Name: large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis
Uploaded: 2015-01-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis at JoVE.com

We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من القانون الألماني والدولة برلين. تم رصد معالجة الزرد من قبل السلطة المحلية لحماية الحيوان (LaGeSo، برلين-براندنبورغ). 1. الحصول على اسماك الزرد الأجنة لاستخراج القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عبر مراسل القلب الزرد مثل تيراغرام (myl7: EGFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9 من أجل الحصول على أجنة مع القلب محدد GFP التعبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الأجنة في الماء البيض في 28.5 درجة مئوية حتى المرحلة الجنينية المطلوب 10،11. ضمان حصول السكان الجنين جمعت متجانس على حد سواء وراثيا ومرحلة تنموية للحد من الاختلافات في التعبير الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate الأجنة يدويا. </li></ol> 2. تشريح الزرد الجنينية قلوب ملاحظة: حافظ على كل الحلول على الجليد. إذا كان ذلك ممكنا، هل العمل الجماعي: شخص واحد يشرح قلوب من الإدارة الانتخابيةryos بينما شخص آخر فرز قلوب تحت stereomicroscope مضان. وهذا يسمح للتجهيز عدة مئات من الأجنة في غضون ساعات قليلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حوالي 100 الأجنة في أنبوب 1.5 مل الطرد المركزي. تخدير الأجنة مع تريكين (0.16 ملغ / مل في E3 المتوسطة). المضي قدما مرة واحدة يتم تخدير الأجنة بشكل واضح (لا السباحة والرواسب إلى أسفل الأنبوب، ولكن قلوبهم لا تزال الضرب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تريكين / E3 حل ويغسل الأجنة مرة واحدة مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة والحفاظ على الجليد. ملاحظة: متوسطة FBS L-15/10٪ مهم للحفاظ على الأجهزة والخلايا على قيد الحياة أثناء إجراء تشريح كامل حتى تم نقل القلوب إلى RNAlater أو Trizol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة إلى الأجنة وماصة صعودا وهبوطا 5-8 مرات مع جولة جل تحميل تلميح حتى يتم تعطيل صفار البيض تماما. ماصة الأجنة انخفاض الحكيم على سطح من الحل، حتى أن انخفاض سوف تنفجر وتتعطل الأجنة بلطف. ملاحظة: كيف بقوة وعدد المرات الأجنة يجب أن pipetted صعودا وهبوطا يعتمد على المرحلة التنموية للأجنة، هناك حاجة إلى أي مزيد من pipetting لفي مراحل متأخرة (على سبيل المثال في 56 HPF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأول دفعة من الأجنة تشريح، وتقييم سلامة الأجنة ونسبة قلوب تشريح تحت stereomicroscope، منذ بعض القلوب قد تبقى تعلق على الأجنة إذا pipetted بلطف جدا. ضبط طريقة pipetting لللجولات المقبلة من تشريح وفقا لذلك. ملاحظة: استخدم منخفضة نصائح ماصة والاحتفاظ أنابيب microcentrifuge للحد من قلوب التمسك البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق العينة على مرشح 100 ميكرون وضعت على أنبوب 50 مل الطرد المركزي. شطف أنبوب 1.5 مل مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة ومن ثم تطبيق هذا إلى تصفية من أجل تقليل الخسائر في العينة (بعض القلوب قد تكون شائكة على جدران الأنبوب). غسل الفلتر مرتين مع 1 مل L-15 / 10٪ FBS. في هذه الخطوة قلوب تمر من خلال مرشح ويتم جمعها في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق التدفق من خلال الصعود إلى 30 ميكرون فلتر وضعت على أنبوب الطرد المركزي 15 مل وشطف مرشح مرة واحدة مع 1 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة. في هذه الخطوة الترشيح الثانية، يتم الاحتفاظ قلوب في تصفية ويتم غسلها أصغر الحطام قبالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مرشح رأسا على عقب وتدفق قلوب من مرشح إلى 1٪ المغلفة الاغاروز طبق بتري من خلال تطبيق ثلاث يغسل متتالية مع 1 مل L-15/10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل يدويا قلوب GFP إيجابية من تحت الانقاض الجنينية nonfluorescent (مثل عدسات العين) مع زوج من ملقط تحت stereomicroscope مضان والتركيز عليها في وسط الطبق. جمعها وفقا لالخطوة 3. ملاحظة: إذا الأجنة تكون أقدم من 24 HPF، وقلوب يجب الضرب، مشيرا إلى أن الأنسجة لا تزال طبيعية من الناحية الفسيولوجية. </li></ol> 3. عزل مرنا من Dissecتيد القلوب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع قلوب في أصغر حجم ممكن (على سبيل المثال 10 ميكرولتر) وماصة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 0.75 مل RNAlater (على الجليد). تحقق من أن لا قلوب لا تزال في الطرف ماصة عن طريق عرض عليه تحت stereomicroscope مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، إذا غطاء الكيميائية يوجد في الجوار المباشر لالمجهر مضان، ونقل قلوب جمعها في Trizol (تنبيه) تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. هذا تلتف احتمال خسارة قلوب العالقة في الطرف ماصة وأيضا أثناء الطرد المركزي من قلوب (الخطوات 3.4 و 3.5 و 3.7). تجمع قلوب من عدة جولات من العزلة في نفس أنبوب مع Trizol وانتقل مباشرة إلى الخطوة 3.8. يجب أن لا تتجاوز الحجم النهائي 10٪ من حجم Trizol الأصلي. ملاحظة: اقرأ Trizol المواد ورقة بيانات السلامة (MSDS) قبل الاستخدام. التعامل مع Trizol كاشف تحت غطاء محرك السيارة وارتداء أوصى معدات الحماية الشخصية. تجنب ملامسة الجلد والعينين وclothiنانوغرام. إزالة جميع مصادر الإشعال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع قلوب من عدة جولات من العزلة في نفس أنبوب مع RNAlater (على الجليد)، وكفاءة عزل الحمض النووي الريبي يحسن مع كمية من الأنسجة التي تم جمعها. إذا تجاوز إجمالي حجم العينة 10٪ من حجم RNAlater الأصلي، استخدام أنبوب إضافي مع 0.75 مل RNAlater للتخزين (على الجليد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي العينات في 15،700 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى الرواسب القلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت stereomicroscope مضان، وجمع بعناية بقدر طاف وقت ممكن إلى 1٪ المغلفة الاغاروز طبق بتري تحتوي على 3 مل L-15/10٪ FBS المتوسطة، ولكن لا تزعج قلوب الرسوبية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. منذ ما يصل الى 15٪ من قلوب يمكن أن تبقى في طاف بسبب اللزوجة العالية من RNAlater، استرجاعها كما هو موضح في الخطوة 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء الكيميائية، إضافة 0.5 مل Trizol إلى الأنبوب الذي يحتوي على قلوب الرسوبية والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت microsco الفلورسنتالمؤسسة العامة، ونقل قلوب (من الخطوة 3.5) من الطبق المغلفة الاغاروز 1٪ تحتوي على حل FBS RNAlater / L-15/10٪ في طبق آخر 1٪ المغلفة الاغاروز مع 3 مل L-15/10٪ FBS لتمييع خارج RNAlater. جمع قلوب في وسط طبق بتري ونقلها في حجم صغير في أنبوب للقلوب الرسوبية في Trizol تحت غطاء الكيميائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أنبوب 1.5 مل تحتوي على القلوب في Trizol لتعطيل قلوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء الكيميائية، إضافة 100 ميكرولتر الكلوروفورم (تنبيه)، تخلط جيدا ونقل الحل / الكلوروفورم Trizol إلى 1.5 مل نسج قبل PLG أنبوب (أجهزة الطرد المركزي 30 ثانية في أقصى سرعة قبل الاستخدام). احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: اقرأ MSDS الكلوروفورم قبل الاستخدام. التعامل مع الكلوروفورم كاشف تحت غطاء محرك السيارة وارتداء أوصى معدات الحماية الشخصية. تجنب ملامسة الجلد والعينين والملابس. الابتعاد عن المتضادين مثل المعادن والقلويات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifuجنرال الكتريك العينة في 15،700 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5-10 ميكروغرام الجليكوجين و 250 ميكرولتر precooled (-20 ° C) الأيزوبروبانول. تخلط جيدا واحتضان أكثر من ليلة في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينة في 15،700 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 1 مل 75٪ من الإيثانول، الطرد المركزي في 15،700 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للتتبخر الإيثانول عن طريق تجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح أبيض (على سبيل المثال لمدة 10-15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية DDH 2 O لبيليه واحتضان لمدة 10-15 دقيقة في 55 ° C بحل RNA. ثم الحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم تركيز الحمض النووي الريبي والنقاء التي كتبها قياس الامتصاصية. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق تشغيل العينة على هلام الاغاروز 1٪. </li></ol>

<ol>
	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish.">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li><li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR.">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li><li>Epstein, C. B., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+technology+-+enhanced+versatility,+persistent+challenge.">Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge.</a> Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).</li><li>Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Technology+and+Its+Application+in+Fish+Transcriptomics.">RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics.</a> OMICS. 18, 98-110 (2014).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 40, 274-278 (2006).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry).">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish.">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li><li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins.">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li><li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هذا البروتوكول يسمح للتخصيب السريع للأنسجة القلب الزرد الجنينية للتعبير الجين يحلل. كمية ونوعية عينة الحمض النووي الريبي القلب محددة يعتمد إلى حد كبير على بضع خطوات حاسمة: أولا، كمية من العينة تحسنت كثيرا إذا تم منع فقدان القلوب في كل خطوة من البروتوكول، منذ تنقية RNA...

ويستخدم الزرد (دانيو rerio) على نطاق واسع في علم الأحياء التنموي لدراسة توالد الأعضاء في الجسم الحي بسبب تطورها الجنيني سريعة وشفافة وخارج الرحم، جنبا إلى جنب مع صغر حجمها وتوافر خطوط مراسل المعدلة وراثيا مع التعبير الأنسجة محددة من البروتينات الفلورية. بشكل خاص يناسب هذا الفقاريات الصغيرة بشكل جيد لدراسة تطوير القلب بسبب الأوكسجين للجنين الزرد في وقت مبكر لا تعتمد على ضربات القلب وتدفق الدم. وقد سمحت هذه الميزات توصيف أعداد كبيرة من المسوخ القلب والأوعية الدموية 1،2 والزرد هو الآن كائن نموذج المعترف بها على نطاق واسع لدراسة أمراض القلب 3. لدراسة التعبير الجيني أثناء التطور الجنيني، ويتم تحليل النصوص عادة من قبل جبل لالجامع في الموقع التهجين (WISH) 4، وRT-QPCR 5، 6 ميكروأرس، أو الجيل القادم التسلسل (RNA تسلسل) 7. في حينWISH يسمح للتحليل المكاني الزماني للالتعبير الجيني داخل الجنين بأكمله، يتم تقييمها عادة مستويات النص التي كتبها RT-QPCR، ميكروأرس أو النهج RNA يليها. ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب تخصيب الأنسجة لمحدد التنميط التعبير الجيني. منذ القلب الجنينية الزرد يمثل جزءا صغيرا من جنين كامل، ودراسات Transcriptome على أثناء التطور القلب تتطلب بروتوكول للتشريح وإثراء القلوب. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، من المهم للحفاظ على نسيج القلب تعمل بكامل طاقتها حتى استخراج الحمض النووي الريبي. هنا، نحن تصف بروتوكول للعزل بسرعة طبيعية من الناحية الفسيولوجية وضرب قلوب من مئات الأجنة الزرد الحصول على عينات الحمض النووي الريبي جودة عالية بكفاءة لمزيد من التحليلات. ويستند هذا الأسلوب على بروتوكول ذكرت من قبل بيرنز وماكراي 2006 8. لإثراء الأنسجة القلبية، سواء طرق استخدام خط مراسل عضلة القلب المعدلة وراثياوالاستفادة من الخصائص التفاضلية التصاق قلوب الجنينية الزرد مقابل الأنسجة الأخرى. لفترة وجيزة، قبل pipetting العديد من الأجنة صعودا وهبوطا من خلال طرف ماصة ضيق، يتم الإفراج قلوب في وقت واحد من الهيئات الجنينية وبعد ذلك فصل من الحطام الجنينية في خطوتين الترشيح السريعة؛ ثم يتم فرز قلوب fluorescently المسمى يدويا من الحطام المتبقي وجمع لمزيد من المعالجة.

<table><tbody><tr><td>Equipment for raising fish and collecting eggs&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>see the Zebrafish Book&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; for details</td></tr><tr><td>Fluorescence stereomicroscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Thermo Scientific Nanodrop 2000</td></tr><tr><td>Nucleic acid electrophoresis chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 4 cm &amp;Oslash;, coated with 1% agarose in E3 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml centrifugation tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml and 50 ml centrifugation tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExactaCruz&amp;trade; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&amp;mu;l&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-201732</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m filter (Pre-Separation Filters-30 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes&amp;nbsp;</td><td>Prime</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Egg water medium</td><td></td><td></td><td>60 &amp;mu;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td></tr><tr><td>E3 medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td></tr><tr><td>1% agarose (in E3 medium)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% agarose gel (in TBE buffer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;acute;s L-15 medium&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>1559606</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td>20 &amp;micro;g/&amp;micro;l in RNase-free water</td></tr><tr><td>chloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleic acid loading buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

يتكون القلب الجنينية الزرد فقط بضعة مئات من الخلايا، التي تمثل سوى جزء صغير من الجنين بأكمله. لذلك، لمنع Transcriptome على القلب من أن تقنع من خلال Transcriptome على الجنينية العالمي، فمن الضروري لجمع أعداد كافية من قلوب لمزيد من التحليلات. وعلاوة على ذلك، مع استمرار التطور القلب الزرد بسرعة، وجمع القلب وطرق استخراج الحمض النووي الريبي تحتاج إلى أن تكون سريعة لضمان تجانس العينات. هنا، نقدم اليدوي السريع بروتوكول تشريح لجمع وظيفية / قلوب الضرب من الأجنة الزرد. هذا هو شرط أساسي لاحق القلب محددة استخراج الحمض النووي الريبي لتحديد مستويات القلب محددة التعبير الجيني عن طريق تحليل Transcriptome على مثل الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-QPCR). وتستند هذه الطريقة على الخصائص التفاضلية لاصقة من القلب الجنينية الزرد مقارنة مع الأنسجة الأخرى. وهذا يسمح للفيز السريعالفصل sical من القلب من أنسجة extracardiac من قبل مجموعة من فلويديك تعطيل قوة القص، والترشيح تدريجي وجمع اليدوي المعدلة وراثيا قلوب fluorescently المسمى.

هنا، نحن تصف تمثيلية تجربة تشريح القلب باستخدام الزرد تيراغرام (myl7: GFP) twu34 خط المعدلة وراثيا 9، الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) حصرا داخل عضلة القلب (الشكل 1). جمعنا كل من قلوب تشريح والأجنة من التي كانت تستمد لتقييم نقاء العينة القلب. لفترة وجي?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis at JoVE.com

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

لتحليل القلب ملامح التعبير الجيني أثناء نمو القلب الزرد، لابد من استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من قلوب معزولة. هنا، نقدم بروتوكول لجمع وظيفية / قلوب الضرب السريع تشريح اليدوي من أجنة الزرد الحصول مرنا القلب محددة.

على نطاق واسع اسماك الزرد الجنينية القلب تشريح لتحليل الترانسكربتي

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.4K Views.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  لتحليل القلب ملامح التعبير الجيني أثناء نمو القلب الزرد، لابد من استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من قلوب معزولة. هنا، نقدم بروتوكول لجمع وظيفية / قلوب الضرب السريع تشريح اليدوي من أجنة الزرد الحصول مرنا القلب محددة. 

Video: Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

تشريح اليرقات الزرد الغدد التناسلية الأنسجة

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.

تحليل النزوح من تشوه عضلة القلب الميكانيكية (DIAMOND) يكشف التغايرية القطعية لوظيفة القلب في حمار وحشي الجنيني

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

مجهرية Fluorescence ورقة الضوء لالتقاط الصور 4-الأبعاد من آثار تحوير إجهاد القص في قلب الزرد النامي

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Bioengineering

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

تشريح القلب في اليرقات ، اسماك الزرد الأحداث والكبار ، دانيو rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Biology

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.

المجهر ورقة خفيفة من ديناميات القلب السريع في أجنة حمار وحشي

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological phenomena. Zebrafish have been used as an effective genetic model to study numerous questions related to heritable disease, development, and toxicology at the whole-organ and -organism level. Due to the well-annotated and mapped zebrafish genome, numerous tools for gene editing have been developed. However, the efficacy of generating and ease of detecting precise knock-in edits using CRISPR is a limiting factor. Described here is a CRISPR-Cas9-based knock-in approach with the simple detection of precise edits in a gene responsible for cardiac repolarization and associated with the electrical disorder, Long QT Syndrome (LQTS). This two-single-guide RNA (sgRNA) approach excises and replaces the target sequence and links a genetically encoded reporter gene. The utility of this approach is demonstrated by describing non-invasive phenotypic measurements of cardiac electrical function in wild-type and gene-edited zebrafish larvae. This approach enables the efficient study of disease-associated variants in a whole organism. Furthermore, this strategy offers possibilities for the insertion of exogenous sequences of choice, such as reporter genes, orthologs, or gene editors.

This protocol describes an approach to facilitate precise knock-in edits in zebrafish embryos using CRISPR-Cas9 technology. A phenotyping pipeline is presented to demonstrate the applicability of these techniques to model a Long QT Syndrome-associated gene variant.

تعديلات دقيقة بوساطة CRISPR-Cas9 في قلوب الزرد

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...