1: 1 DMEM + DMEM / F12),% 10 FBS ile, 10 -10 M kolera toksini, 0.4 mg / ml hidrokortizon, 50 ug / ml L-askorbik asit, RANK bağı nedenle fibroblastlar tarafından salgılanan serin proteaz ile erken fibrinolizi önlenmesi (0.1 ug / ml) ve 500 birim / ml Aprotinin,. </li><li> 7-8 saat sonra, 250,000 mTECs tohumlayarak ko-kültürler-ayarlamak (tam mTECs, ya CD80 LO ve CD80 yüksek alt-gruplar), fibroblast iskele üst oyuk başına 100 ul&#39;lik bir hacim içinde. Bir Neubauer odası (gün 4) kullanarak hücreleri sayın. NOT: timüs 3D organotipik kültürler hava kaldırdı olan cilt OTC aksine medyada submersed tüm zamanlarda. </li><li> 24 saat inkübasyondan sonra, şimdi containi (adım 2.3.2) yukarıda belirtildiği gibi orta kültürleri (toplam orta değişimi) kaynağıng Aprotininin miktarlarda 250 ünite / ml (Gün 5) azalır. </li><li> MTECs proliferatif aktivitesini değerlendirmek için, kültürler tahliye edilmeden önce 4 saat OTC (yani 6.7 uM / ml, / de 10 uM) edu ekleyin. Her kültürün numunesinin veya akışla iki bölüm halinde ya sayma K14 + Edu + hücreler tarafından, mTECs çoğalma endeksleri belirleyin keratin 14. co-boyanması ile birlikte Edu Görüntüleme Kit açıklandığı gibi OTC cryo bölümlerin boyama yapın sitometri (EDU akış sitometri, Bölüm 1.7 yerine Ly51-FITC bir 1&#39;deki CDR1-PB 15 kullanın: 100 seyreltme ve 2.3.6.4). </li><li> Ko-kültür 4-7 gün sonra, RNA izolasyonu, cryo-kesit veya FACS analizi (Gün 8-11) için OTC&#39;leri ve işlemi sonlandırmak. <ol><li> Bir forseps kullanarak kuyu ucun filtreden iskele / dermal eşdeğer ayıran kültürleri sonlandırın. </li><li> Cryo-kesit için, Ekim bileşik bütün OTC embed ve li dondurmacryo-kesit önce sterlin azot buharı. Kullanılana kadar -20 ° C &#39;de, bir kriyostat ve mağaza kullanılarak 5-7 mikron kalınlığında OTC bölümleri hazırlayın. Antikorlar: (100 seyreltme oranı: 1 de GP53, kullanım), ve anti-vimentin: cryo-kesitsel OTC immüno-histokimya için, anti-keratin 14 (1000 seyreltme AF64, kullanım 1 de) kullanın. İlgili ikincil antikorlar kullanılarak dolaylı immüno histokimya boyama gerçekleştirin. </li><li> RNA izolasyonu için çözelti, 2 ml RNazsız tüpün vidalı kapak olarak (fenol ve guanidinyum tiyosiyanat ihtiva eden) Denatüre edici 1 ml. Bir neşter ile parçalar halinde tüm OTC kesin ve denatüre çözeltisi içeren tüp içine ekleyin. Mekanik bir 6.0 hızda 30 saniye boyunca iki kez FastPrep aleti ile OTC&#39;leri parçalamak, 2 dakika boyunca (örnek, bu noktadan sonra -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir) boyunca buz üzerinde arasında yerleştirin. -80 ° C&#39;de donduruldu durumunda, buz üzerinde eritin. 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle 11,500-13,000 rpm tüpler santrifüjleyin. Bir tüpe süpernatantı aktarın RT ve f de 5 dakika boyunca inkübeüretici tarafından tarif edildiği gibi asit guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanılarak ollow RNA izolasyonu protokolleri. </li><li> FACS analizi için, iskele kaldırmak ve fibrin / fibroblast / mtec jelden membran ayırın. İnce bir neşter ile jel kesilmiş ve ~ bir FACS tüpü içinde 20 dakika o sindirimi ya da tamamen manyetik karıştırma ile bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de kolajenaz / dispaz, 2 ml ile sindirilmiş kadar. Bir kez, bir Pasteur pipeti her 5 dakikada enzim çözeltisi çalkalayın. Tam bir sindirimden sonra, 70 um filtre üzerinden bir hücre süspansiyonu filtre; 1,7 anlatılan ve akış sitometrisi ile analiz edildiği üzere antikorlar kullanılarak tek bir hücre süspansiyonu leke. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self.">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li><li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+for+central+tolerance.">A central role for central tolerance.</a> Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).</li><li>Bonfanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+reprogramming+of+thymic+epithelial+cells+to+skin+multipotent+stem+cells.">Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells.</a> Nature. 466, 978-982 (2010).</li><li>Kont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Aire+regulates+the+expression+of+tissue-restricted+antigens.">Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens.</a> Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).</li><li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+architecture+of+the+thymus+is+required+to+maintain+delta-like+expression+necessary+for+inducing+T+cell+development.">Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development.</a> J Immunol. 176, 730-734 (2006).</li><li>Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones.">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li><li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+homeostasis+in+long-term+scaffold-enforced+skin+equivalents.">Epidermal homeostasis in long-term scaffold-enforced skin equivalents.</a> J Investig Dermatol Symp Proc. 11, 93-105 (2006).</li><li>Boehnke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fibroblasts+and+microenvironment+on+epidermal+regeneration+and+tissue+function+in+long-term+skin+equivalents.">Effects of fibroblasts and microenvironment on epidermal regeneration and tissue function in long-term skin equivalents.</a> Eur J Cell Biol. 86, 731-746 (2007).</li><li>Pinto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression.">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).</li><li>Gabler, J., Arnold, J., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+and+the+developmental+dynamics+of+medullary+thymic+epithelial+cells.">Promiscuous gene expression and the developmental dynamics of medullary thymic epithelial cells.</a> Eur J Immunol. 37, 3363-3372 (2007).</li><li>Farr, A., Nelson, A., Truex, J., Hosier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus:+a+cell+surface+glycoprotein+expressed+by+subcapsular+and+medullary+epithelium.">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: a cell surface glycoprotein expressed by subcapsular and medullary epithelium.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 645-653 (1991).</li><li>Stark, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+fibroblast+matrix+in+dermal+equivalents+normalises+epidermal+histogenesis+and+dermoepidermal+junction+in+organotypic+co-culture.">Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture.</a> Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).</li><li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts.">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li><li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells.">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar mali veya ticari çatışması beyan ederim.

RTOCs yanı sıra, 3D OTC TEC farklılaşma ve PGE bakım / indüksiyon diğer (i) ile karşılaştırıldığında (Tablo 1) &#39;basitleştirilmiş 3D kültürlerin&#39; kullanımı açısından çok daha üstün tarafından olmuştur - fibroblastlar yalnız iskele olmaksızın; (Ii) 2 D sistemleri kullanan -, (iii) 3T3-J2 hücreleri TEC klonlar geliştirmek olup, burada, TECS 10 ile birlikte kültürlenmiş fibroblast / besleyici hücreleri ama PGE kaybolur (iv) Matrigel veya (v) ECM bile?...

Geri kalan% 2 toplu timik stroma oluşturan çeşitli hücreler oluşur ise geliştirilmesi timositleri, timüs yaklaşık% 98 kadar olmak (yani, epitel hücreleri, dendritik hücreler, makrofajlar, B hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri). Dış kortikal epitel hücreleri (cTECs) multipotent öncesi T hücreleri ve öz-MHC olumlu seçiminde kemik iliği, T hücre soyu indüksiyon yanlısı T hücrelerinin göçü temin olgunlaşmamış timositleri kısıtlı. İç medüller timik epitelyum hücreleri (mTECs) indükleyen negatif seçim ya da regülatör T hücre soyu içine sapma ya göre kendinden peptit / MHC kompleksleri için bir yüksek afiniteli TCR olan timositlerin tolerans indüksiyonu katılmaktadırlar. Merkezi tolerans indüksiyonu bağlamında, mTECs Böylece periferik öz yansıtma dokuya sınırlı bir kendi antijenlerine (TRA) çok geniş bir yelpaze ifade etmeleri açısından benzersizdir. Bu olay karışık gen ifadesi olarak adlandırılır (PGE)1,2. Çeşitli kısa vadeli 2B kültür sistemleri değişmez ilk 2 gün içinde 3-6 MHC sınıf II, FoxN1 ve Aire gibi PGE kaybı ve anahtar düzenleyici moleküllerin sonuçlandı olarak bu büyüleyici hücre tipine En güncel çalışmalar, ex vivo izole hücrelerde güveniyor . Özellikle takımlar ve timus bozulmamış 3D ağda özellikleri 2B modellerinde eksik olan, ancak belirsiz kaldı. Yeniden birikme timik organ kültürü (RTOC) sağlam bir timik mikro-7, şu ana kadar, diğer yandan, sadece 3D, bir yandan, T hücresi gelişiminin çalışma sağlar sistemi ve stromal hücre biyolojisi, olmuştur. Bununla birlikte, RTOCs zaten fetal stromal hücrelerin bilgi girişini içerir ve 5-10 günlük bir maksimum kültür dönemi tahammül bir hücre kompleks bir karışımı içeren, örneğin, bazı sınırlamaları vardır. in vitro kültür sistemlerinde indirgemeci eksikliği çalışma engellemiştirT hücre gelişimi ve timus organogenez çeşitli yönleri az değil moleküler PGE düzenlenmesi ve mTECs gelişimsel biyoloji ile ilişkisi. Deri ve timus epitel hücrelerinin yapısal kuruluşun yakın ilişkililik sayesinde, in vitro keratinositlerin farklılaşması taklit ve böylece dermal eşdeğer oluşturmak için başlangıçta geliştirilmiş olan 3D organotipik kültürü (OTC) sistemi için seçti. OTC sistem keratinositler 8,9 numaralı seribaşı olan üzerine fibrin jel, içinde sıkışıp kalırlar dermal fibroblastlar ile kaplanmış inert iskele matriks oluşur. Burada, biz saflaştırılmış mTECs ile keratinositler yerini aldı. Bu modelin temel özellikleri korurken, biz belirli parametreleri optimize edilmiş. MTECs çoğaldı kabul OTC modelinde, böylece yakından in vivo mTECs geliştirme taklit terminal farklılaşma yapıldı ve mtec kimlik ve PGE muhafaza <sup&gt; 10. Bu teknik not timus OTC aşamalı set-up sağlayan ayrıntılı bir protokol sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Charles River WIGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Microbeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)</td>
			<td>Ref. 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80-PE antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PerCP antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly51-FITC antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDR1-Pacific Blue</td>
			<td>Ref. 15</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>106-546-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen GmbH)</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10339">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</a></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10339">C10339</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10425">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit</a></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10425">C10425</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well filter inserts (thincerts)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jettex 2005/45</td>
			<td>ORSA, Giorla Minore, Italy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47302.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-049&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Gold</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>A11-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin (Trasylol)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>4032037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>G117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Seromed (Biochrom)</td>
			<td>K3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#223;1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG9214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>462-TR-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;T-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>TissueTek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep FP120</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV&#160;</td>
			<td>CellSystems</td>
			<td>LS004189</td>
			<td>0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrale Protease (Dispase)</td>
			<td>CellSystems</td>
			<td>LS002104</td>
			<td>0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 284 932 001</td>
			<td>25 &#181;g/ml final conc.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d organotypic co-culture model supporting medullary thymic epithelial cell proliferation, differentiation and promiscuous gene expression

Intra-timik T hücre gelişimi, çeşitli stromal hücrelerin, yani olmayan T hücrelerden oluşan karmaşık bir üç boyutlu ağ örgüsü gerektirir. Sırayla, yani T hücre reseptör repertuarı oluşturma ve seçim ardından T hücre soyu taahhüt önce çevre içine ihracat, zorunlu kontrol noktaları geçerken timositleri son derece koordineli zamansal ve mekansal için bu iskelesi travers. Bu iskele oluşturan iki ana yerleşik hücre tipleri (cTECs) kortikal ve medüller timik epitel hücreleri (mTECs) bulunmaktadır. MTECs önemli bir özelliği, bir çok dokuya sınırlı bir antijenlerin olarak adlandırılan rasgele ifadesidir. Bu dokuya sınırlı antijenler, sırasıyla kendi kendine tolerans sonuçlanan mTECs ya timik dendritik hücreler tarafından doğrudan veya dolaylı olarak timositleri olgunlaşmamış sunulmaktadır. CTECs ve mTECs gelişim yollarını ve fonksiyonlarını taklit in vitro uygun modeller şu anda lak vardırkral. Yeterli deneysel modellerin eksikliği, örneğin hala tam olarak hücresel ve moleküler düzeyde anlaşılmaktadır karışık gen ifadesinin, analiz engelliyordu. Biz ex vivo izole mTECs kültürüne 3D organotipik ko-kültür modeli uyarladı. Bu model, ilk olarak in vitro olarak, bir cilt eşdeğer üretmek üzere bir şekilde keratinosit yetiştirmek için geliştirilmiştir. , CD80 hi, Aire-pozitif mTECs, RANKL (ii) tepki ve FoxN1 (iii) sürekli ifadeye (i) çoğalması ve CD80 lo, Aire-negatif terminal farklılaşma: 3D model mtec biyoloji temel fonksiyonel özellikler korunmuş Aire ve CD80 hi mTECs doku kısıtlı genler.

Biz aslında keratinositlerde 9 in vitro uzun vadeli kültürü için geliştirilmiş olan 3D organotipik ko-kültür modeli (3D OTC) kabul etti. MACS zenginleştirilmiş mTECs (MACS zenginleştirme şeması Şekil 1 e bakınız), bir fibrin jel ve tutulu fibroblastlar içeren bir yapı iskelesi üzerine ekilmiştir. fibroblastlar in vitro mTECs destekleyen temel hücre dışı matriks (ECM) sağlarlar. MTECs hava maruz kalan in vivo ortamı (OTC set-up şeması <st...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression at JoVE.com

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

Medüller Timik epitel hücre proliferasyonu, farklılaşması ve Promiscuous Gen İfade Destekleme 3D Organotipik Co-kültür Modeli

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K Görüntüleme.  German Cancer Research Center (DKFZ). Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression. 