The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).

הערה: כל הליכי הניסוי אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש UCSF המוסדית. 1. Cryopreservation וקיבוע של לבבות עכבר עובריים. 1.1) Snap-הקפאת לב עוברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני מלא cryomolds 3.5 צלחת פטרי סנטימטר ו- 7 מ&quot;מ עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) (ראה לוח חומרים). במנדף כימי, לקרר 2-methylbutane בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 30 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) לתוך 10 מנות סנטימטר פטרי, 10 מיליליטר של PBS לתוך 3.5 מנות סנטימטר פטרי, ולמקם את כל צלחות פטרי על קרח. הכן צלחת 10 סנטימטר אחד וכמה מנות של 3.5 סנטימטר לכל עכבר בהריון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד עוברים כפי שתואר לעיל 15, ביצוע הנתיחה בPBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, להרדים את הנקבה בהריון באמצעות CO 2 הרדמה ונקע בצוואר הרחם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בבטן, לנתח את הרחם על ידי חיתוך כלי along העקמומיות הפנימית של הרחם, ולהעביר את הרחם לצלחת פטרי 10 סנטימטרים המכילה PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הרחם בין כל עובר והעברה לצלחת 3.5 סנטימטר בודד פטרי המכילה PBS קר כקרח. לבודד כל עובר כמתואר 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל קרום הלב באמצעות מלקחיים בסדר, להסיר את הלב מן הריאות וכלי הדם על ידי חיתוך באב העורקים, נחות וריד נבוב, וורידי ריאתי, ולהעביר לצלחת פטרי סנטימטר המכילה 3.5 אוקטובר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הלב לאזן ב אוקטובר לכמה שניות, ואז להעביר את הלב לתבנית 7 מ&quot;מ המכילה אוקטובר כוון את הקיר הקדמי של הלב לתחתית התבנית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את התבנית לתוך 2-methylbutane מקורר חנקן נוזלי. שים לב שלא יאפשר לנוזל 2-methylbutane לגעת ב- OCT או לב. להקפיא עד-OCT היא מוצקה לבן, ולאחר מכן להעביר את התבנית לדלי קרח המכיל קרח יבש. לעבור לעובר הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Wrap cryomolds בנייר כסף ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לcryosectioning. </li></ol> 1.2) אלטרנטיבי: Paraformaldehyde (PFA) תיקון, cryoprotecting, ואוקטובר הטבעת לב עוברי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הבארות של צלחת תרבית רקמה 12 גם עם 4% PFA ב1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הלב העוברי כפי שמתואר ב1.1.3. מניחים כל לב לPFA 4% המכיל גם ולתקן על 4 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotection: בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, להעביר כל לב לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל סוכרוז 1.5 מיליליטר של 15% ב- PBS ובעדינות להתסיס על 4 מעלות צלזיוס עד הלב שוקע לתחתית של התחתית (כמה שעות לO / N ). העבר כל לב ל1.5ml המכיל 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge של סוכרוז 30% ב- PBS ובעדינות להתסיס על 4 מעלות צלזיוס שוב עד הלב שוקע לתחתית של התחתית (כמה שעות לO / N). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, למקם את לב cryoprotected לOCT ולתת לו לאזןבמשך כמה דקות כדי להסיר סוכרוז העודף, ואז להעביר את הלב לתבנית 7 מ&quot;מ המכילה אוקטובר כוון את הקיר הקדמי של הלב לתחתית התבנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את הלב ב אוקטובר על ידי הצבת את התבנית בשני 2-methylbutane מקורר חנקן הנוזלי או קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף בנייר הכסף cryomolds ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לcryosectioning. </li></ol> 2. Cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורת cryostat מוגדר -17 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום cryomolds לתוך תא cryostat ולאזן לטמפרטורה במשך 15-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את cryomold ולהשתמש בלחץ עדין לגרש את גוש לב מהתבנית. כוון את הקיר הקדמי של הלב לחלק העליון של בלוק הרקמה היצוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה גדולה של אוקטובר על צ&#39;אק, והר בלוק לב על ירידת אוקטובר להקפיא על צ&#39;אק. שמור את הכיוון כך שהקיר הקדמי של הלב הוא רחוק ביותר מצ&#39;אק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צ&#39;אק ורכוב הואבלוק אמנות על בעל אובייקט cryostat. התאם כך שהזווית של הלהב היא 3-5 מעלות ביחס למדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 10 מיקרומטר חלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ שכבר מראש שטופלו בציפוי טעון חיובי (ראה לוח חומרים). לאפשר לו להתייבש לחלוטין לפני האחסון ב -80 ° C. </li></ol> 3. Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסעיפי snap-קפוא, לתקן וpermeabilize רקמה באצטון במשך 10 דקות במנדף בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסעיפי snap-קפוא וקבוע PFA, דגירה בPBS-0.1% Triton X-100 במשך 20 דקות כדי להסיר OCT ולpermeabilize סעיפים קבועים PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק במשך 45 דקות בחיץ חסימת 1x, בדילול מלא PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתם משתמשים בנוגדן ראשוני שנוצר בעכבר, דגירה בחמור או עז אנטי העכבר IgG בר Fab חד ערכי בדילול 1 (H + L): 100 בTween%-0.1 PBS 20 במשך 45 דקות ב RT (ראה דיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בנוגדן ראשוני או נוגדנים בדילול מלא חיץ חסימת 1x לשעה 2 ב RT אוO / N ב 4 ° C (ראה טבלה של חומרים / ציוד לדילולים ספציפיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים ב1x PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בנוגדנים משני פלואוריד מצומדות- Alexa דילול 1: 500 בחסימת מאגר לשעת 2 ​​ב RT, המוגנת מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים ב1x PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות ב RT, מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: דגירה בצבע Hoechst דילול 1: 2,000 ב PBS ב RT (מוגנת מפני אור) לתייג גרעינים, ולאחר מכן לשטוף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן סעיפים שבכותרת 1% PFA 1 דקות בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שקופיות במדיום אנטי לדעוך (עם DAPI אם גרעינים לא מסומנים כבר) על ידי הצבת שתי טיפות בינוניות בכל קצה של השקופית ולאחר מכן מכסה עם coverslip. חותם coverslips עם לק. חנות מוגנת מפני אור על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לתמונה. </li></ol> 4. Confocal הדמיה וניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אורכי הגל המתאימים לייזר, מצלמה, וinc מיקרוסקופ confocalluding מניע במה ומנוע z. הפעל את תוכנת הדמיה התכנית. השתמש 405, 488, 561 ואורכי גל לייזר הדמיה Hoechst-, Alexa 488-, וAlexa סעיפים 568-צבעוניים, בהתאמה. הערה: ראה לוח חומרים למפרטי החומרה ותוכנה שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר שקופיות שליטה (coverslip למטה למיקרוסקופ הפוך) על הבמה השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מטרת 4X (ראה לוח חומרים), למצוא את המדגם והאזור של עניין. ללכוד את התמונה שישמש כמפה כאשר הדמיה בהגדלה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופית, ביצוע התאמות מינימליות לבמה השקופיות. שינוי למטרת טבילת 60x שמן (ראה לוח חומרים), מקום טיפה קטנה של שמן על המטרה, ולהחליף את השקופית (coverslip למטה) על הבמה השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא מדגם שוב. הגדר את כוח הלייזר, זמן חשיפה, וbinning לרמות הרצויות לכל ערוץ. הערה: אנחנו בדרך כלל להשתמש בכוח הלייזר של 0.8, זמן חשיפת מצלמה של 100 אלפיות שניים, וbinning של 2 (seדואר לוח חומרים למפרטי חומרה ותוכנה); הגדרות אופטימליות צריכים להיקבע באופן אמפירי עבור כל ניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהגדרות אופטימליות נקבעות, השתמש באותן הגדרות לכל חלקי הרקמות בתוך הניסוי. השתמש בהיסטוגרמה עוצמת לציין טווח עצימות האופטימלי עבור כל ערוץ (מידע זה ישמש לניתוח). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור ערימת az באמצעות פונקצית הרכישה: בחר את ערוצי הלייזר המתאימים, ולאחר מכן לבחור את הגבולות העליונים ותחתונים של ערימת z. בחר את גודל צעד ערימת az שהוא מחצית הערך של העובי הפרוסה האופטי הניתן על ידי התוכנה. לחץ על &quot;הפעל&quot; כדי לאסוף את התמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיג&#39;י 16 או תכנית דומה לניתוח תמונה. בתוך פיג&#39;י, לפתוח את קובץ ערימת z עם אפשרות מצב צבע מותאם אישית והערוצים פוצלו לחלונות נפרדים. פתח את הכלי &quot;כוונון הבהירות / ניגודיות&quot; מהתמונה הנפתח תפריט; בתוך כל ערוץ, זהet טווח עצימות היסטוגרמה האופטימלי נקבע ב4.5.1. החל טווחי ערוץ אלה לכל ערימות z להיות מנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיזוג הערוצים הבודדים לתמונה מורכבת אחת באמצעות&gt; תפריט הנפתח צבע Image-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור ערימת z שטוחה מהתמונה המורכבת באמצעות Image-&gt; Stacks-&gt; תפריט פרויקט z. תמונה זו תהיה בהירה יותר באופן משמעותי מתמונת 3D; להתאים את טווח עוצמת היסטוגרמה למדגם השליטה כדי למנוע oversaturation, ולהחיל אותן ההגדרות לערימת z הניסיונית שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור תמונת 3D, השתמש הראשון Image-&gt; Stacks-&gt; פרויקט 3D תפריט 17. בחר בציר x או y-ציר הסיבוב. הגדר את מרווח הפרוסה כמספר זהה של מיקרון כגודל צעד ערימת z. בחר את הסיבוב הכולל הרצוי ולהגדיר את תוספת זווית סיבוב ל1. ואז לפתוח את התמונה J 3D Viewer מתוספי תפריט הנפתח. בחר התמונה המורכבת שנוצרה ב4.8, תצוגה כנפח, ולהגדיר את Reדגימת גורם ל1 או 2. </li></ol>

<ol>
	<li>Risebro, C. A., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+ventricles.">Formation of the ventricles.</a> The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).</li><li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation research. 92, 133-135 (2003).</li><li>Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transitional+junction:+a+new+functional+subcellular+domain+at+the+intercalated+disc.">The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc.</a> Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.+Nature+reviews.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).</li><li>Kastner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+deficiency+and+mutations+of+RXRalpha,+RXRbeta+and+RARalpha+lead+to+early+differentiation+of+embryonic+ventricular+cardiomyocytes.">Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes.</a> Development. 124, 4749-4758 (1997).</li><li>Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+ventricular+trabeculation/compaction+and+the+pathogenesis+of+the+left+ventricular+noncompaction+cardiomyopathy+(LVNC).">Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC).</a> American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+alpha3beta1+integrin+isoforms+in+association+with+myofibrillogenesis+during+cardiac+myocyte+development+in+culture.">Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture.</a> Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).</li><li>Lu, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin+nexus+in+cultured+cardiac+myocytes.">The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes.</a> The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).</li><li>Schultheiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+subsets+of+myofibrillar+proteins+in+cardiac+nonstriated+and+striated+myofibrils.">Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils.</a> The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).</li><li>Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costameres,+focal+adhesions,+and+cardiomyocyte+mechanotransduction.+American+journal+of+physiology.">Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).</li><li>Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+novel+Xin+protein+to+the+adherens+junction+complex+in+cardiac+and+skeletal+muscle+during+development.">Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).</li><li>Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-RAP+expression+during+mouse+heart+development.">N-RAP expression during mouse heart development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).</li><li>Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cardiac+cytoarchitecture+in+the+developing+mouse+heart.">Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart.</a> Developmental biology. 289, 430-441 (2006).</li><li>Whitman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin+and+talin2+are+novel+mRNA+targets+of+fragile+X-related+protein-1+in+cardiac+muscle.">Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle.</a> Circulation research. 109, 262-271 (2011).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC. 11, 274 (2010).</li><li>Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+cadherin-binding+proteins+beta-catenin+and+plakoglobin+in+the+heart+leads+to+gap+junction+remodeling+and+arrhythmogenesis.">Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis.</a> Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nature. 7, 168-169 (2010).</li><li>Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+immunohistochemistry:+review+and+future+prospects+in+research+and+diagnosis+over+two+decades.">Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).</li><li>Risebro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+maintains+muscle+structure+and+growth+in+the+developing+heart.">Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart.</a> Development. 136, 495-505 (2009).</li><li>Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillogenesis+in+the+developing+chicken+heart:+assembly+of+Z-disk,+M-line+and+the+thick+filaments.">Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

טכניקת קיבוע רקמה האופטימלית והדילול צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור כל נוגדן. בידיים שלנו, snap-ההקפאה עדיפה על קיבעון PFA במשך כמה אנטיגנים cardiomyocyte, כוללים s-α-actinin, β-קטנין, β1-integrin, tropomyosin, ילין (לא מוצג) וN-cadherin; בניגוד לכך, קיבעון PFA מניב תוצאות מעולים עבור kinase הידבקות מוקד (לא מוצג). Crosslinks החלבון שנוצר על ידי PFA עלול להסוות epitopes ונוגדן מגבלה מחייבת; אחזור אנטיגן עשוי להידרש במקרים כאלה, ושיטות לאחזור אנטיגן ניתן למצוא במקום אחר 20. ריכוז PFA או אורך של קיבעון יכול להיות ירידה להפחית מיסוך epitope, עם תנאים אופטימליים באופן אמפירי שנקבעו לכל נוגדן ובכל שלב התפתחותי. יש להשתמש בבקרות שליליות מתאימות כאשר אפיון נוגדנים חדשים או מוטציה לב, כולל סרום מראש חיסוני כמו שליטת הנוגדן הראשונית ושיתוף &quot;אין נוגדן ראשוני&quot;ntrol. שימוש בעכברי נוקאאוט הוא שליטה שלילית אידיאלית אבל קטלני מוקדם מונע את השימוש בם לרבים ממוצרי הגן למדו כאן. שימוש באמצעי אחסון נאות כדי להטביע לחלוטין שקופיות ניסיוניות ושליטה באותו החסימה immunofluorescence, נוגדן, ופתרונות לשטוף היו חשובים כפי שהייתה נדנדה עדינה של שקופיות במהלך דגירה כדי להבטיח חשיפה אחידה של החלקים לפתרונות. גישה זו ממוזערת השתנות טכנית במכתימה בין חלקים ושקופיות בתוך ניסוי. כאשר העלות מגבילה את נוגדן פתרון הנפח, להשתמש בעט פאפ להגביל את הזרימה של פתרונות מעבר לסעיפי הרקמות ולשמור שקופיות בתא humidified במהלך incubations הארוך. אם נוגדן חד שבטי עיקרי עכבר - ולכן נוגדנים משני אנטי עכבר - נמצא בשימוש, צעד חסימה שני כדי לכסות נוגדנים עכבר אנדוגני יהיה צורך (שלב 3.4) כדי להקטין את אות רקע ספציפי. שיטות מיקרוסקופיה ועיבוד תמונה מתאימות הן קריטיות להשגת מידע מדויק מבחינה ביולוגית 21. היסטוגרמה עוצמת מציינת את ההפצה של פיקסלים בכל רמת אינטנסיביות (0 - 65535 רמות לתמונת 16-bit) לכל צבע. רקע, בהירות וניגודיות יכולות להיות מותאמת על ידי הגדרת טווח תצוגת עוצמה שמאגף את שיא היסטוגרמה; לעשות השוואות תקפות בין תנאים, יש להשתמש באותן ההגדרות בין שליטה ותנאי ניסוי. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לניתוח התבגרות cardiomyocyte ופיתוח בלב העכבר העוברי הילידים. בעוד immunofluorescence של חלבוני cardiomyocyte ספציפי משמש לעתים קרובות כדי לסמן cardiomyocytes במהלך פיתוח, מחקרים מעטים להעסיק טכניקות המאפשרות ניתוח ברזולוציה גבוהה של מבנה myofibril ואת הופעתה של דיסקים וcostameres 12-14,22,23 intercalated. טכניקה זו יכולה לשמש בvהערכת איבו של מוטציות הגורמות למומי לב התפתחותית, כאמצעי לזיהוי שינויים בהתבגרות cardiomyocyte שעשויה לשפוך אור על מנגנונים של מומים מבניים.

במהלך פיתוח, התכווצויות לב מתחילות מייד לאחר cardiomyocytes להגר לקו האמצע ויוצר 1,2 צינור לב ליניארי. Sarcomere הוא יחידת ההתכווצות הבסיסית בתוך cardiomyocyte; מבנה cytoskeletal מאוד מאורגן זה מכיל סיבי אקטין מעוגן Z-הדיסק על ידי α-actinin sarcomeric (s-α-actinin) וסיבי שרירן מעוגנים לקו M (איור 1). כcardiomyocyte מתבגר, sarcomeres להרכיב בסדרה כדי ליצור myofibrils שמשתרעים על פני התא. Myofibrils מעוגנים לקצוות של cardiomyocyte על ידי דיסק intercalated, מבנה junctional תאי תאים המכיל צומת מעבר עם קבוצת משנה של אלמנטי Z-דיסק כגון S-α-actinin 3, adherens חלבוני צומת כגון N-cadherin וקטנין β, חלבוני צומת פער, וdesmosomes (איור 1) 4. לאורך קרום האורך, Z-הדיסקים של myofibrils ההיקפי גםלצרף קרום התא באמצעות costameres; הידבקויות מוקד מתמחים אלה מספקים עוגן בין myofibril, קרום פלזמה, ומטריצת חוץ-תאית כדי לספק תמיכה מבנית נוספת לcardiomyocyte (איור 1) 4. בשלב מוקדם בהתפתחות לב, cardiomyocytes מסודר בתחזיות כמו אצבע הידועה כtrabeculae שבולטות לתוך החלל של החדר ומכילים myofibrils יחסית בוגר 5. כתמורת התפתחות לב, שריר הלב באזור תת-epicardial להתרבות כדי ליצור את שריר הלב הקומפקטי שכולל את הקירות של החדר, אבל sarcomere והרכבת myofibril מעוכבים בהשוואה לשריר לב trabecular 5,6. מודלים של sarcomere והרכבת myofibril לבוא במידה רבה ממחקרי immunofluorescence על cardiomyocytes התרבותי 7-10, שהם פשוטים אך חסרי סביבה תלת-ממדית, את זרימת דם, ואנשי קשר עם תא לב אחרזה נוכחי in vivo. מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה באמצעות immunofluorescence בלב העוברי של העכבר הוא מאתגר מבחינה טכנית, וכמה מחקרים בחנו את הופעתה של דיסקים וcostameres intercalated במהלך התפתחות לב עכבר. חלבון צומת adherens β קטנין מופיע בתרגום לדיסקי intercalated ביום עוברי (E) 17.5 11, N-cadherin localizes למבנים ליניארי שעשוי לייצג דיסקי intercalated על ידי 12 E18.5 לעומת יום לידה 0 13, וcostameres זוהה ב 14 E18.5, אבל חלבונים אלה להציג הפצת קרום מפוזרת ורציפה יותר בנקודות זמן התפתחותי מוקדם יותר 11-13. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לשחזור ולimmunostaining מיקרוסקופ פלואורסצנטי של לב העוברי של עכבר מחולק המאפשרת ניתוח מפורט של myofibril ופיתוח cardiomyocyte, כוללים את הופעתה של intercalaטד דיסקים מוקדם ככל E12.5 וcostameres המתהווה בE16.5. פרוטוקול זה יכול להיות שימושי לבדיקת ההשפעות של מוטציות על היווצרות sarcomere כמו גם התבגרות myofibril וcardiomyocyte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:335px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Cryomold, Disposable Base Mold, 7x7 mm</td>
			<td style="width:167px;">Richard-Allen Scientific</td>
			<td style="width:160px;">58949</td>
			<td style="width:335px;">This size not available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Cryomold, Disposable Base Mold, 15x15 mm</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">22-050-159</td>
			<td style="width:335px;">Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td style="width:160px;">25608-930</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">2-methyl butane</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">M32631</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">T353-500</td>
			<td style="width:335px;">Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Sucrose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">S0389</td>
			<td style="width:335px;">Use 15% and 30% solutions in 1X PBS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">S30467-1</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">12-550-15</td>
			<td style="width:335px;">&#34;Plus&#34; indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Acetone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">179124</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Western Blocking Agent</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">11921673001</td>
			<td style="width:335px;">Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Tween 20</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">P9416</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment</td>
			<td style="width:167px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:160px;">715-007-003</td>
			<td style="width:335px;">Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:285px;">Anti-s-a-actinin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">A7811</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Anti-bcatenin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:160px;">9587s</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Anti-b1 integrin antibody</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:160px;">AF2405</td>
			<td style="width:335px;">Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:285px;">Anti-tropomyosin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td>
			<td style="width:160px;">CH1</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:160px;">sc-7939</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:285px;">Anti-talin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">T3287</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:160px;">700255</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-21202</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A10042</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-11001</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-11011</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Hoechst 33342 dye</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">H3570</td>
			<td style="width:335px;">Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Vectashield</td>
			<td style="width:167px;">Vector labs</td>
			<td style="width:160px;">H-1000</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Coverslips</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">12-548-5M</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box</td>
			<td style="width:167px;">Keysight (formerly Agilent)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Clara Interline CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Andor</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:285px;">CFI Plan Apochromat 4X air objective</td>
			<td style="width:167px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602)</td>
			<td style="width:167px;">Nikon&#160;&#160;</td>
			<td style="width:160px;">NA 1.4, WD 0.13 mm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:285px;">NIS Elements Imaging Software</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:160px;">http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:167px;">Fiji</td>
			<td style="width:160px;">http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart

במהלך התפתחות לב, הדור של יחידות שריר לב ספציפי מבניות ותפקודיות כוללים sarcomeres, myofibrils התכווצות, דיסקי intercalated, וcostameres דורש הרכבה מתואמת של רכיבים מרובים בזמן ובמרחב. שיבוש בהרכבה של רכיבים אלה מוביל למומי לב התפתחותית. טכניקות צביעת Immunofluorescent משמשות בדרך כלל בשריר לב בתרבית לחקור התבגרות myofibril, אבל גישת vivo לשעבר זה היא מוגבלת על ידי המידה שבה myocytes יבדיל באופן מלא תרבות, חוסר תשומות מכאניות in vivo נורמלים, והיעדר רמזי endocardial. היישום של טכניקות immunofluorescence ללימוד פיתוח לב עכבר רצוי אבל יותר מאתגר מבחינה טכנית, ושיטות לעתים קרובות חוסר רגישות מספקת ורזולוציה לדמיין sarcomeres בשלבים המוקדמים של פיתוח לב השלבים. כאן אנו מתארים שיטה חזקה ושחזור לשתף immunostain muחלבוני ltiple או לשתף לדמיין חלבון פלואורסצנטי עם מכתים immunofluorescent בלב העכבר העוברי ולהשתמש בשיטה זו כדי לנתח myofibrils פיתוח, דיסקי intercalated, וcostameres. שיטה זו יכולה להיות מיושמת נוספת כדי להעריך את השינויים מבניים cardiomyocyte נגרמים על ידי מוטציות המובילות למומי לב התפתחותית.

איורים 2 עד 6 תוצאות טיפוסיות תכנית לשיתוף צביעה של חלבונים שונים בלב snap-קפוא וקבוע אצטון. הנוגדן נגד s-α-actinin Z-דיסקים שכותרתו reproducibly ודיסקי intercalated עם סגוליות גבוהות ורקע מינימאלי (2A דמויות, 3A, 4 א, ​​5 א, 6 א, ו6C); איור 6 מראה שאנטי העכבר IgG (+ H L) קטע Fab חד ערכי חוסם ביעילות עכבר אנדוגני IgG כריכה בנוגדנים משני אנטי עכבר. הנוגדן נגד חלבון צומת adherens β קטנין מחויב הקרום של שני cardiomyocytes ותאים שאינם cardiomyocyte, ושיתוף לוקליזציה עם s-α-actinin התרחש בדיסקי intercalated חזקה בE16.5 (איור 2C ו- D), כצפוי מ דפוס מכתים קטנין β בלב המבוגר 18. βimmunofluorescence integrin 1 בלב העוברי הוא מאתגר במיוחד, ולעתים קרובות לא מצליח לזהות הידבקויות מוקד 14, אבל צביעת integrin β1 במחקרים אלה גילה אות באותה המחזוריות כZ-דיסקי s-α-שכותרתו actinin, שכנראה משקפים את costameres המתהווה יוצר ב E16.5 (איור 3D). בE12.5, זה-α-actinin וtropomyosin (חלבון נימה דק sarcomere) immunofluorescence חשף דפוס מכתים עם מחזוריות קבועה בcardiomyocytes trabecular בקנה אחד עם myofibrils הבוגר בתאים (4A אלה הדמויות ו5A לs-α-actinin; איור 4 לtropomyosin). צביעת N-cadherin בcardiomyocytes trabecular בלב E12.5 נטתה colocalize עם אזורים של מכתים s-α-actinin האינטנסיבי (איור 5 ב - D ואיור 6 א - ג) אולי מייצגים דיסקי intercalated. בבניגוד לmyocytes trabecular, זה-α-actinin באזור הקומפקטי יותר מאשר punctate ליניארי, ומכתים tropomyosin היה מפוזר ולא ליניארי (איור 4 א ו -4 ב). לפיכך, ההרכבה sarcomere עלולה להתרחש מאוחר יותר בקומפקטי בהשוואה לשריר לב trabecular. יתר על כן, דפוסי ההפרש של s-α-actinin וtropomyosin באזור הקומפקטי מצביעים על כך שזה-α-actinin מארגן לpuncta וZ-דיסקים בשלה מוקדם, ואילו tropomyosin שילובם בנימה דקה עשויה להיות אירוע מאוחר יותר בהרכבת myofibril. איור 7, סרט 1, וסרט 2 להפגין תוצאות טיפוסיות מלב עוברי E12.5 קבוע PFA. בדוגמאות אלה, עובר מהונדס LifeAct-RFPruby שימש להדמיה; transgene LifeAct-RFPruby 19 תוויות אקטין פילמנטיות אבל דורש קיבוע PFA. Z-הדיסקים שכותרתו עם s-α-actinin היו קל לדמיין ברוב האזורים, אך יחס אות לרעש היה decre<html> ased לעומת snap-קפוא חלקי לב (איור 7 א); אות זה הייתה אופיינית לimmunofluorescence s-α-actinin ברקמה קבועה PFA, שבי epitopes ניתן רעול פנים על ידי קישורים צולבים חלבון. איור 7 מציג שיתוף הדמיה של אקטין פילמנטיות וimmunolabeled s-α-actinin בתוך myofibrils (ראשי חץ) ותקטין פילמנטיות בתוך תאי endocardial סמוכים לmyocytes trabecular (חיצים). תלת ממדי שחזור תמונה חשף פרטים נוספים: cardiomyocytes הבודד הובחנו בקלות רבה יותר, myofibrils בתוך cardiomyocyte בערך היו מקביל זה לזה, אבל cardiomyocytes הבודד היו בכיוון בזוויות שונות זו לזו (איור 7 ג &#39;ו-ד, סרט 1, והסרט 2 ). ההערכה הקרובה בין תאים וcardiomyocytes endocardial הייתה טובה יותר מוערכת בתצוגות תלת-ממדיות, כמו גם. <html> &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig1.jpg" /> 1. sarcomeres איור Cardiomyocyte, דיסקי intercalated, וcostameres. Z-הדיסק מעגן סיבי אקטין, ואילו קו M מעגן סיבי מיוזין, אשר חופפים את סיביות אקטין. Sarcomere כולל אחד Z-דיסק - קו M - יחידת Z-דיסק. sarcomeres מרובה בסדרה ליצור myofibril. הסוף לרוחב של myofibril מחדיר לתוך הגבול הרוחבי של cardiomyocyte במבנה junctional מיוחד תאי תאים הנקראים דיסק intercalated. myofibrils היקפי להתחבר לקרום הפלזמה cardiomyocyte האורך באמצעות costameres, המהווים הידבקויות מוקד עם המטריצה ​​תאית בין cardiomyocytes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> טען / 52,644 / 52644fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. s- α -actinin וβ קטנין immunofluorescence ביום עוברי 16.5. הלב היה נכרת, הצמד קפוא, cryosectioned, וimmunostained באמצעות () נוגדן חד שבטי EA53 שיבוט עכבר נגד s-α-actinin-קבוע אצטון, ש תמונות cardiomyocyte שכותרתו Z-דיסק ודיסקי intercalated, ונוגדן polycloncal ארנב (B) נגד חלבון צומת adherens β קטנין. (C) מוזגו להראות s-α-actinin וצביעת קטנין β. (ד) מוגדלות שטח של עניין מהפנל C ; סימן כוכבית חזקה דיסקי intercalated עם עמיתים ללוקליזציה של s-α-actinin וקטנין β. תמונות נלקחו מהקיר ההיקפי של החדר השמאלי או שריר הלב קומפקטי, עם שכבת epicardial בפינה השמאלית העליונה של AC פנלים. מגוון היסטוגרמה עוצמת תצוגה 460-1600 (מתוך of 0-65,535 אפשריים) עבור שני קטנין / 561 ערוצי לייזר ננומטר ננומטר וβ s-α-actinin / 488. בר סולם 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig3.jpg" /> איור 3. s- α -actinin וβ immunofluorescence integrin 1 ביום עוברי 16.5. הלב היה נכרת, הצמד קפוא, cryosectioned, קבוע אצטון, וimmunostained באמצעות () נוגדן חד שבטי EA53 שיבוט עכבר נגד s-α-actinin ו תמונות נוגדן עז (B) polyclonal נגד חלבון הידבקות מוקד β1 integrin. (C) מוזגו להראות integrin β1 בcardiomyocyte כמו גם תאים שאינם cardiomyocyte. שים לב גם לדיהpunctate β1 אות integrin בשריר לב (D) מוגדל שטח של עניין מpunctate הערה ג הפנל, צביעת β1 תקופתיים integrin (חיצים) עם מחזוריות דומה לסמוך s-α-actinin מכתים בZ-דיסקים.; מבנים אלה עשויים לייצג costameres. תמונות נלקחו משריר הלב הקומפקטי של החדר השמאלי. מגוון היסטוגרמה עוצמת תצוגה 460-1200 (מתוך 0-65,535 אפשריים) לs-α-actinin / 488 ערוץ ננומטר לייזר ו460-600 לערוץ ננומטר לייזר β1 integrin / 561. בר סולם 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig4.jpg" /> איור 4. s- α -actinin וimmunofluorescence tropomyosin ב 12.5 יום עוברי: ארגון myofibril ב<html> trabecular ושריר לב קומפקטי. לבבות מעוברי littermate היו נכרת, צמד קפוא, cryosectioned, קבוע אצטון, וimmunostained באמצעות () נוגדן חד שבטי EA53 שיבוט עכבר נגד s-α-actinin ו( B) נוגדן חד שבטי עכבר נגד דקה נימה myofibril tropomyosin חלבון (בנק Hybridoma התפתחותית מחקרים CH1). Trabecular (חיצים) ושריר לב קומפקטי (ראשי חץ) מצוין. הערה צביעה ליניארי s-α-actinin עם מחזוריות קבועה בשריר לב trabecular, בהשוואה למגוון של דפוסי מכתים כוללים puncta כמו גם צביעה ליניארי בשכבה הקומפקטית (). שים לב גם מכתים tropomyosin ליניארי עם מחזוריות קבועה בשריר לב trabecular אבל כתמים מפוזרים יותר בשריר לב קומפקטי. מגוון היסטוגרמה עוצמת תצוגה 460-1,400 (מתוך 0-65,535 אפשריים) לערוץ s-α-actinin ו460-1,000 לערוץ tropomyosin. סרגל 10 מיקרומטר.יעד &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig5.jpg" /> איור 5. s- α -actinin וimmunofluorescence N-cadherin ביום עוברי 12.5:. Myofibrils ודיסקי intercalated בcardiomyocytes trabecular הלב היה נכרת, הצמד קפוא, cryosectioned, קבוע אצטון, וimmunostained באמצעות (א) שיבוט חד שבטי עכבר EA53 נוגדן נגד s-α-actinin ונוגדן polyclonal ארנב (B) נגד חלבון הידבקות מוקד N-cadherin. 0.2 מיקרומטר פרוסות אופטיות נאספו כערימת az, וערימות z יושרו על מנת ליצור את התמונות. מוזגו ערימות (C) שיטחו להראות שני N-cadherin וצביעת s-α-actinin בתוך cardiomyocytes trabecular כwell כגרעינים שכותרתו עם צבע Hoechst (D) מוגדלות שטח של עניין מC הפנל.; כוכביות לסמן דיסקי intercalated עם עמיתים ללוקליזציה של s-α-actinin וN-cadherin. מגוון היסטוגרמה עוצמת תצוגה 470-1,200 (מתוך 0-65,535 אפשריים) ל/ 405 ערוץ ננומטר לייזר Hoechst ו470-2,000 עבור שני S-α-actinin / 488 ננומטר ו- N-cadherin / 561 ערוצי לייזר ננומטר. בר סולם 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig6.jpg" /> איור 6. אנטי העכבר IgG (L H +) בר Fab חד ערכי חוסם ביעילות עכבר אנדוגני IgG כריכה בנוגדנים משני אנטי עכבר. E12.5 לב עוברי היה נכרת, הצמד קפוא, cryosectioned, קבוע אצטון, וimmunostained. <strong&gt; סעיפים (AC) נחסמו עם חיץ חסימת 1x אחריו אנטי עכבר בר IgG חד ערכי Fab, נחשפו לשיבוט חד שבטי עכבר EA53 נוגדן ראשוני נגד s-α-actinin ונוגדן ראשוני polyclonal ארנב נגד N-cadherin, שטפו, ונחשפו לאלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר ונוגדנים משני 586 נגד ארנב אלקסה פלואוריד. תמונה () מוזגה באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500 (מתוך 0-65,535 אפשריים). אזורי פתק כוכביות שבN-cadherin אות מוגבל לסוף הרוחבי של cardiomyocytes trabecular, שסביר להניח מייצג דיסקי intercalated המתהווים. (B) N-cadherin רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (C) s-α -actinin בלבד ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. סעיפים (DG) נחסמו עם חיץ 1x חסימה בלבד (ללא צעד אנטי עכבר IgG חד ערכי Fab בר חסימה), נחשפו לארנב polyclonalנוגדן ראשוני נגד N-Cadherin בלבד (ללא נוגדן ראשוני חד שבטי עכבר), שטף, ונחשף לאלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר ונוגדנים משני 586 נגד ארנב אלקסה פלואוריד. (ד) מוזגו תמונה באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. s-α-actinin רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500 (E) N-cadherin רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (F). (G) s-α-actinin רק ערוץ באמצעות טווח רגישות גבוהה היסטוגרמה עוצמת תצוגה 480-530, אשר חושף גילוי רקע IgG עכבר אנדוגני בהעדר הצעד אנטי עכבר IgG חד ערכי Fab בר החסימה. סעיפים (HK) נחסמו עם חיץ חסימת 1x אחריו אנטי העכבר IgG בר חד ערכי Fab, נחשף לנוגדן ראשוני polyclonal ארנב נגד N-cadherin (אין נוגדן ראשוני חד שבטי עכבר), שטף, ונחשף לאלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר והכסה פלואוריד נוגדנים משני 586 נגד ארנב. (H) מוזגה תמונה באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (I) N-cadherin רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (J) s-α-actinin- רק ערוץ באמצעות מגוון תצוגת היסטוגרמה עוצמת 480-2,500. (K) s-α-actinin רק ערוץ באמצעות מגוון רגישות גבוהה תצוגת היסטוגרמה עצמת 480-530, אשר מדגים את חוסר זיהוי IgG העכבר אנדוגני רקע כאשר אנטי עכבר IgG משמש צעד בר חד ערכי Fab חסימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52644/52644fig7.jpg" /> איור 7. s- α -actinin וארגון אקטין בCardi trabecularomyocytes ביום עוברי 12.5. קו העכבר מהונדס LifeAct-RFPruby שימש לדמיין אקטין פילמנטיות 19, ואילו הנוגדנים חד שבטי EA53 שיבוט עכבר נגד s-α-actinin שימש תווית Z-דיסקים ודיסקי intercalated. עוברים קבוע PFA. 0.2 מיקרומטר פרוסות אופטיות נאספו כערימת az () ערימת תרמילים z מראה כי הצביעה הייתה מפוזרת יותר ברקמה קבועה PFA מאשר בצמד-קפוא וחתכים אצטון קבועים (איורים 2-5) α-actinin זה.. (B ערימת תרמילי z) מראה שני אקטין ופילמנטיות s-α-actinin. הקרינה פילמנטיות אקטין המקומית בין Z-דיסקים בתוך myofibrils (ראשי חץ). הקרינה אקטין פילמנטיות הייתה לראות גם בתאים המרפדים את endocardial myocytes trabecular (חיצים). (ג) תצוגה תלת-ממדית של cardiomyocytes trabecular, כפי שנצפה מהחלק העליון של המחסנית. תצוגת תלת-ממדית של (D)cardiomyocytes trabecular, כפי שנצפה מתחתית הערימה. טווח תצוגת היסטוגרמה עוצמה 470-900 (מתוך 0-65,535 אפשריים) עבור שני ערוצי לייזר 488 ננומטר ולערוץ לייזר 561 nm בA ו- B; טווח תצוגה 460-800 לשני הערוצים בC ו- D Scale בר 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie1.mov">סרט</a> 1. 360 מעלות סיבוב תצוגת 3D של s- α -actinin וארגון אקטין בשריר לב trabecular ביום עוברי 12.5. ערימת התמונה מהאיור 6 ניתן בשלושה ממדים באמצעות תמונת תוסף J 3D Viewer בתכנית ניתוח תמונת פיג&#39;י. טווח תצוגת היסטוגרמה עוצמה 470-800 (מתוך 0-65,535 אפשריים) עבור שני ערוצי 488 ננומטר וליזר 561 ננומטר. &lt;/ P&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/Movie2.mov">סרט</a> 2. צפיות נבחרות 3D של s- α ארגון -actinin ויקטין בשריר לב trabecular ביום עוברי 12.5. ערימת התמונה מהאיור 6 ניתן בשלושה ממדים באמצעות תמונת תוסף J 3D Viewer בתכנית ניתוח תמונת פיג&#39;י. סיבובים קטנים מסביב לx, y, z וגרזנים הראו מיושרים יחסית myofibrils בתוך cardiomyocytes אבל יישור לקוי בין רוב cardiomyocytes. סיבובים קטנים גם הפגינו ההערכה הקרובה של תאי endocardial חסרי s-α-actinin סביב cardiomyocytes. היסטוגרמה עצמת טווח תצוגה 470-800 (מתוך 0-65,535 אפשריים) עבור שני nm 488 וערוצי 561 ננומטר לייזר.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

analysis-cardiomyocyte-development-using-immunofluorescence-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.0K Views.  Northwestern University. Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Video: Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes for CHD are still poorly understood. The developing mouse constitutes a valuable model for the study of CHD, because cardiac developmental programs between mice and humans are highly conserved. The protocol describes in detail how to produce mouse embryos of the desired gestational stage, methods to isolate and preserve the heart for downstream processing, quantitative methods to identify common types of CHD by histology (e.g., ventricular septal defects, atrial septal defects, patent ductus arteriosus), and quantitative histomorphometry methods to measure common muscular compaction phenotypes. These methods articulate all the steps involved in sample preparation, collection, and analysis, allowing scientists to correctly and reproducibly measure CHD.

In this protocol, we describe procedures to qualitatively and quantitatively analyze developmental phenotypes in mice associated with congenital heart defects.

ניתוח של פגמים לב מולדים בעוברי עכבר באמצעות שיטות היסטולוגית איכותית וכמותית

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...