The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام UCSF المؤسسي. 1. الحفظ بالتبريد والتثبيت من الجنينية الماوس قلوب. 1.1) أداة إضافية تجميد قلوب الجنينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق بتري 3.5 سم و 7 ملم cryomolds مع الأمثل قطع درجة الحرارة (OCT) المتوسطة (انظر الجدول مواد). في غطاء الكيميائية، تبرد 2-methylbutane في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 30 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 10 سم بتري أطباق، 10 مل من برنامج تلفزيوني إلى 3.5 سم أطباق بتري، وإخضاع كافة أطباق بتري على الجليد. إعداد طبق واحد 10 سم والعديد من 3.5 سم أطباق في الماوس حاملا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الأجنة كما هو موضح سابقا 15، وأداء تشريح في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، الموت ببطء الأنثى الحامل باستخدام CO 2 الخدر وخلع عنق الرحم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في البطن، تشريح خارج الرحم عن طريق خفض السفن منظمة العمل العربيةنانوغرام انحناء الداخلي للرحم، ونقل الرحم إلى 10 سم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الرحم بين كل الجنين ونقل للفرد 3.5 سم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. عزل كل جنين كما هو موضح 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح تجويف التامور باستخدام ملقط غرامة، وإزالة القلب بعيدا عن الرئتين والأوعية الدموية عن طريق خفض في الشريان الأبهر، الوريد الأجوف السفلي، والأوردة الرئوية، ونقل إلى 3.5 سم بتري تحتوي على OCT الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح قلب تتوازن في أكتوبر لعدة ثوان، ثم نقل القلب إلى 7 ملم العفن تحتوي أكتوبر توجيه الجدار الأمامي للقلب إلى الجزء السفلي من القالب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف القالب إلى سائل تبريد النيتروجين 2-methylbutane. والحرص على عدم السماح 2-methylbutane السائل للمس أكتوبر أو القلب. تجميد حتى أكتوبر صلبة بيضاء، ثم نقل القالب إلى دلو الثلج التي تحتوي على الثلج الجاف. الانتقال إلى الجنين المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> WRا ف ب cryomolds في احباط وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للcryosectioning. </li></ol> 1.2) البديل: امتصاص العرق (PFA) تحديد، cryoprotecting، وأكتوبر تضمين قلوب الجنينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الآبار من 12 بئر الأنسجة لوحة الثقافة مع 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج قلوب الجنينية كما هو موضح في 1.1.3. وضع كل القلب إلى تحتوي كذلك 4٪ PFA وإصلاح في 4 درجات CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotection: باستخدام ماصة نقل البلاستيك، وتتحرك كل قلب لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 1.5 مل من 15٪ سكروز في برنامج تلفزيوني وتستنهض الهمم بلطف عند 4 درجات مئوية حتى يغرق القلب إلى أسفل الأنبوب (عدة ساعات لO / N ). نقل كل قلب إلى 1.5ml تحتوي على 1.5 مل أنبوب microcentrifuge من 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني وتستنهض الهمم بلطف عند 4 درجات مئوية مرة أخرى حتى يغرق القلب إلى أسفل الأنبوب (عدة ساعات لO / N). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة نقل البلاستيك، ضع قلب cryoprotected في أكتوبر والسماح لها تتوازنلعدة دقائق لإزالة السكروز الزائد، ثم نقل القلب إلى 7 ملم العفن تحتوي أكتوبر توجيه الجدار الأمامي للقلب إلى الجزء السفلي من القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد القلب في أكتوبر عن طريق وضع القالب في أي سائل تبريد النيتروجين 2-methylbutane أو الثلج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف cryomolds في احباط وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للcryosectioning. </li></ol> 2. Cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة إلى -17 ناظم البرد درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان cryomolds في غرفة ناظم البرد وتتوازن إلى درجة حرارة لمدة 15-20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس cryomold واستخدام ضغط لطيف لطرد كتلة القلب من العفن. توجيه الجدار الأمامي من القلب إلى الجزء العلوي من كتلة الأنسجة مصبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة كبير من أكتوبر على تشاك، وجبل كتلة القلب على انخفاض أكتوبر لتجميد على تشاك. الحفاظ على التوجه مثل أن الجدار الأمامي للقلب هو أبعد من تشاك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل تشاك والتي شنت انهكتلة الفن على حامل الكائن ناظم البرد. ضبط بحيث تكون زاوية من النصل هو 3-5 درجة بالنسبة للعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10 ميكرون أقسام على الشرائح المجهر التي تم علاجها قبل مع طلاء موجبة الشحنة (انظر الجدول مواد). السماح ليجف تماما قبل تخزينها في -80 ° C. </li></ol> 3. المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأقسام الإضافية المجمدة، وإصلاح الأنسجة وpermeabilize في الأسيتون لمدة 10 دقيقة في غطاء الدخان في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأقسام الإضافية المجمدة وPFA الثابتة، واحتضان في برنامج تلفزيوني-0.1٪ تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة لإزالة أكتوبر وpermeabilize أقسام PFA الثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة لمدة 45 دقيقة في 1X عازلة تمنع، مخففة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام الأجسام المضادة الأولية ولدت في الماوس، واحتضان في حمار أو الماعز المضادة للماوس مفتش (H + L) أحادي التكافؤ فاب شظية المخفف 1: 100 في برنامج تلفزيوني-0.1٪ توين 20 لمدة 45 دقيقة في RT (انظر مناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في الأجسام المضادة الأولية أو الأجسام المضادة المخفف في 1X عازلة تمنع لمدة 2 ساعة على RT أوO / N عند 4 ° C (انظر جدول المواد / معدات التخفيفات محددة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في اليكسا الضد الثانوية فلور مترافق المخفف 1: 500 في عرقلة العازلة لمدة 2 ساعة على RT، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في RT، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: احتضان في هويشت صبغ المخفف 1: 2،000 في برنامج تلفزيوني في RT (محمية من الضوء) لتسمية نوى، ثم شطف مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما بعد الإصلاح وصفت المقاطع في 1٪ PFA لمدة 1 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشرائح في مكافحة تتلاشى المتوسطة (مع دابي إن لم يكن وصفت نوى بالفعل) عن طريق وضع قطرتين من المتوسط ​​على كل نهاية الشريحة ثم يغطى مع ساترة. ختم coverslips مع طلاء الأظافر. متجر محمية من الضوء في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للصورة. </li></ol> 4. متحد البؤر التصوير وتحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الأطوال الموجية المناسبة ليزر، وكاميرا، ومتحد البؤر المجهر المؤتمر الوطني العراقيluding المرحلة المحرك و z السيارات. اطلاق برنامج برامج التصوير. استخدام 405، 488، و 561 موجات الليزر لتصوير Hoechst-، اليكسا 488-، واليكسا أقسام 568-الملون، على التوالي. ملاحظة: انظر الجدول مواد لدينا الأجهزة والبرمجيات المواصفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشريحة التحكم (ساترة إلى أسفل لمجهر مقلوب) على المسرح الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 4X (انظر الجدول المواد)، والعثور على عينة ومجال الاهتمام. التقاط صورة لاستخدامه كقاعدة الخريطة عندما التصوير في تضخم عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريحة، مما يجعل الحد الأدنى من التعديلات على مرحلة الشريحة. تغيير في الهدف الغمر 60X النفط (انظر الجدول المواد)، ووضع قطرة صغيرة من الزيت على الهدف، واستبدال الشريحة (ساترة لأسفل) على خشبة المسرح الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث عينة مرة أخرى. تعيين قوة الليزر، وقت التعرض، وbinning إلى المستوى المطلوب لكل قناة. ملاحظة: نحن نستخدم بشكل عام قوة الليزر 0.8، وقت التعرض كاميرا من 100 ميللي ثانية، وbinning من 2 (SEالمواد الإلكترونية الجدول للمعدات والبرمجيات مواصفات)؛ تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا لكل تجربة الإعدادات المثلى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحديد الإعدادات المثلى، استخدم نفس الإعدادات لجميع أقسام الأنسجة داخل التجربة. استخدام الرسم البياني كثافة الإشارة إلى مدى شدة الأمثل لكل قناة (وسوف تستخدم هذه المعلومات لتحليل). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد كومة من الألف إلى الياء باستخدام وظيفة الشراء: اختيار القنوات المناسبة ليزر، ثم اختيار الحدود العليا والدنيا للض المكدس. اختر من الالف إلى الياء حجم الخطوة كومة التي هي واحدة نصف قيمة سمك شريحة البصرية التي يقدمها البرنامج. انقر على &quot;تشغيل&quot; لجمع الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام فيجي 16 أو برنامج مماثل لتحليل الصور. داخل فيجي، افتح الملف كومة Z لون مخصص خيار الوضع والقنوات تنقسم إلى نوافذ منفصلة مع. فتح &quot;ضبط السطوع / التباين&quot; أداة من صورة القائمة المنسدلة. داخل كل قناة، قوآخرون والأمثل مجموعة كثافة الرسم البياني يحدد في 4.5.1. تطبيق هذه النطاقات قناة لجميع مداخن ض يجري تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دمج القنوات الفردية في صورة مركبة واحدة باستخدام -الصورة&gt; القائمة المنسدلة اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء ض كومة بالارض من الصورة المركبة باستخدام -الصورة&gt; Stacks-&gt; القائمة مشروع ض. هذه الصورة ستكون أكثر إشراقا بكثير من صورة 3D. ضبط مجموعة كثافة الرسم البياني للالعينة الضابطة لتجنب oversaturation، وتطبيق نفس الإعدادات لالتجريبية بالارض ض المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد صورة 3D، استخدم لأول مرة -الصورة&gt; Stacks-&gt; القائمة مشروع 3D 17. اختر إما محور س أو ص محور الدوران. تعيين تباعد شريحة كما نفس العدد من ميكرون ويبلغ حجم ض خطوة المكدس. اختيار دوران إجمالي المطلوب وتعيين زيادة زاوية دوران إلى 1. ثم افتح صورة J عارض 3D من الإضافات القائمة المنسدلة. اختيار صورة مركبة ولدت في 4.8، كما عرض الحجم، وإعادة تعيينأخذ العينات عامل إلى 1 أو 2. </li></ol>

<ol>
	<li>Risebro, C. A., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+ventricles.">Formation of the ventricles.</a> The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).</li><li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation research. 92, 133-135 (2003).</li><li>Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transitional+junction:+a+new+functional+subcellular+domain+at+the+intercalated+disc.">The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc.</a> Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.+Nature+reviews.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).</li><li>Kastner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+deficiency+and+mutations+of+RXRalpha,+RXRbeta+and+RARalpha+lead+to+early+differentiation+of+embryonic+ventricular+cardiomyocytes.">Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes.</a> Development. 124, 4749-4758 (1997).</li><li>Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+ventricular+trabeculation/compaction+and+the+pathogenesis+of+the+left+ventricular+noncompaction+cardiomyopathy+(LVNC).">Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC).</a> American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+alpha3beta1+integrin+isoforms+in+association+with+myofibrillogenesis+during+cardiac+myocyte+development+in+culture.">Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture.</a> Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).</li><li>Lu, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin+nexus+in+cultured+cardiac+myocytes.">The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes.</a> The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).</li><li>Schultheiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+subsets+of+myofibrillar+proteins+in+cardiac+nonstriated+and+striated+myofibrils.">Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils.</a> The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).</li><li>Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costameres,+focal+adhesions,+and+cardiomyocyte+mechanotransduction.+American+journal+of+physiology.">Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).</li><li>Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+novel+Xin+protein+to+the+adherens+junction+complex+in+cardiac+and+skeletal+muscle+during+development.">Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).</li><li>Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-RAP+expression+during+mouse+heart+development.">N-RAP expression during mouse heart development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).</li><li>Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cardiac+cytoarchitecture+in+the+developing+mouse+heart.">Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart.</a> Developmental biology. 289, 430-441 (2006).</li><li>Whitman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin+and+talin2+are+novel+mRNA+targets+of+fragile+X-related+protein-1+in+cardiac+muscle.">Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle.</a> Circulation research. 109, 262-271 (2011).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC. 11, 274 (2010).</li><li>Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+cadherin-binding+proteins+beta-catenin+and+plakoglobin+in+the+heart+leads+to+gap+junction+remodeling+and+arrhythmogenesis.">Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis.</a> Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nature. 7, 168-169 (2010).</li><li>Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+immunohistochemistry:+review+and+future+prospects+in+research+and+diagnosis+over+two+decades.">Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).</li><li>Risebro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+maintains+muscle+structure+and+growth+in+the+developing+heart.">Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart.</a> Development. 136, 495-505 (2009).</li><li>Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillogenesis+in+the+developing+chicken+heart:+assembly+of+Z-disk,+M-line+and+the+thick+filaments.">Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ويجب تحديد أفضل تقنية تثبيت الأنسجة والتخفيف تجريبيا لكل الأجسام المضادة. في أيدينا، والإضافية تجميد متفوقة على PFA تثبيت لعدة مستضدات cardiomyocyte، بما في ذلك S-α-actinin، β-كاتينين، β1-إنتغرين، التروبوميوزين، تالين (لا يظهر) وN-كادهيرين. في المقابل، PFA تثبيت تؤدي إلى نتائج ممتازة لتنسيق التصاق كيناز (لا يظهر). وcrosslinks البروتين التي شكلتها PFA قد يخفي الحواتم والحد من الأجسام المضادة ملزمة؛ قد تكون هناك حاجة استرجاع مستضد في مثل هذه الحالات، وطرق لاسترجاع مستضد ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى 20. يمكن تخفيض تركيز PFA أو طول التثبيت للحد من حاتمة اخفاء، مع تحديد الظروف المثلى تجريبيا لكل الأجسام المضادة وعند كل مرحلة التطوير. ضوابط السلبية المناسبة ينبغي أن تستخدم عندما تميز الأجسام المضادة جديد أو متحولة القلب، بما في ذلك المصل قبل المناعة مثل مراقبة الأجسام المضادة الأولية و&quot;لا الأجسام المضادة الأولية&quot; التعاونntrol. استخدام الفئران خروج المغلوب هو السيطرة السلبية مثالية ولكن الفتك في وقت مبكر يمنع استخدامها للعديد من المنتجات الجينات درس هنا. استخدام كميات كافية لغمر تماما الشرائح التجريبية والضابطة في نفس حجب المناعي، الأجسام المضادة، وكان حلول غسل المهم كما كان هزاز لطيف من الشرائح خلال حضانة لضمان التعرض موحدة من الأقسام إلى حلول. هذا النهج التقليل من التغير التقني في تلطيخ بين الأقسام والشرائح ضمن التجربة. عندما يحد تكلفة حجم حل الأجسام المضادة، واستخدام عنق الرحم القلم للحد من تدفق حلول أبعد من أقسام الأنسجة والحفاظ على الشرائح في غرفة ترطيب أثناء حضانات طويلة. إذا الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس الابتدائي - وبالتالي الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس - يتم استخدامه، وخطوة حجب الثانية لتغطية المناعية الذاتية الماوس يكون الضرورية (الخطوة 3.4) لتقليل إشارة الخلفية غير محددة. المجهر ومعالجة الصور التقنيات الملائمة حاسمة لحصول على معلومات دقيقة بيولوجيا 21. الرسم البياني كثافة يشير توزيع بكسل في كل مستوى كثافة (0-65535 المستويات للحصول على صورة 16-بت) لكل لون. الخلفية، والسطوع، والتباين يمكن تعديلها عن طريق الدخول في عرض نطاق كثافة أن الأجنحة ذروة الرسم البياني. لإجراء مقارنات صحيحة بين الظروف، يجب استخدام نفس الإعدادات بين السيطرة والظروف التجريبية. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوق بها لتحليل نضوج cardiomyocyte والتنمية في الأصلي الجنينية القلب الماوس. في حين غالبا ما يستخدم المناعي للبروتينات cardiomyocyte محددة للاحتفال العضلية خلال التنمية، دراسات قليلة توظف التقنيات التي تسمح تحليل عالية الدقة من هيكل ميوفيبريل وظهور أقراص مقحم وcostameres 12-14،22،23. هذه التقنية يمكن استخدامها لفي الخامستقييم ايفو الطفرات التي تسبب عيوب القلب التنموية، كوسيلة لتحديد التغيرات في cardiomyocyte النضج التي قد تسلط الضوء على آليات تشوهات هيكلية.

خلال التنمية، وانقباضات القلب تبدأ قريبا بعد العضلية تهاجر إلى خط الوسط وتشكل الخطي أنبوب القلب 1،2. وsarcomere من وحدة مقلص الأساسية داخل cardiomyocyte. هذا الهيكل هيكل الخلية درجة عالية من التنظيم يحتوي على خيوط الأكتين ترتكز على Z-القرص الساركومير α-actinin (S-α-actinin) والألياف ميوسين ترتكز على خط M (الشكل 1). كما نضوج cardiomyocyte، sarcomeres تجميع في سلسلة لتشكيل اللييفات العضلية التي تمتد عبر الخلية. ترتكز اللييفات العضلية إلى أقاصي cardiomyocyte بواسطة القرص مقحم، وهيكل موصلي خلية خلية التي تحتوي على مفترق الانتقالي مع مجموعة فرعية من عناصر Z-القرص مثل S-α-actinin 3، الملتصقة البروتينات مفرق مثل N-كادهيرين وكاتينين β، والبروتينات الفجوة مفترق طرق، وdesmosomes (الشكل 1) 4. على طول الغشاء الطولي، وZ أقراص من اللييفات العضلية المحيطية أيضانعلق على غشاء الخلية عبر costameres. توفر هذه الالتصاقات البؤرية المتخصصة مرساة بين ميوفيبريل، غشاء البلازما، والمصفوفة خارج الخلية لتوفير الدعم الهيكلي إضافية إلى cardiomyocyte (الشكل 1) 4. في التنمية القلب في وقت مبكر، ويتم ترتيب العضلية في التوقعات تشبه الإصبع المعروفة باسم الترابيق التي تبرز في الفضاء البطيني ويتضمن myofibrils ناضجة نسبيا 5. مع استمرار التطور القلب، والعضلية في منطقة جنوب النخابية تتكاثر لتشكيل عضلة القلب المدمجة التي تضم جدران البطين، ولكن يتم تأخير قسيم عضلي والتجمع ميوفيبريل بالمقارنة مع عضلة القلب تربيقي 5،6. نماذج من قسيم عضلي والتجمع ميوفيبريل تأتي إلى حد كبير من الدراسات المناعي على العضلية مثقف 7-10، التي هي واضحة ولكنها تفتقر بيئة ثلاثية الأبعاد، وتدفق الدم، والاتصالات مع خلية أخرى في القلبحاضر في الجسم الحي. الدراسات البنيوية عالية الدقة باستخدام المناعي في قلب فأر الجنينية هي صعبة من الناحية الفنية، واستكشفت دراسات قليلة على ظهور أقراص مقحم وcostameres خلال الماوس تنمية القلب. البروتين الملتصقة تقاطع β كاتينين يبدو أن توطين على أقراص مقحم بعد يوم الجنينية (E) 17.5 11، N-كادهيرين يموضع إلى الهياكل الخطية التي قد تمثل أقراص مقحم من قبل E18.5 12 مقابل يوم بعد الولادة 0 13، كما تم الكشف عن costameres في E18.5 14، ولكن هذه البروتينات عرض توزيع غشاء منتشر وأكثر مستمر في وقت سابق النقاط الزمنية التنموية 11-13. هنا، نحن تصف طريقة واضحة وقابلة للتكرار لالمناعية والمجهري مضان من الفأر مقطوع قلوب الجنينية التي تسمح لتحليل مفصل لميوفيبريل والتنمية cardiomyocyte، بما في ذلك ظهور intercalaتيد أقراص أقرب وقت E12.5 وcostameres الوليدة في E16.5. قد يكون هذا البروتوكول مفيد لبحث آثار الطفرات على تشكيل قسيم عضلي وكذلك ميوفيبريل وcardiomyocyte النضج.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:335px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Cryomold, Disposable Base Mold, 7x7 mm</td>
			<td style="width:167px;">Richard-Allen Scientific</td>
			<td style="width:160px;">58949</td>
			<td style="width:335px;">This size not available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Cryomold, Disposable Base Mold, 15x15 mm</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">22-050-159</td>
			<td style="width:335px;">Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td style="width:160px;">25608-930</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">2-methyl butane</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">M32631</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">T353-500</td>
			<td style="width:335px;">Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Sucrose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">S0389</td>
			<td style="width:335px;">Use 15% and 30% solutions in 1X PBS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">S30467-1</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">12-550-15</td>
			<td style="width:335px;">&#34;Plus&#34; indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Acetone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">179124</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Western Blocking Agent</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">11921673001</td>
			<td style="width:335px;">Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Tween 20</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">P9416</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment</td>
			<td style="width:167px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:160px;">715-007-003</td>
			<td style="width:335px;">Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:285px;">Anti-s-a-actinin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">A7811</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Anti-bcatenin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:160px;">9587s</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Anti-b1 integrin antibody</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:160px;">AF2405</td>
			<td style="width:335px;">Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:285px;">Anti-tropomyosin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td>
			<td style="width:160px;">CH1</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:160px;">sc-7939</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:285px;">Anti-talin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">T3287</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:160px;">700255</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-21202</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A10042</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-11001</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-11011</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Hoechst 33342 dye</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">H3570</td>
			<td style="width:335px;">Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Vectashield</td>
			<td style="width:167px;">Vector labs</td>
			<td style="width:160px;">H-1000</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Coverslips</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">12-548-5M</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box</td>
			<td style="width:167px;">Keysight (formerly Agilent)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Clara Interline CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Andor</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:285px;">CFI Plan Apochromat 4X air objective</td>
			<td style="width:167px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602)</td>
			<td style="width:167px;">Nikon&#160;&#160;</td>
			<td style="width:160px;">NA 1.4, WD 0.13 mm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:285px;">NIS Elements Imaging Software</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:160px;">http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:167px;">Fiji</td>
			<td style="width:160px;">http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart

أثناء نمو القلب، وتوليد وحدات عضلة القلب محددة الهيكلية والوظيفية بما في ذلك sarcomeres، اللييفات العضلية مقلص، وأقراص مقحم، وcostameres يتطلب التجمع المنسق لمكونات متعددة في الزمان والمكان. اضطراب في تجميع هذه المكونات يؤدي إلى عيوب القلب الخلقية. وتستخدم تقنيات تلطيخ مناعي عادة في العضلية مثقف للتحقيق النضج ميوفيبريل، ولكن هذا النهج خارج الحي محدودة من قبل إلى أي مدى سوف myocytes تفرق تماما في الثقافة، ونقص المدخلات الطبيعية في الجسم الحي الميكانيكية، وغياب العظة الشغافية. تطبيق تقنيات المناعي لدراسة وضع الماوس القلب هو مرغوب فيه ولكن أكثر تحديا من الناحية الفنية، وأساليب غالبا ما تفتقر حساسية كافية وقرار لتصور sarcomeres في المراحل الأولى من التنمية القلب. هنا، نحن تصف طريقة قوية وقابلة للتكرار للمشاركة في immunostain موالبروتينات ltiple أو للمشاركة في تصور بروتين فلوري مع تلوين مناعي في قلب الفأر الجنينية واستخدام هذه الطريقة لتحليل اللييفات العضلية النامية، أقراص مقحم، وcostameres. هذه الطريقة يمكن تطبيقها أيضا على تقييم التغيرات الهيكلية cardiomyocyte التي تسببها طفرات تؤدي إلى عيوب القلب الخلقية.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

analysis-cardiomyocyte-development-using-immunofluorescence-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.0K Views.  Northwestern University. Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Video: Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

مولتيميد خليه واحده mRNA تحليل التسلسل من الخلايا الجنينية الماوس

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

تحليل عيوب القلب الخلقية في أجنة الفئران باستخدام أساليب النسيج النوعي والكمي

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...