وأيد هذا العمل من قبل CBER / FDA-NIAID / NIH المشتركة بين الوكالات اتفاق YI-AI-6153-01، وصناديق جماعية FDA / CBER، ومبادرة المضادة الطبية FDA. TCT، MNB، VPM، LMS، وتم دعم KDK التي كتبها موعد لبرنامج المشاركة البحوث في مركز التقييم البيولوجي والأبحاث من قبل معهد أوك ريدج للتربية والعلوم تدار من خلال اتفاق بين الوكالات بين الأقسام الأدبية الطاقة في الولايات المتحدة والولايات المتحدة إدارة الغذاء والدواء.

<ol>
	<li>Yan, N., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+antiviral+immunity.">Intrinsic antiviral immunity.</a> Nature. 13, 214-222 (2012).</li><li>Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons,+interferon-like+cytokines,+and+their+receptors.">Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors.</a> Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).</li><li>Baum, A., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+type+I+interferon+by+RNA+viruses:+cellular+receptors+and+their+substrates.">Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates.</a> Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).</li><li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambdas+mediate+antiviral+protection+through+a+distinct+class+II+cytokine+receptor+complex.">IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex.</a> Nature. 4, 69-77 (2003).</li><li>Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+type+I+interferon+locus+and+identification+of+novel+genes.">Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes.</a> Genomics. 84, 331-345 (2004).</li><li>Cheon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFNbeta-dependent+increases+in+STAT1,+STAT2,+and+IRF9+mediate+resistance+to+viruses+and+DNA+damage.">IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage.</a> The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).</li><li>Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-stimulated+genes:+a+complex+web+of+host+defenses.">Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses.</a> Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).</li><li>Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+the+nuclear+factor-kappaB+pathway+and+the+innate+immune+response+by+viruses.">Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses.</a> Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).</li><li>Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+soluble+alpha/beta+interferon+(IFN)+receptor+binds+to+the+cell+surface+and+protects+cells+from+the+antiviral+effects+of+IFN.">The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN.</a> Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+type+I+and+type+III+interferons+by+a+secreted+glycoprotein+from+Yaba-like+disease+virus.">Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).</li><li>Bidwell, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+Irf7+pathways+in+breast+cancer+cells+promotes+bone+metastasis+through+immune+escape.">Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape.</a> Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).</li><li>Di Domizio, J., Cao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+autoimmunity:+type+I+interferon+in+autoimmune+diseases.">Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases.</a> Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).</li><li>Crow, Y. J., Casanova, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STING-Associated+Vasculopathy+with+Onset+in+Infancy+-+A+New+Interferonopathy.">STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy.</a> The New England journal of medicine. , (2014).</li><li>Bermel, R. A., Rudick, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-beta+treatment+for+multiple+sclerosis.">Interferon-beta treatment for multiple sclerosis.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).</li><li>Kingham, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+HBsAg-positive+chronic+active+hepatitis+with+human+fibroblast+interferon.">Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon.</a> Gut. 19, 91-94 (1978).</li><li>Heathcote, J., Main, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+hepatitis+C.">Treatment of hepatitis C.</a> Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).</li><li>Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-lambda+and+therapy+for+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection.</a> Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).</li><li>Castaigne, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+in+the+treatment+of+hairy+cell+leukemia.">Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia.</a> Cancer. 57, 1681-1684 (1986).</li><li>Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interferon-alpha+in+chronic+myeloid+leukemia.">Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia.</a> The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+alpha+on+NZM2328.Lc1R27:+Enhancing+autoimmunity+and+immune+complex-mediated+glomerulonephritis+without+end+stage+renal+failure.">Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure.</a> Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).</li><li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-alpha+Acts+on+the+S/G2/M+Phases+to+Induce+Apoptosis+in+the+G1+Phase+of+an+IFNAR2-Expressing+Hepatocellular+Carcinoma+Cell+Line.">Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line.</a> The Journal of biological chemistry. , (2014).</li><li>Xia, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+IFN-alpha-Producing+Plasmacytoid+Dendritic+Cells+(pDCs)+in+Human+Th1-Mediated+Type+1+Diabetes:+pDCs+Augment+Th1+Responses+through+IFN-alpha+Production.">Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production.</a> Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).</li><li>Hervas-Stubbs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+but+not+plasmacytoid+dendritic+cells+foster+the+systemic+virus-induced+type+I+IFN+response+needed+for+efficient+CD8+T+cell+priming.">Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming.</a> Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).</li><li>Manry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+genetic+dissection+of+human+interferons.">Evolutionary genetic dissection of human interferons.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).</li><li>Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+relatedness+among+the+type+I+interferons.">Diversity and relatedness among the type I interferons.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).</li><li>Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+genomic+data+in+the+discovery,+annotation+and+evolutionary+interpretation+of+the+interferon-lambda+family.">The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family.</a> PloS one. 4, e4933 (2009).</li><li>Hillyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiles+of+human+interferon-alpha+and+interferon-lambda+subtypes+are+ligand-+and+cell-dependent.">Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent.</a> Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).</li><li>Schramm, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+array+for+absolute+and+relative+quantification+of+rhesus+macaque+types+I,+II,+and+III+interferon+and+their+subtypes.">High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes.</a> Journal of interferon &amp; cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).</li><li>Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+beacons+of+xeno-nucleic+acid+for+detecting+nucleic+acid.">Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid.</a> Theranostics. 3, 395-408 (2013).</li><li>Little, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification-refractory+mutation+system+(ARMS)+analysis+of+point+mutations.">Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations.</a> Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).</li></ol>

VPM and RLR are co-inventors of the technology to measure expression of IFN- and IFN- subtypes and derive royalty income from it. The remaining authors declare no conflict of interest.

ويصف هذا التقرير التصميم والإنتاج دفعة، وهذا النهج نحو تحليل لفحص لقياس النسخ من مجموعة من الجينات مماثلة إلى حد كبير في إعداد مختبر الأبحاث. الفحص QRT-PCR عالية الإنتاجية ذكرت هنا يقيس IFN- و- فرعية λ مع خصوصية عالية. يتضمن هذا الأسلوب جانبين رئيسيين، وتصميم مجموعات العلاقات العامة / الرصاص التي تميز بين أفراد من عائلة الجينات المتماثلة وتطوير منصة الإنتاج لخلق لوحات فحص 384 جيدا موثوقة ومتسقة مسبقة مع مجموعات العلاقات العامة / الرصاص. تحقيقات QRT-PCR تشتمل على (MB) أو كيميائية (LNA) النهج الهيكلي نحو تعزيز خصوصيتها 29. لاثنين من مجموعات التمهيدي في مقايسة هندي صغير (الجدول 2)، وقد أدرج النظام الطفرة التضخيم صهر (ARMS) في تسلسل التمهيدي لمواصلة تعزيز خصوصية 30. في حين كان من عادة أفضل لاستهداف تقاطعات اكسون-اكسون لenhaالامتحانات التنافسية الوطنية خصوصية رد فعل QRT-PCR، وكان هذا غير ممكن لأن النوع الأول الإنترفيرون الجينات تفتقر الإنترونات. لذلك، سوف تتضخم الحمض النووي الجيني في رد فعل PCR، ويجب أن تدهورت بفعل العلاج الدناز بعد استخراج الحمض النووي الريبي. كان مقتصرا على المنطقة المستهدفة لمجموعات العلاقات العامة / الرصاص إلى المناطق الترميز من الببتيد ناضجة لكل IFN. بسبب تشابه تسلسل عالية بين الأنواع الفرعية-α IFN، وخاصة في المنطقة الببتيد ناضجة، كان من الضروري في بعض الأحيان للتنازل حساسية لضمان خصوصية. كان هذا هو الحال بصفة خاصة مع IFN-α17، حيث الببتيد نسخة ناضجة لديها سوى أربعة قواعد فريدة بالمقارنة ضد أخرى فرعية IFN-α. استهداف IFN-α17 المطلوبة الاشعال التي تربط بين نصوص فرعية متعددة، وتقييد خصوصية إلى التحقيق. ونتيجة لذلك، فإن رد فعل PCR تضخيم أنواع فرعية أخرى من الإنترفيرون α17، وبالتالي تستهلك نسبة كبيرة من الكواشف PCR وloweriنانوغرام اتساع إشارة مضان من التحقيق محدد لIFN-α17. تحديا إضافيا نحو تصميم مجموعات العلاقات العامة / الرصاص حساسة ومحددة لجينات مشابهة إلى حد كبير مثل IFN هو إمكانية أن تسلسل المشروح في قاعدة بيانات بنك الجينات قد لا تكون كاملة أو شاملة في وقت التصميم. مرة أخرى، كان هذا تحديا لIFN-α17، التي متواليات المشروح حديثا لا تتفق تماما مع إصدار تسلسل في قاعدة البيانات في وقت التصميم. لذلك، عند تصميم العلاقات العامة / الرصاص يحدد الجينات التي لم يتم دراستها بشكل مكثف، فإنه من الحكمة أن تحقق بشكل دوري على أحدث تسلسل المشروح من الجين المستهدف. وأخيرا، لا بد من التأكد من أن مجموعات العلاقات العامة / الرصاص لا تضخيم الكاذبة التي يمكن نسخها ولكن لا تترجم. بعد تصميم مجموعات العلاقات العامة / الرصاص، فإن التحدي التالي هو الأمثل الظروف PCR من سبعة عشر مختلف العلاقات العامة / الرصاص يضع على واحد لوحة 384 جيدا. المعايير هي نسخة المجمدةتانت في اختبار خصوصية مجموعة العلاقات العامة / الرصاص وتصبح ضرورية لمواءمة الظروف QRT-PCR العديد من ردود الفعل PCR مختلفة. اختبار مجموعة العلاقات العامة / الرصاص ضد معايير النص يؤسس كفاءتها وحساسية. البلازميدات التي تعبر عن الكاذبة مماثلة للغاية قد تكون ضرورية لضمان أن العلاقات العامة / الرصاص ضبط يقيس بشكل انتقائي نسخ من الجين وظيفية. كما توفر معايير النص وسيلة الكمية للتحليل (عدد النصوص)، بالإضافة إلى تحليل نسبة شبه الكمية لجين التدبير المنزلي (ΔCq). الروبوتية pipetting لمتعددة من لوحة مصدر 96-جيدا الى عدة 384-جيدا لوحات فحص يحسن من دقة واتساق النتائج المشترك بين لوحة. ويستخدم الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية (SSDNA) باعتبارها الناقل أن تستقر ويحافظ على مجموعات العلاقات العامة / الرصاص للتخزين على المدى الطويل، وكذلك تجفيف الكواشف الاستغناء في لوحات. تجفيف لوحات أيضا يقلل من حجم رد الفعلالضرورة من أجل تحقيق النتائج استنساخه، والذي بدوره يحافظ على عينات الثمينة ويقلل من استخدام الكواشف مكلفة. من خلال هذه الخطوات، يتم تجميع دفعات من لوحات التي توفر الدقة والاتساق لأكثر من ستة أشهر. وبعد إعداد لوحة، وتدابير مراقبة الجودة حاسمة للتحقق من اتساق مجموعة من لوحات. لهذا الغرض، يتم تشغيل على أربع مجموعات إضافية من المعايير على طبق من ذهب. لوحة &quot;المعيار 5X&quot; مسارات الأداء ويخلق مجموعة من البيانات التي تتم مقارنة معايير لوحة الفرد. في حين تستخدم عشرة التخفيفات 10 أضعاف من كل معيار خلال تصميم الفحص، تتطلب اعتبارات المساحة التي أربع نقاط وتستخدم لمنحنى قياسي على كل لوحة الفحص، وبالنسبة للوحة القياسية 5X. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تدرج تحكم إيجابية على كل لوحة لضمان صحة اللوحة. عادة، فإنه يأخذ 3-4 ساعة لإعداد ست لوحات فحص من أحد العلاقات العامة / الرصاص الصورةلوحة ource. فمن الممكن لإعداد اثني عشر لوحات في يوم واحد في مختبر الأبحاث. لأن كل لوحة IFN النوع الفرعي فحص الإنسان تدرس سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويمكن أن تستوعب خمسة عشر العينات التجريبية، يوم واحد من التجمع تنتج مجموعة من لوحات لديها القدرة على توليد ما يصل إلى 3،060 نقاط البيانات التجريبية. يمكن معالجة البيانات الخام من منصة QRT-PCR وتجميعها باستخدام البرامج النصية البرمجة في برنامج تطبيق جدول لملء قالب تحليل المصممة مسبقا تلقائيا. هذا الأسلوب يقلل التدريب العملي على إدخال البيانات، وبالتالي منع أخطاء النسخ ويسمح للمحقق للتركيز على تحليل البيانات بدلا من تجميع البيانات. كما هو موضح هنا، وهذا QRT-PCR فحص عالية الإنتاجية يمكن تطبيقها لقياس التعبير عن الأنواع الفرعية فيروسات في عينات المكاك البشري أو هندي صغير ويمكن أن تتكيف مع استخدام لأنواع أخرى أو مجموعات الجينات المتماثلة. المرونة في تخطيط لوحة تسمح للمستخدم لتغيير التمهيدي / مسبار يحدد لتكييف جيناتالفائدة نحو نوع من الخلايا معين أو نظام نموذجي. هذا الاختبار يمكن تطبيقها لقياس IFN التوقيعات التعبير في نماذج ثقافة الخلية دراسة مسببات الأمراض أو في عينات من المرضى في سياق نماذج المرض لتوضيح آليات إشارات تشارك في الاستجابة المناعية.

أنواع الأول والثالث إنترفيرون (IFN) هي الحاسمة في الاستجابة المناعية للفيروسات والمحفزات الأخرى المسببة للأمراض والحاضر في جميع الفقاريات 1. الخلايا المناعية وغير المناعية تعبر عن وتفرز، فضلا عن الاستجابة ل، IFN 2. أجهزة الاستشعار المناعية الفطرية، مثل مستقبلات تول مثل (TLR)، STING، وRIG-I، لحث النوع الأول والثالث IFN التعبير عند الكشف عن العوامل المسببة للأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMP) 3،4. في البشر، النوع الأول الإنترفيرون تشمل IFN-β، -ω، -κ، و 12 أنواع فرعية من IFN-α، وربط لمستقبلات IFNAR1 / IFNAR2 معقدة 2،5. النوع الثالث IFN تشمل IFN-λ1، -λ2، و-λ3 وربط مجمع مستقبلات IL10RB / IL28RA 2. كلاسيكيا، وأنواع الأول والثالث IFN ربط إلى المجمعات مستقبلات منها والتي ثم تجنيد STAT1 / heterodimers STAT2 وبدء النسخ من الإنترفيرون حفز الجينات (ISG) 6. وتشارك ISG في مجموعة متنوعة من الوظائف، من فيروسات ومضادةالنشاط التكاثري لتفعيل الاستجابة المناعية التكيفية 7. آليات عديدة تطورت مسببات الأمراض للتهرب، تخريب، وخطف عناصر من مسار IFN إشارات تدل على أهمية IFN في الاستجابة المناعية الفطرية 8. على سبيل المثال، فيروس اللقاحية يعبر عن مستقبلات شرك مع IFNAR1 التماثل أن تعزل اكتب I الإنترفيرون 9 في حين أن فيروس المرض يابا مثل يفرز بروتين سكري الذي يمنع اكتب الأول والثالث IFN البروتينات 10. بالإضافة إلى دورها في الدفاع المضيف، وتورط IFN أيضا في مراقبة السرطان وعدد من الأمراض الالتهابية السيارات: إسكات التعبير IFN في خلايا سرطان الثدي يقيد الترصد المناعي 11، الإفراط في IFN-α هو آلية في تطوير النظامية الذئبة الحمامية 12، وتفعيل المخطئين من STING يؤدي إلى التهاب النظامية الناجمة عن كميات مفرطة من IFN في المصاحب STING اعتلال وعائيوتستخدم 13. العلاجي، IFN لعلاج التصلب المتعدد 14، والالتهابات الفيروسية المزمنة مثل HBV 15 و HCV 16،17، والسرطانات مثل اللوكيميا خلية شعر 18 و ابيضاض الدم النقوي المزمن (19). أسئلة حول أهمية IFN في عملية فسيولوجية معينة تكشف باستمرار طبيعة في كل مكان من هذه العائلة خلوى. اكتب I IFN، وخاصة الأنواع الفرعية-α IFN، وغالبا ما تعتبر واحدة كيان 20-23، بدلا من أن تكون مجموعة من يرتبط ارتباطا وثيقا، ولكن متميزة، والبروتينات. وجود واستمرار الأنواع IFN متعددة بما في ذلك الأنواع الفرعية IFN-α، في جميع أنحاء تطور الفقاريات 24 تشير إلى أن ما لا يقل عن مجموعة فرعية من هذه الأنواع الفرعية لها وظائف محددة أو فريدة من نوعها. ومن الممكن أن أنماط المميزة لIFN التعبير وفك وتساعد على توصيف وظائف محددة من واحد أو أكثر من أنواع فرعية 17. التحدي المتمثل في دراسة ركان النوع الأول والثالث IFN فرعية تقوم على هوية مشتركة تسلسل منهم: اثني عشر فرعية IFN-α تشترك&gt; 50٪ 25 و الأنواع الفرعية-IFN λ حصة 81-96٪ 26 من سلاسل من الأحماض الأمينية الخاصة بهم. في وصف QRT-PCR الفحص، منارة الجزيئية (MB) والحمض النووي مؤمن (LNA) تحقيقات الفلورسنت تميز الاختلافات زوج قاعدة واحدة بين مماثلة إلى حد كبير تسلسل IFN النوع الفرعي وتسمح لتوصيف التوقيع IFN التعبير. ويشمل 384 جيدا شكل لوحة الفحص على حد سواء الكمية (معايير النص) وشبه الكمية (الجينات التدبير المنزلي (HKG)) تدابير، والسماح لتحليلها من قبل عدد نسخ النص وΔCq على التوالي. التجمع دفعة، سهلت الآلي pipetting لمتعددة القنوات، والتخزين على المدى الطويل، ممكن من خلال تجفيف التمهيدي / مسبار (العلاقات العامة / الرصاص) يضع على لوحات، وتعزيز استنساخ، والمرافق، والتطبيق العملي للمقايسة. يصف هذا البروتوكول عمليةلإعداد لوحات 384 جيدا QRT-PCR فحص (الشكل 1) مع ما يصل الى سبعة عشر مجموعات مختلفة العلاقات العامة / الرصاص استهداف فرعية IFN الإنسان (الجدول 1). ضبط العلاقات العامة / الرصاص العمل وتستخدم لوحات مصدر الأوراق المالية (الشكل 2) لإعداد متعددة 384 جيدا لوحات الفحص في عملية يمكن أن يكون آليا باستخدام متعددة القنوات pipettor الروبوتية. في حين كان التركيز في البداية على خلق بروتوكول لدراسة IFN التوقيعات التعبير الإنسان، وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لقرود المكاك ريسوس كذلك. على الرغم من أن تخطيطات لوحة مختلفة قليلا ومجموعات العلاقات العامة / الرصاص (الجدول 2) ومتميز، وطريقة إعداد الكلي لخلق لوحات البشرية والقرد هو متطابقة. مع تعديلات طفيفة على البروتوكول، يمكن تنفيذ طريقة للسماح لتطوير المقايسات لدراسة مجموعات أخرى من الجينات ترتبط ارتباطا وثيقا. انظر الشكلين 1 و 2 أدناه انظر الجدولين 1 و 2 بيلآه

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1824">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;"></td>
			<td style="width:668px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:531px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2mL PCR Tube Strips&#160;</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>E0030 124 286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-139</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-137</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel Electronic Pipette, 5-250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td style="width:141px;">14-387-118</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile</td>
			<td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td>
			<td>229446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-115</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td>
			<td>89094-668</td>
			<td>25mL reservoirs with 2 dividers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-Centrifuge</td>
			<td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td>
			<td>1090003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eukaryotic 18S rRNA (18S)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixed Speed Mini Vortexer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gas Permeable Adhesive Plate Seal</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td>Disposable plate seal used during the plate preparation process&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Rh02621745_g1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hudson Solo automated multichannel pipettor&#160;</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800200</td>
			<td>Modified with a 384-well cooling nest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Linearized plasmids (IFN genes)</td>
			<td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 3000, 3580; used for assay standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA inhibitors</td>
			<td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 500100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA Probes</td>
			<td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Material number VC00023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsoft Excel 2010 Spreadsheet</td>
			<td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&#160;</td>
			<td>Office 2010</td>
			<td>Visual Basic programming language&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate Vortex Mixer</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>5353 000.014</td>
			<td>2 dimensional plate vortex apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Beacon Probes</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Dryer (manifold)</td>
			<td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primer sets</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC57 plasmid DNA</td>
			<td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>SD1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase H</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td>
			<td>M0297L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800350-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SoftLinx Version V</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Software for programming pipetting steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ABgene Adhesive Plate Seals&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Ubiquitin C (UBC)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs01871556_s1</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Verso cDNA synthesis Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-Ultra Pure</td>
			<td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td>
			<td>351-029-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zipvap 384 (plate dryer heating element)</td>
			<td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td>
			<td>384-109A</td>
			<td>Plate Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative real-time rt-pcr assay for determining expression profiles of types i and iii interferon subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

وصف فحص QRT-PCR يمكن تنفيذها لتحليل أنماط التعبير من أنواع الأول والثالث IFN في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا والسياقات. على سبيل المثال، تم تحليل نوع I بشر والثالث IFN التوقيعات التعبير في خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) من حفزت 6 المانحين مع يغاندس TLR. بولي I: C (25 ميكروغرام / مل)، LPS (10 نانوغرام / مل)، إميكويمود (10 ميكرون)، و[أليغنوكليوتيد الدليل السياسي الشامل (1 ميكرومتر) (الشكل 4). وقد تم تحليل البيانات باستخدام برنامج تطبيق جداول البيانات وعرضها كما الخرائط الرادارية مع الأنواع الفرعية IFN-α رتبت في اتجاه عقارب الساعة وفقا لشجرة النشوء والتطور من تسلسل البروتين 27. يتم عرض الرسوم البيانية رادار التعبير IFN البشري في نطاق وسجل حسابها باستخدام طريقتين مختلفة من التحليل دمجها في تصميم فحص: القيمة المطلقة CQ تطبيع لHKG (ΔCq)، ونسخ عدد من القالب في ميكروغرام (ميكروغرام) من إجمالي RNA . يتم حساب القيم في عدد النسخ من نتائج س<html> منحنى اتحاد كرة القدم نسخة القياسية. تظهر البيانات أن التوقيعات التعبير IFN الإنسان التي تسببها منبهات TLR محددة يجند. انظر الشكل 4 أدناه كما تبين للتوقيعات IFN التعبير الإنسان، الأول والثالث IFN في قرود المكاك ريسوس كنا التوقيعات التعبير من أنواع أيضا TLR يجند محدد. وقد حفز PBMC من 3 المانحين مع بولي I: C (50 ميكروغرام / مل)، LPS (10 ميكروغرام / مل)، وإميكويمود (10 ميكروغرام / مل) لمدة 3 ساعة (الشكل 5). كان IFN النوع الفرعي التعبير في الخلايا unstimulated في الأساس منخفضة. وأعرب عن عدد محدود من IFN- فرعية ردا على LPS وبولي I: C. في المقابل، كان IFN التعبير ردا على إميكويمود عالية وكان التعبير النوع الفرعي واسع. تم تعزيز التعبير عن الإنترفيرون β وIFN-λ1 من قبل جميع TLR ثلاثة منبهات 28. انظر الشكل 5 أدناه دائما &quot;&gt; <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> الشكل 1: تخطيط لوحة 384 جيدا الفحص مع سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص الهدف رقم يشير إلى مجموعة العلاقات العامة / الرصاص. يتم إضافة منحنيات القياسية أربع نقاط (المثلث الرمادي الداكن) إلى الأعمدة 1-5. يتم إضافة مجموعات HKG العلاقات العامة / الرصاص (خلفية بيضاء) إلى أعمدة 6 و 7. الأعمدة المتبقية، 8-24، هي محددة لواحدة من سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص. يتم إضافة عينات لصفوف AP، من أعمدة 6-24 (الأسهم السوداء). وبئرين (O5، P5) في الجزء السفلي من العمود 5 تتلقى الماء فقط ومزيج الرئيسي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> الشكل 2: تخطيط لوحة مصدر 96-جيدا مع سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويشير العدد المستهدف إلى العلاقات العامة / الرصاصتعيين. السهام السوداء تمثل عند إضافة مجموعة العلاقات العامة / الرصاص إلى الآبار متعددة. تضاف يمزج المجلس الوطني الانتقالي إلى الآبار المعينة (خلفية رمادية داكنة). وبئرين (F3، G3) مع الخطوط القطرية غير المستخدمة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> الشكل 3: تخطيطي من الخطوات المحددة في البروتوكول فحص QRT-PCR AE الرسم البياني اختيار أجزاء من البروتوكول. (A) الخطوة 1: إعداد التخفيفات التسلسلية القياسية. (ب) الخطوة 2: إعداد العلاقات العامة / الرصاص وNTC يمزج الأسهم العمل. (C) الخطوة 3.1: إعداد الأسهم لوحة العمل 96-جيدا من مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويمزج المجلس الوطني الانتقالي. (D) الخطوة 4،1-3: إعداد يمزج لتحميل لوحة فحص 384 أيضا. (Estالجيش الشعبي 4.5: تحميل لوحة فحص 384 أيضا. وقراءة الرسوم البيانية من أعلى اليسار إلى أسفل الزاوية اليمنى. يتم تخزين الكواشف لفيروسات (IFN) فحص في -20 درجة مئوية ومدرجة في العمود الأيسر. خطوط إجراءات منفصلة في البروتوكول. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> يختلف توقيع IFN التعبير البشري في خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) ردا على بروابط TLR تستخدم لتحفيز PBMC وحفز مع يغاندس TLR وكان حصادها RNA لتحليل QRT-PCR: الشكل 4. وسائل هندسية الردود الذروة إلى بولي I: C (25 ميكروغرام / مل) في 8 ساعة (المربعات الحمراء)، LPS (10 نانوغرام / مل) في 4 ساعة (مثلثات خضراء)، إميكويمود (10 ميكرومتر) في 16 ساعة ( الماس الأرجواني)، الدليل السياسي الشامل (1 ميكرومتر) فيوترد 16 ساعة (الدوائر السوداء)، والسيطرة unstimulated في 16 ساعة (الدوائر الزرقاء) في الفترة من 6 المانحين في سجل 10 الحجم بوصفها وظيفة من التعبير عن HKG UBC ΔCq (يسار) أو رقم نسخة لكل ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (يمين) . يتم ترتيب الأنواع الفرعية IFN-α فقا لمؤامرة النشوء والتطور من الأحماض الأمينية تسلسل التشابه. وقد نشر هذا الرقم في الأصل في علم المناعة وعلم الأحياء الخلوي 27. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> الشكل 5: يختلف المكاك ريسوس IFN توقيع التعبير في خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) ردا على بروابط TLR تستخدم لتحفيز PBMC من ثلاثة قرود المكاك ريسوس (المعين من قبل مربع، والماس، والمثلث) تم عزل من الدم الكامل و حفز مع lipopolysaccharide في (LPS) (10 ميكروغرام / مل)، وبولي I: C (50 ميكروغرام / مل) أو إميكويمود (10 ميكروغرام / مل). تم حصاد الخلايا في 0 ساعة (مكتب مستشار رئيس الوزراءن الأشكال) أو بعد 3 ساعات من التحفيز TLR (الأشكال المغلقة) لقياس IFN التعبير. يتم عرض مستويات النص من النوع I، II، III وIFN في سجل 10 الحجم بوصفها وظيفة من التعبير عن HKG GAPDH ΔCq (يسار) أو نسخة رقم / ميكروغرام RNA (يمين). وقد نشر هذا الرقم أصلا في مجلة الانترفيرون وخلوى بحوث 28. <img alt="الجدول 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> الجدول 1: IFN البشري التمهيدي / مسبار مجموعة سلاسل ورد فعل من المعلومات <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.</a> <img alt="الجدول 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> الجدول 2: مكاك ريسوسي IFN التمهيدي / مسبار مجموعة سلاسل ورد فعل من المعلومات <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> تركيز البلازميد (FM) </td></tr><tr><td></td><td> A </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0.025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> الجدول 3: المعلومات تركيز مجموعة التخفيف القياسية. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> مجموعات IFN العلاقات العامة / الرصاص وأضافت </td><td> حجم الماء المضاف (مل) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β، -ω، -λ3 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1، -α5 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6، -α8، -α10 </td><td> 85.7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14، -α16 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21، -λ1 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114.3 </td></tr></tbody></table> الجدول 4: NTC الأسهم العمل يمزج المعلومات.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes at JoVE.com

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

high-throughput-quantitative-real-time-rt-pcr-assay-for-determining

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Views.  US Food and Drug Administration. This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible. 

Video: High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي، اختبار مزدوج قراءات من بين الخلايا مضادات الميكروبات آخر وحقيقية النواة السمية لخلايا

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

حبة على أساس مقايسة متعدد لتحليل الملامح سيتوكين المسيل للدموع

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification of lymphocyte subtypes is important for the study of immunology as well as diagnosis and treatment of various diseases. Currently, standard methods for classifying lymphocyte types rely on labeling specific membrane proteins via antigen-antibody reactions. However, these labeling techniques carry the potential risks of altering cellular functions. The protocol described here overcomes these challenges by exploiting intrinsic optical contrasts measured by 3D quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurement of 3D refractive index (RI) tomograms of lymphocytes provides quantitative information about 3D morphology and phenotypes of individual cells. The biophysical parameters extracted from the measured 3D RI tomograms are then quantitatively analyzed with a machine learning algorithm, enabling label-free identification of lymphocyte types at a single-cell level. We measure the 3D RI tomograms of B, CD4+ T, and CD8+ T lymphocytes and identified their cell types with over 80% accuracy. In this protocol, we describe the detailed steps for lymphocyte isolation, 3D quantitative phase imaging, and machine learning for identifying lymphocyte types.

We describe a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurements of 3D refractive index tomograms of lymphocytes present 3D morphological and biochemical information for individual cells, which is then analyzed with a machine-learning algorithm for identification of cell types.

تحديد أنواع فرعية اللمفاويات باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد الكمية المرحلة خالية من التسمية وآله التعلم

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

Pan-lyssavirus في الوقت الحقيقي RT-PCR لتشخيص داء الكلب

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

اختبارات الثقافة المشتركة عاليه الانتاجيه للتحقيق في التفاعلات الميكروبية

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

تحليل النسخ عالي الإنتاجية للتحقيق في التفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...