وقد تم تمويل هذه الدراسات، في جزء منه، من المنح المقدمة من مؤسسة البديل بحوث والتنمية (107588)، والمعهد الوطني للصحة (1U54CA136465-04S1)، وبرنامج بحوث سرطان الثدي كاليفورنيا (201B-0141). نشكر الدكاترة. أندرو ويلبر وR. سكوت ماكيفور للتبرع السخي من هم <pkt2 lubig=""> transponson وPK / hUbiC-SB11 البلازميدات ترانسبوزاز. ونحن نعترف بامتنان جون Tamaresis، دكتوراه للحصول على المشورة على الأساليب الإحصائية، تيموثي براون لأداء التدفق الخلوي، جورجيت هنريك لتقديم المشورة بشأن الهجرات المقايسات، ونانسي Bellagamba لتسهيل جمع العينات THR. </pkt2>

تم جمع رؤساء الفخذ من المرضى الذين يخضعون لجراحة THR الاختيارية في قسم جراحة العظام في كلية الطب بجامعة ستانفورد. تم جمع جميع الأنسجة كما العينات التي تم تحديدها دي وفقا للوائح مكتب الالتزام بحوث جامعة ستانفورد. 1. اختيار الخط سرطان الثدي خلية (ق) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على أو بالنقل خط خلايا سرطان الثدي المطلوب (ق) مع luciferase المراسل-GFP مراسل بناء. وأجريت التجارب التالية باستخدام MDA-MB-231 وMCF-7 سرطان الثدي خطوط الخلايا المهندسة للتعبير مستقر من يراعة luciferase (fLuc) وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) من خلال ترنسفكأيشن مع الجمال النائم ينقول بلازميد pKT2 / LuBiG وPK ترانسبوزاز بلازميد / hUbiC-SB11 45،46. ملاحظة: يتم أشار خطوط الخلايا transfected باسم MDA-MB-231-fLuc-EGFP، وMCF-7-fLuc-EGFP. </li></ol> 2. عزل الأنسجة Fragments من رؤساء الفخذ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الجراحة THR، وجمع رأس الفخذ التخلص منها في حاوية معقمة مليئة المالحة الفسيولوجية. نقل العينة إلى المختبر ومعالجته ضمن 1-3 ساعة من الجراحة. ملاحظة: إذا كان هناك تأخير في المعالجة، ووضع العينة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منطقة العمل عن طريق وضع العناصر التالية على حصيرة ماصة في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة: قفازات معقمة، مقراض جراحي، ملقط، دورق مع 70٪ الأيزوبروبانول لشطف الأدوات، والسفن زراعة الأنسجة كما هو منصوص عليه أدناه لكل نوع من التجربة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يرتدي القفازات الجراحية المعقمة لعقد رئيس عظم الفخذ المستديرة في يد واحدة، استخدم مقراض في جهة أخرى لاستخراج شظايا العظام التربيقية من الحجم المطلوب (~ 2-5 ملم) من رمح العلوي المكشوفة من عظم الفخذ. نقل شظايا العظام في سفينة الثقافة (على سبيل المثال، 6-، 12-، أو 24 بئرا لوحة زراعة الأنسجة أو غرفة الهجرة)، وهذا يتوقف على نوع من الانتشار النووي، العقيدonization أو الهجرة التجربة، كما هو موضح في الخطوات من 3 أو 4 أو 5. ملاحظة: شظايا العظام الأنسجة يجب أن تحصد كما هو موضح أعلاه بعد إكمال الخطوات الأولية لكل انتشار والاستعمار أو الهجرة فحص معين. سوف شظايا تتراوح في حجمها كما هو مبين في الشكل (2). شظايا يمكن أن يكون وزنه قبل أو بعد عدة تجارب لغرض توحيد. </li></ol> 3. زراعة المشارك خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام لقياس الثدي انتشار الخلية باستخدام BLI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التجربة، وإعداد تعليق يحتوي على 2 × 10 5 خلايا سرطان الثدي / 50 ميكرولتر، وإعداد شمعات من الشمع العظام لشل حركة شظايا العظام في الثقافة. قطع رأس P200 micropipette في 3 قطع واستخدام نهاية الضيقة من أكبر قطعة في &quot;قطع الكعكة&quot; بطريقة لقطع صغيرة (~ 35 ملغ) قطعة من الشمع العظام. استخدام نهاية واسعة من أصغر قطعة لإخراج المقابس الشمع العظام في طبق بتريللتخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة من الشمع العظام في موقف 12:00 من كل بئر واضغط بلطف إلى أسفل مع السبابة معقم-القفاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 50 ميكرولتر من تعليق خلية تحتوي على 1 × 10 5 خلايا سرطان الثدي في DMEM 10٪ FBS + القلم بكتيريا في وسط كل بئر من لوحة 6 جيدا. (بدلا من ذلك، وخلايا البذور في نمط فرقت اذا شئت.) وضع لوحة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 45 دقيقة إلى تعزيز مرفق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع جزء 1 العظام على 1 قطعة من الشمع العظام لكل بئر تجريبي وتطبيق ضغط لطيف مع مقراض لضمان الحصول عليها. إجراء تجارب في ثلاث نسخ توضع مثل أن 3 شظايا العظام من عينة THR نظرا الى أعلى ثلاثة آبار، في حين أن ثلاثة آبار السفلية تحتوي على الشمع العظام فقط والضوابط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة 5 مل، برفق وببطء تقديم 5 مل من DMEM 10٪ FBS إلى جانب كل بئر لتجنب طرد الخلايا الثدي أو شظايا العظام. وضع لوحة في 3776، C الأنسجة ثقافة حاضنة لل20-24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) إزالة لوحة من الحاضنة وإضافة الركيزة luciferin (لتحقيق تركيز من 300 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر. صورة لوحة فورا على منصة التصوير IVIS باستخدام المعلمات التالية: F توقف 1، binning صغير، وقت التعرض لل 1 ثانية، ومستوى D. قياس كثافة إشارة من كل جانب متوسط ​​الاشعاع (الفوتونات / ثانية / سنتيمتر مربع / ستيراديان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برامج التصوير لتحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) ل quantitate متوسط ​​الاشعاع لجميع الآبار التجريبية والضابطة. تصدير متوسط ​​قيم الاشعاع لورقة اكسل لأداء الإحصاءات وتوليد الرسوم البيانية. </li></ol> 4. زراعة المشارك خلايا سرطان الثدي المصنف مباشرة على شظايا العظام لدراسة الاستعمار وعدد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لوضع شظايا العظام مباشرة في الآبار الفارغة ل24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة (1 جزء / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذرةETTE 50 ميكرولتر تعليق الخلية قطرة من DMEM 10٪ FBS تحتوي على 1 X 03-06 أكتوبر خلايا سرطان الثدي مباشرة على رأس كل منهما جزء العظام. وضع لوحة في 37 درجة الأنسجة C ثقافة حاضنة لمدة 45 دقيقة إلى تعزيز مرفق الخلية. إضافة بلطف 1-2 مل DMEM 10٪ FBS إلى جانب كل هذا جيدا أن شظية وغمرت تماما في المتوسط. احتضان لوحة في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لل20-24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، واستخدام ملقط لنقل كل جزء أنسجة العظام لوحة 24-جيدا الطازجة التي تحتوي على 1 مل DMEM 10٪ FBS في كل بئر. لأداء BLI، اتبع الخطوات 3،6-3،7 أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن اعتبار أجزاء باستخدام مجهر مضان، أو مسح للحصول على السكان نخاع لتحليل أرقام خلايا سرطان الثدي والممتلكات كما هو موضح في الخطوة 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد شظايا سليمة للتقييم النوعي بواسطة المجهر مضان التالية BLI، ماصة 5 ميكرولتر من الفلورسنت حل وضع العلامات البايفوسفونيت (ما قبلقلص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) في كل بئر لتسمية شويكات المعدنية من شظايا العظام. احتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 24 ساعة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد 24 ساعة من الثقافة في الفلورسنت حل وضع العلامات البايفوسفونيت، واستخدام ملقط لنقل شظايا لوحات زراعة الأنسجة التي تحتوي على الفينول الحمراء الخالية المتوسطة وعرض باستخدام مجهر مضان تكوينها لGFP صورة (485 نانومتر) والتسمية البايفوسفونيت (680 نانومتر). </li></ol> 5. قياس الهجرة من خلايا سرطان الثدي إلى أجزاء الأنسجة والعظام ومثقف العظام جزء Supernatants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهجرة نحو أنسجة العظام الثقافة طاف. ملاحظة: إجراء تجارب في ثلاث نسخ بحيث 3 شظايا من عينة THR معين وتستخدم لتوليد 3 supernatants. لكل تجربة، تتم مقارنة الهجرة عبر ثلاث آبار تحتوي على supernatants العظام مقابل ثلاثة آبار تحتوي على السيطرة المتوسطة فقط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد تيس العظاممقاضاة supernatants من خلال وضع شظايا العظام في آبار من لوحة 12-جيدا تحتوي على 2.2 مل DMEM 10٪ FBS لكل بئر. الثقافة في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 24 ساعة. سحب متوسطة على مدار 24 ساعة واستبدالها مع 2.2 مل الطازجة٪ FBS DMEM-10. آبار المراقبة علاج تحتوي على DMEM 10٪ FBS بنفس الطريقة. ملاحظة: يتم تغيير المتوسطة في 24 ساعة لإزالة العوامل يفرز استجابة لصدمة الأنسجة الناتجة من عملية جراحية. لأنه يتم إنشاؤها supernatants النسيج العظمي في FBS تحتوي المتوسطة والآبار التي تحتوي على FBS التي تحتوي على المتوسطة مدرجة فقط للسيطرة على مساهمات FBS للهجرة خلايا سرطان الثدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 48 ساعة، وجمع 0.9 مل من كل طاف / تحكم المتوسطة وماصة في آبار من لوحة الاستقبال. سيتم لاحقا وضع تدرج في هذه الآبار. احتضان لوحة الاستقبال في الثقافة حاضنة الأنسجة في حين بذر تدرج. ملاحظة: طاف المتبقية (~ 1 مل بعد التبخر) يمكن جمعها لتحليل الواقع secretomeالتمرير إذا رغب 44. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور يدرج Transwell، ووضعها في معيار، فارغة 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. ماصة 350 ميكرولتر تعليق الخلية التي تحتوي على 1 × 10 5 خلايا سرطان الثدي في DMEM 10٪ FBS على العلوي، داخل سطح غشاء من كل إدراج كما هو مبين في الشكل 1A. وضع لوحة 24-جيدا تحتوي على إدراج المصنفة في 37 ° C زراعة الأنسجة حاضنة لمدة 45 دقيقة من أجل تعزيز المرفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد أرفقت الخلايا إلى إدراج، واستخدام ملقط لنقل إدراج لوحة المتلقي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. زاوية كل إدراج عندما وضعها في جهاز الاستقبال جيدا لمنع تشكيل فقاعة بين الغشاء إدراج والمتلقي طاف جيدا. احتضان لوحة الاستقبال مع تدرج لمدة 20 ساعة في 37 ° C الأنسجة الثقافة الحاضنة. ملاحظة: تحقق الجانب السفلي من لوحة المتلقي لفقاعات بين الغشاء إدراج والمتلقي supernatan جيدار. إذا فقاعات واضحة، وإزالة إدراج محددة ووضعها مرة أخرى إلى المتلقي بشكل جيد حتى موجودة جود فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 20 ملقط استخدام ساعة لإزالة إدراج من لوحة الاستقبال. باستخدام الإجراءات في الخطوات 3،6-3،7 أداء BLI لصورة الخلايا التي هاجروا إلى وتعلق على الجزء السفلي من الآبار لوحة الاستقبال. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهجرة نحو شظايا النسيج العظمي. توضع إجراء تجارب في ثلاث نسخ بحيث 3 شظايا من عينة THR بالنظر إلى 3 إدراج منفصلة، ​​وتوضع 3 الخرز الزجاجي إلى 3 إدراج منفصلة الضوابط: ملاحظة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة الاستقبال من قبل pipetting 0.9 مل DMEM 10٪ FBS في كل بئر. وضعه في الثقافة حاضنة الأنسجة أثناء إعداد تدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى البذور وإدراج، عكس لهم على سطح microfuge أنبوب مربع من البلاستيك يحتوي على غطاء. ماصة 50 ميكرولتر تعليق الخلية قطرة من DMEM 10٪ FBS تحتوي على 1 × 10 5 خلايا سرطان الثدي دirectly على، السطح السفلي الخارجي من كل غشاء إدراج (والذي هو مواجهة على إدراج المقلوب). تغطية مربع microfuge أنبوب مع غطاء تصدع مفتوحة وتحويلها إلى 37 درجة مئوية الحاضنة الأنسجة لمدة 45 دقيقة إلى تعزيز مرفق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مربع microfuge أنبوب إلى نسيج الثقافة هود، واستخدام ملقط لتحويل إدراج المصنفة الجانب الأيمن حتى ونقلها إلى الآبار من لوحة الاستقبال. ماصة 0.450 مل DMEM 10٪ FBS في كل كوب إدراج. باستخدام ملقط، ونقل جزء واحد أنسجة العظام (~ 3 ملم) في كل كوب إدراج استعداد. اختياريا، واستخدام الخرز الزجاجي ضوابط السلبية كما في آبار إضافية. وضع لوحة في ثقافة حاضنة الأنسجة لمدة 20 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس الهجرة، وإعداد 24-جيدا القياسية لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1 مل DMEM 10٪ FBS لكل بئر. إزالة لوحة الاستقبال من الحاضنة واستخدام ملقط لنقل شظايا العظام وحبات من كل إدراج في آبار منفصلة من لوحة القياسية. إضافة وسيفيرينالركيزة (لتحقيق تركيز النهائي من 300 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر وتنفيذ BLI باستخدام الإجراءات في الخطوات 3،6-3،7. </li></ol></li></ol> 6. قبل وبعد التجريبية تحليلات إضافية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل نخاع مسح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جزء العظام في مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وضعها في أعلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. استخدام حقنة 10 مل مع إبرة 25 G لطرد بقوة جزء مع 10 مل من برنامج تلفزيوني للحصول على تعليق من خلايا نخاع في أنبوب مخروطي الشكل. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 3 دقائق في 300 x ج و 21 درجة مئوية، ونضح وطاف resuspend الخلايا مكعبات في برنامج تلفزيوني أو حل آخر المطلوبة للالتدفق الخلوي. ملاحظة: تختلف أحجام إعادة تعليق اعتمادا على حجم بيليه الخلية بعد الطرد المركزي، والتطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفحوصات قابلية ~ 75-300 حجم ميكرولتر من PBS مناسبة، ويمكن تحليلها باستخدام هذه المعلقات fluorescenc المتاحة تجارياالبريد المقايسات الحيوية مقرها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، pipetted في عدادة الكريات التقليدية، وتحسب باستخدام مجهر مضان مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل تدفق cytometric أو الفرز على أساس الكشف عن خلايا سرطان الثدي GFP إيجابية، resuspend الكرية خلية في 1 مل PBS تحتوي على 2٪ FBS، 2mm و EDTA، و 10 ملي HEPES مثل أن تركيز هو 1 × 10 6 خلية / مل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H &amp; E تلطيخ والمناعية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمعالجة شظايا لالهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) تلطيخ و / أو المناعية، ضع شظايا في أشرطة بلاستيكية المسمى مع قلم رصاص رقم 2، ويغرق في حاوية مليئة 10٪ من الفورمالين مخزنة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة عملية البارافين التضمين، باجتزاء وتلطيخ باستخدام بروتوكولات الروتينية التي تشمل خطوة زوال الكلس لحساب شويكات المعدنية داخل كل جزء. </li></ol></li></ol>

No disclosures to report.

ميهرا وآخرون. وقد سبق وصفها جمع بعد الوفاة وتحليل عينات العظام من مرضى سرطان البروستاتا النقيلي حصادها في وقت تشريح الجثة، وكشف عن الأنسجة عالية الجودة والتحقق من صحة استخدام عينات العظام البشرية لدراسة عملية النقيلي 47. هنا وصفناها بروتوكولات لجمع ومعالج...

ومن المعترف به على نطاق واسع المكروية الورم بأنه حاسم للسلوك الخلايا السرطانية خلال تطور سرطان الثدي النقيلي وتنتشر 1-3. والهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تسهيل دراسة خلايا سرطان الثدي داخل المكروية من النسيج العظمي البشري، الموقع الأكثر شيوعا من سرطان الثدي ورم خبيث 4-6. وتتكون العظام من المقصورات المعادن ونخاع 7-9، وكلاهما تأوي الخلايا وعوامل يفرز المتورطين في تطور النقيلي 10،11. على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع في نماذج الماوس الجسم الحي تسهيل الدراسات المنهجية لعملية النقيلي 12-15، والتفاعلات خلية داخل الهيكل العظمي لا يمكن الوصول إليها بسهولة لمراقبة واضطراب المباشر. نظم نموذج لدراسة وزراعة الأنسجة الماوس العظام وخلايا نخاع الماوس توفر وصول أفضل، وقد أسفرت العديد من الأفكار بشأن الحديث المتبادل والآليات الكامنة وراء خلية سرطان الثدي مetastasis الهيكل العظمي الفئران 16-22. ومع ذلك، فقد أوضحت الدراسات أنه قد يكون هناك أنماط أنواع محددة من osteotropism للأنسجة العظام 23،24. هذه الأنماط يمكن أن تعكس أنواع محددة المتأصلة الاختلافات في خصائص النسيج العظمي، والاختلافات الناجمة عن تغير السكان نخاع العظم في المناعة ناقصة الفئران 11، و / أو سن مبكرة نسبيا من الفئران المستخدمة في التجارب، وكلها المحددات المحتملة للعظم المكروية. في المختبر النهج لدراسة خلايا سرطان الثدي في الإنسان العظام المشترك الثقافات وركزت عادة على أنواع الخلايا العظمية محددة مثل بانيات المشتقة من نخاع أو خلايا انسجة مثقف كما الطبقات الوحيدة أو داخل النظم نموذج 3-الأبعاد المهندسة 25-35. على الرغم من أن نماذج ثقافة الخلية 2-الأبعاد وقد شكلت الدعامة الأساسية لفي المختبر النهج لأبحاث السرطان، منذ فترة طويلة تم الاعتراف بأن سلوك الخلية يتم تبديل جذري في مonolayer نظم الاستزراع 18،36،37. وقد أدى ذلك إلى تطوير microenvironments المهندسة التي تحاكي تعقيد الأنسجة الحية 3-الأبعاد، بما في ذلك المصفوفة والنماذج القائمة على سقالة مكونة من مواد طبيعية مثل الكولاجين، أو البوليمرات الاصطناعية المصنفة مع أنواع معينة من الخلايا لخلق microenvironments الأنسجة مثل 36-41. وشملت النهج المهندسة أيضا استخدام منصات مفاعل حيوي لمراقبة ودراسة الوسط الهرموني من المكروية 18،19،41-43. على الرغم من أن نماذج المحاكاة البيولوجية والمفاعلات الحيوية توفر العديد من عناصر المكروية الأنسجة المعقدة في الإعداد للرقابة، كما تم تطبيقها بنجاح للمضي قدما في دراسة الانبثاث سرطان الثدي إلى العظام 18،19،35،42،43، نظم نموذج هندسيا لا تتضمن عموما مجموعة كاملة من أنواع الخلايا ومكونات المصفوفة خارج الخلية الحالية ضمن بيئة العظام الأم. حتى وقت قريب، وسرطان الثديلم تدرس الخلايا داخل، سليمة، المكروية 3-الأبعاد الأصلية للأنسجة العظام البشرية. نحن ذكرت مؤخرا تطوير نموذج التعاون الثقافة باستخدام شظايا الأنسجة والعظام البشرية معزولة عن استبدال مفصل الورك (THR) جراحة العينات 44. هذه العينات تؤوي كل من المقصورات المعادن ونخاع اللازمة لدراسة الآليات الكامنة الصغرى الانبثاث في الثقافة على المدى القصير. في الأعمال السابقة أنشأنا إثبات صحة المبدأ لاستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) لمراقبة انتشار خلايا سرطان الثدي، معربا عن luciferase المراسل (MDA-MB-231-fLuc) شارك في تربيتها مع شظايا العظام 44. هنا نقدم تفصيلا البروتوكولات التجريبية لدراسة انتشار خلايا الثدي السرطانية، والاستعمار، والهجرة في سياق المكروية الأم باستخدام إإكسبلنتس النسيج العظمي البشري. لأول مرة نقدم بروتوكول للمشاركة في زراعة خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام لقياس الثديتكاثر الخلايا باستخدام BLI. في هذا القسم، والمصنف تعليق خلية الثدي كبقع خلية في 6 لوحات جيدا المجاورة لشظايا العظام، والتي يجمد بواسطة قطعة من الشمع العظام. آبار المراقبة تحتوي على الشمع العظام، ولكن لا شظية العظام. مرة واحدة نعلق البقع الخلية، ويضاف المتوسطة واللوحة هو مثقف لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك كثافة إشارة للإضاءة الحيوية (المرتبطة عدد الخلايا) ويقاس مع BLI. في الخطوة التالية نقدم طرق لخلايا سرطان الثدي زراعة شارك المصنف مباشرة على شظايا العظام لدراسة الاستعمار والانتشار. هنا و pipetted تعليق خلية الثدي مباشرة على أجزاء النسيج العظمي، والتي يتم رصدها في الثقافة عن طريق BLI ومضان المجهر مع مرور الوقت لتتبع الاستعمار وعدد الخلايا. في هذه الطريقة، مقصورة نخاع يمكن مسح من شظايا العظام في أي لحظة من الوقت لتحليل خلايا سرطان الثدي مستعمرة من قبل التدفق الخلوي، أو المقايسات الجدوى نخاع. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا ديالكاتب نهجين مختلفين لقياس سرطان الثدي خلية الهجرة. في الطريقة الأولى وترد خطوات لقياس الهجرة نحو supernatants زراعة الأنسجة العظمية. في هذا البروتوكول هي المصنفة في خلايا سرطان الثدي على الداخلية، والسطوح العليا من Transwell إدراج الأغشية مع 8 ميكرون حجم المسام (كما هو موضح في الشكل 1A). ثم يتم وضعها على إدراج في لوحة المتلقي مع الآبار التي تحتوي على طاف النسيج العظمي أو السيطرة المتوسطة. وعلى مدار فترة حضانة 20 ساعة، أعداد صغيرة من خلايا سرطان الثدي تهاجر من خلال الأغشية إدراج أسفل إلى أقل الآبار زراعة الأنسجة حيث يعلقونها للكشف من قبل BLI. في طريقة الهجرة الثانية هي المصنفة في خلايا سرطان الثدي على الدنيا، الأسطح الخارجية للTranswell الأغشية إدراج. توضع شظايا النسيج العظمي في أكواب إدراج وخلايا سرطان الثدي تهاجر من خلال الأغشية لاستعمار شظايا العظام (كما هو موضح في الشكل 1B)، والتيثم يتم تصويرها باستخدام BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

العظام هو الموقع الأكثر شيوعا لالانبثاث سرطان الثدي. على الرغم من أنه من المقبول على نطاق واسع أن سلوك الخلايا السرطانية المكروية التأثيرات، لا يعرف إلا القليل عن سرطان الثدي خصائص الخلية والسلوكيات داخل المكروية الأم من أنسجة العظام البشرية. لقد قمنا بتطوير المناهج لتتبع وقياس وتعدل خلايا سرطان الثدي البشرية داخل المكروية ل مثقف شظايا الأنسجة والعظام البشرية معزولة عن رؤساء الفخذ التخلص التالية إجمالي العمليات الجراحية لاستبدال مفصل الورك. باستخدام خلايا سرطان الثدي هندسيا لو luciferase تعزيز الخضراء بروتين فلوري (EGFP) التعبير، ونحن قادرون ل quantitate بتكاثر الهجرة وانتشار أنماط باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI)، والتفاعلات خلية المسار داخل شظايا العظام باستخدام المجهر مضان، وتقييم خلايا الثدي بعد الاستعمار مع التدفق الخلوي. المزايا الرئيسية لهذا النموذج ما يلي: 1) من مواليد، microe الأنسجة سليمة معمارياnvironment يتضمن أنواع الخلايا الإنسان ذات الصلة، و2) الوصول المباشر إلى المكروية، مما يسهل الكمية السريعة ومراقبة النوعية واضطراب الثدي والخلايا العظمية الخصائص والسلوكيات والتفاعلات. ومن القيود الأساسية، في الوقت الحاضر، هو قابلية محدودة من شظايا الأنسجة، والتي تحصر نافذة الدراسة إلى الثقافة على المدى القصير. وتشمل تطبيقات في النظام النموذجي دراسة البيولوجيا الأساسية للسرطان الثدي وغيرها من الأورام الخبيثة التي تسعى العظام داخل المتخصصة النقيلي، ووضع استراتيجيات علاجية فعالة لاستهداف خلايا سرطان الثدي في أنسجة العظام.

عزل شظايا الأنسجة من رؤساء الفخذ تم جمع رؤساء الفخذ من أعداد متساوية من الذكور والإناث من المرضى (44-90 عاما) يخضع الاختيارية مجموع جراحة استبدال مفصل الورك في قسم جراحة العظام في كلية الطب بجامعة ستانفورد. يحتوي كل رأس الفخذ التخلص...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

يتم وصف البروتوكولات لدراسة سرطان الثدي هجرة الخلايا وانتشارها والاستعمار في نسيج العظام نظام نموذجي يزدرع البشري.

طرق التثقيف عظم الفخذ الإنسان إإكسبلنتس الأنسجة لدراسة سرطان الثدي الاستعمار خلية للالمتخصصة الإنتقالية

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K Views.  Stanford University School of Medicine.  يتم وصف البروتوكولات لدراسة سرطان الثدي هجرة الخلايا وانتشارها والاستعمار في نسيج العظام نظام نموذجي يزدرع البشري. 

Video: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

أسلوب الرواية تطوير أدوية لمكافحة السرطان باستخدام Explants ورم العينات الجراحية


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

و في المختبر النظام الدراسي لاستئصال ورم من الخمول وتبديل للنمو النقيلي

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

الإنسان الخلية السرطانية الهرموني العصبي خطوط بمثابة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الإنسان علاج ورم الغدد الصم العصبية

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

استخدام البروتين عكس صالحة المرحلة (RPPA) لاستكشاف البروتين في التعبير التغير فردية سرطان الخلايا الكلوية

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

بدء النقيلي سرطان الثدي عن طريق استهداف ظهارة الأقنية مع اتش، لجنة المساواة العرقية: رواية المعدلة وراثيا نموذج الفأر من سرطان الثدي

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

التنميط من MicroRNAs الاستروجين التنظيم في خلايا سرطان الثدي

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

ثلاثة الثقافات الأبعاد: أداة لدراسة الهندسة المعمارية عادي عنيبية مقابل التحول السرطاني للخلايا الثدي

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

حقن مثلي من خلايا سرطان الثدي في الثديية الدهون وسادة من الفئران لدراسة نمو الأورام.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لدراسة هرمون العمل في الثدي البشري

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere تشكيل الفحص من الثدي البشري سرطان الأنسجة وخطوط الخلايا

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...