العقدة و لوحة notochordal هي المنظمين الأساسية أثناء تطوير الجنينية الماوس. اليوم، سوف نصف اثنين من التقنيات المستخدمة من قبل علماء الأحياء التنموية لتصور ودراسة هذه الهياكل. في البروتوكول الأول، سوف نبين كيفية إجراء المسح المجهري الكهربائي، SEM وفي الثانية، كل من المناعة جبل.
العقدة وألواح نوتوكودال موجودة بشكل عابر على سطح الجنين في يوم الجنين E7.75 ، يتم إسقاط الأهداب الصغيرة للتأكيد إلى الخارج ، والتي تسمح بتحديدها وتصورها من قبل SEM. وفي كلا البروتوكولين، سنظهر خطوات حاسمة في التعامل مع أجنة الماوس الصغيرة نسبياً ونركز على كيفية نقلها وتوجيهها. للبدء، افتح بطن فأرة حامل القتل الرحيم من خلال الجلد والميناتاريا.
باستخدام مقص والملقط غرامة، وإزالة الرحم. شطف الرحم لفترة وجيزة في الماء المقطر ووضعها في طبق بتري صغير يحتوي على PBS. ثم، استخدام المجهر تشريح والملباب غرامة لإزالة عضلات الرحم لتحرير decidui الفردية.
تحت المجهر تشريح، عقد كل decidua مع زوج من ملقط واستخدام زوج آخر لجعل طولي، شق سمك كامل بين الجزء الأحمر والجزء الأبيض. جعل الثقوب السطحية عموديا على طول الجزء الأبيض من decidua، المتاخمة مع شق. ثم، سحب decidua بعيدا أفقيا إلى نصفين وإزالة بعناية الجنين من الجزء الأبيض من decidua.
بعد ذلك، نقل الأجنة إلى طبق بتري جديد يحتوي على برنامج تلفزيوني مصفى معقمة. إزالة غشاء Reichert من كل جنين، بدءا من مخروط ectoplacental. بالنسبة لgenotyping في المستقبل، وإزالة قطعة صغيرة من كيس صفار.
تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية، ونقل الأجنة إلى أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على درجة EM fixitive تتألف من 2.5٪ glutaraldehyde وBBS معقم المصفاة. بعد ذلك ، قم بإزالة التثبيت من الأنبوب دون إزعاج الأجنة. اغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني معقمة تمت تصفيته لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
يجفف الأجنة في سلسلة الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل من هذه الدقائق، وذلك باستخدام 50٪70٪ و 85٪ الإيثانول المخفف في برنامج تلفزيوني. غسل ثلاث مرات في الإيثانول 100٪. تخزين الأجنة في الإيثانول 100٪ في 20 درجة مئوية، أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.
بعد ذلك، نقل embroyos إلى وعاء مناسب وإزالة أي السائل المتبقية. إضافة HMDS والإيثانول بنسبة واحد إلى واحد إلى الأجنة لمدة 30 دقيقة. ثم، إزالة السائل وإضافة HMDS نقية لمدة 30 دقيقة.
إزالة السائل من الأجنة مع ماصة والسماح لهم لتجف لمدة 30 دقيقة. استخدام فرشاة صغيرة وشريط من جانبين مزدوج لتركيب الأجنة المجففة على كعب SEM، مع الجانبين البطني. أدخل كعب في آلة طلاء البصق لطلاء الجسيمات الذهبية.
واحدة من الخطوات الأكثر حساسية في الجسيمات SEM هو تركيب الأجنة في الاتجاه الصحيح على كعب. بمجرد أن يهبط الجنين على الشريط، لا يمكن تغيير الاتجاه بعد الآن. بعد ذلك، ضع كعب المعاطف المغلفة في مجهر SEM، وتطبيق فراغ، ومراقبة العقد الجنينية وخلايا الصفائح غير الحمراء مع أهداب.
بعد إزالة الأجنة في E7.75، ووضعها في برنامج تلفزيوني توين في طبق بتري على الجليد. تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي، نقل الأجنة إلى أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على حل التثبيت. بعد ذلك ، قم بإزالة المثبت من الأنبوب ، مع الحرص على عدم لمس الأجنة.
ثم، غسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر nutating. إزالة آخر غسل من الأجنة وإضافة محلول حجب يحتوي على برنامج تلفزيوني تريتون، مع 10٪ من حرارة المصل المعطل. منع الأجنة لمدة ساعتين على الأقل على nutator في أربع درجات مئوية.
بعد ذلك، قم بإزالة الحجب وإضافة ما يقرب من ملليلتر واحد من الأجسام المضادة الأولية المخففة في حل الحظر. احتضان الأجنة بين عشية وضحاها على nutator في أربع درجات مئوية. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي واحفظه للاستخدام في وقت لاحق.
ثم، شطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني تريتون مرتين. واغسلها ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة على المُجنّة. استبدال غسل مع الجسم المضاد الاقتران فلوريسكين المخفف الثانوي ضد الأنواع المضيفة المضادة الأولية.
واحتضان بين عشية وضحاها على nutator في أربع درجات مئوية. ثم، إزالة الأجسام المضادة الثانوية وشطف الأجنة مع برنامج تلفزيوني تريتون مرتين. قبل الغسيل ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة مع برنامج تلفزيوني تريتون.
استبدال آخر غسل مع برنامج تلفزيوني تريتون التي تحتوي على phalloidin مخففة فلوريسكنس مخففة وDAPI المخفف وصمة عار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم، شطف الأجنة مرتين في برنامج تلفزيوني تريتون. واغسلها بـ"بي بي إس تريتون" لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة
بعد هذا، استبدال برنامج تلفزيوني تريتون مع برنامج تلفزيوني وترك الأجنة على الجليد. ثم إعداد الشرائح نظيفة، مشحونة بشكل إيجابي، وزلات الغطاء وجليسرول المائية القائمة على تصاعد وسائل الإعلام. ضع قطعتين من شريط واضح 15 ملليمترا وبصرف النظر عن بعضها البعض على الشريحة.
ثم، تحت المجهر تشريح، واستخدام ماصة P200 المعدلة لنقل الجنين إلى الشريحة. باستخدام ملقط غرامة، وجعل اثنين من التخفيضات الكاملة على الجانبين الجانبي من كيس صفار لتتكشف الجنين. ثم ضع الجنين مع الجانب البطني.
إضافة 50 ميكرولترات من تصاعد وسائل الإعلام إلى الجنين. ثم، إضافة داب من تصاعد وسائل الإعلام إلى زلة الغطاء. وضعه تمتد على قطعة اثنين من الشريط، وخفض ببطء على الأجنة باستخدام إبرة عازمة.
استخدم مسح ماصة لإزالة وسائط التركيب الزائدة، مع الحرص على عدم تحريك زلة الغطاء. ثم، استخدام كمية سخية من طلاء الأظافر لختم الجانبين من زلة الغطاء. وأخيراً، استخدم مجهرًا مُلَحٍ لمراقبة الأجنة.
من المهم عدم تحريك زلة الغطاء بعد تركيبها على الأجنة ، لأنها يمكن أن تشوهها للتصور ثلاثي الأبعاد. وباستخدام المجهر الإلكتروني المسحي، لوحظ تكوين العقدة في النوع البري وتجريد أجنة ماوس متحولة في E7.75. على عكس العقدة على شكل حفرة في النوع البري ، عرضت الأجنة المتحولة عقدة مسطّحة وطبقة العقدة المنتظمة.
كل الآن إلى immunofluorescence كان يستخدم لدراسة العقدة و نوتوشورديال عيوب تكوين الصفائح في قطاع 1 الأجنة المتحولة على المستوى الخلوي. وأظهرت البيانات أنها كانت غير طبيعية ومتوقفة في الأجنة المتحولة. العقدة والصحن العقدي هي فقط عابرة موجودة على سطح الجنين، وبالتالي توقيت ضروري لنجاح SEM.
على سبيل المثال، اثنين إلى أربعة أجنة somite جيدة لتحليل SEM عقدة ناضجة مع أهداب طويلة. الكواشف النقاء ضروري أيضا لنجاح هذه التقنيات، وخاصة في التحقيق في البنية الفائقة من قبل SEM. الشوائب الصغيرة التي تلتصق الجنين عادة ما يؤدي إلى التحف الضخمة.
ونحن نعتقد أن هذين التقنيات تعطي معلومات تكميلية عن هيكل العقدة والصحن العقدي خلال التطور الطبيعي وفي المسوخ التي تظهر عيوب في تشكيل هذه الهياكل.
