Name: methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
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Diese Studien wurden finanziert zum Teil durch Zuschüsse aus dem Alternative Forschungs- und Entwicklungsgemeinschaft (107.588), das National Institute of Health (1U54CA136465-04S1) und dem California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Wir danken Drs. Andrew Wilber und R. Scott McIvor für die großzügige Spende ihrer <pkt2 lubig=""> transponson und pK / hUbiC-SB11 Transposase Plasmide. Wir danken John Tamaresis, Ph.D. Rat der statistischen Methoden, Timothy Brown für die Durchführung der Durchflusszytometrie, Georgette Henrich für die Beratung über Migrationen Assays und Nancy Gamba zur Erleichterung der Sammlung von THR Proben. </pkt2>

Kugelköpfe wurden von Patienten nach elektiven THR Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Alle Gewebe wurden als de-identifizierte Proben in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Stanford University Research Compliance Office gesammelt. 1. Auswählen einer Brustkrebszelllinie (n) <ol><li> Erhalten oder Transfektion die gewünschte Brustkrebszelllinie (n) mit einem Luciferase-GFP-Reporterkonstrukt. Die folgenden Versuche wurden durch Transfektion mit dem Transposon Sleeping Beauty Plasmid PKT2 / Lubig unter Verwendung der MDA-MB-231 und MCF-7 Brustkrebs-Zelllinien für die stabile Expression von Firefly Luziferase entwickelt (Fluc) und enhanced green fluorescent protein (EGFP) und die Transposase Plasmid pK / hUbiC-SB11 45,46. HINWEIS: Die transfizierten Zelllinien werden als MDA-MB-231-FluC-EGFP und MCF-7-FluC-EGFP bezeichnet. </li></ol> 2. Isolieren Tissue Fragments von Hüftköpfe <ol><li> Nach THR Chirurgie, sammeln die verworfen Hüftkopf in einem sterilen Behälter mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllt. Die Probe wird im Labor und verarbeiten es in 1-3 Stunden nach der Operation. Hinweis: wenn es eine Verzögerung in der Verarbeitung, Man gibt die Probe bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie einen Arbeitsbereich, indem Sie die folgenden Elemente auf einem saugfähigen Matte in einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube: sterile Handschuhe, chirurgische Zange, Zangen, Becherglas mit 70% igem Isopropanol, Instrumente und Gewebekulturgefäße gründlich wie unten für jede Art von Experiment festgelegt . </li><li> Das Tragen eines sterilen OP-Handschuh, um die Runde Femurkopf in einer Hand zu halten, verwenden Sie die Zange in der anderen Hand, um Trabekelknochen Fragmente gewünschter Größe (~ 2-5 mm) von der freiliegenden oberen Welle des Oberschenkelknochens zu extrahieren. Übertragen Knochenfragmente in das Kulturgefäß (beispielsweise 6, 12 oder 24-Well-Gewebekulturplatte oder Migration Kammer), abhängig von der Art der Proliferation, colonization oder Migration Experiment wie in den Schritten 3, 4 oder 5 beschrieben. HINWEIS: Knochengewebefragmenten sollte wie oben, nachdem Sie die ersten Schritte für jede spezifische Proliferation, Kolonisierung oder Migrationsassay beschrieben geerntet werden. Fragmente in einem Größenbereich, wie in Abbildung 2 dargestellt. Fragmente können vor oder nach Versuchen zum Zwecke der Standardisierung abzuwägen. </li></ol> 3. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen Angrenzend an Knochenfragmente zu Brustzellproliferation messen Mit BLI <ol><li> Vor dem Experiment Eine Suspension, die 2 x 10 5 Brustkrebszellen / 50 ul, und bereiten Stopfen aus Knochenwachs zur Immobilisierung von Knochenfragmenten in Kultur. Schneiden Sie ein P200 Mikropipettenspitze in 3 Teile, verwenden Sie das schmale Ende der größte Stück in einem &quot;Cookie-Cutter&quot; Art und Weise, um kleine (~ 35 mg) Knochenstücke Wachs geschnitten. Verwenden Sie das breite Ende der kleinste Stück, um die Knochenwachs Stecker in eine Petrischale ausgeworfenfür die Lagerung. </li><li> Legen Sie ein Stück Knochenwachs auf der 12-Uhr-Position jeder Vertiefung und drücken Sie leicht mit einem sterilen Handschuhen Zeigefinger. </li><li> Je 50 ul der Zellsuspension mit 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in der Mitte jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. (Alternativ Samenzellen in einem verteilten Muster, falls gewünscht.) Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. </li><li> Zeigen 1 Knochenfragment auf 1 Stück Knochen Wachs für jeden experimentellen gut und sanften Druck mit der Knochenzange, um sie zu sichern. Führen Experimenten in dreifacher Ausfertigung, dass 3 Knochenfragmente von einem bestimmten THR Probe werden in den ersten drei Vertiefungen gegeben, während die unteren drei Brunnen enthalten Knochenwachs nur als Kontrolle. </li><li> Unter Verwendung einer 5 ml-Pipette vorsichtig und langsam zu liefern 5 ml DMEM-10% FBS zu der Seite jeder Vertiefung zu vermeiden Verdrängen der Brustzellen oder Knochenfragmenten. Die Platte wird in eine 3776; C Gewebekultur-Inkubator für 20-24 Std. </li><li> Um Biolumineszenz-Bildgebung durchzuführen (BLI) entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Luciferinsubstrat (um eine Konzentration von 300 ug / ml zu erreichen) in jede Vertiefung. Bild die Platte sofort in einem IVIS Imaging Platform mit den folgenden Parametern: Blende von 1, kleine Binning, Belichtungszeit von 1 Sekunde, Ebene D. Messen Sie die Signalintensität der einzelnen sowie durchschnittliche Strahldichte (Photonen / Sekunde / Quadratzentimeter / Steradiant). </li><li> Verwenden Sie Imaging-Software zu definieren, Regions of Interest (ROI), die durchschnittliche Strahlung für alle experimentellen und Kontrollvertiefungen zu quantifizieren. Export durchschnittliche Strahlungswerte in ein Excel-Blatt, Statistiken führen und Grafiken erstellen. </li></ol> 4. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen direkt Gesetzte Auf Knochenfragmente zur Kolonisation und Cell Number Studieren <ol><li> Verwenden einer Pinzette, um Knochenfragmente direkt in die leeren Wells einer 24-Well-Gewebekulturplatte (1 Fragment / Vertiefung) zu platzieren. </li><li> Pipette 50 ul Zellsuspension Tröpfchen aus DMEM-10% FBS mit 1 X 3-6 Oktober Brustkrebszellen direkt aufeinander Knochenfragment. Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. Hinzuzufügen sanft 1-2 ml DMEM-10% FBS in die Seite jeder Vertiefung, so daß das Fragment wird vollständig in einem Medium eingetaucht ist. Inkubieren der Platte in einem 37 ° C Brutschrank für 20-24 Std. </li><li> Nach der Inkubation verwenden Pinzette jedes Knochengewebefragment in ein frisches 24-Well-Platte mit 1 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung zu übertragen. Um BLI durchzuführen, führen Sie die Schritte 3,6-3,7 oben. Zusätzlich können Fragmente mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, oder gespült, um den Markpopulation für Analysen der Brustkrebs-Zellzahlen und den Eigenschaften wie in Schritt 6 beschrieben, erhalten. </li><li> Um die intakten Fragmente zur qualitativen Bewertung durch Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet folgenden BLI, Pipette 5 ul von fluoreszierenden Bisphosphonat Markierungslösung (preVergleich nach den Anweisungen des Herstellers) in jede Vertiefung, um die mineralisierte spicules der Knochenfragmente zu markieren. Die Platte in der Gewebekultur-Inkubator für weitere 24 Stunden. </li><li> Nach 24 Stunden der Kultur in der Leuchtstoff Bisphosphonat Etikettierungslösung Verwenden einer Pinzette, um die Fragmente zu Gewebekulturplatten mit Phenolrot-freiem Medium und Ausblick mit einem Fluoreszenzmikroskop für Bild GFP (485 nm) und Bisphosphonat-Etikett (680 nm) konfiguriert übertragen. </li></ol> 5. Mess Migration von Brustkrebszellen zu Knochengewebe Fragmente und kultivierten Knochenfragment Stände <ol><li> Migration in Richtung Knochengewebekulturüberstand. HINWEIS: Führen Experimenten in dreifacher Ausführung, so daß 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe verwendet werden, um 3-Überstände zu erzeugen. Für jedes Experiment wird die Migration auf drei Vertiefungen, die Knochenüberständen gegen drei Brunnen, die nur Steuermedium verglichen. <ol><li> Geneknochen tisklagen Ständen indem Knochenfragmente in die Wells einer 12-Well-Platte mit 2,2 ml DMEM-10% FBS pro Mulde. Kultur in einem 37 ° C Brutschrank für 24 Stunden. Ziehen Sie das Medium nach 24 Stunden und ersetzen mit 2,2 ml frischem DMEM-10% FBS. Treat Kontrollvertiefungen enthaltenden DMEM-10% FBS in der gleichen Weise. HINWEIS: Das Medium wird nach 24 Stunden geändert, um Faktoren als Reaktion auf Gewebetrauma nach einer Operation erfolgen abgesondert zu entfernen. Weil Knochengewebe Überstände werden in generierten FBS enthaltenden Medium, Vertiefungen, die FBS enthaltenden Medium nur enthalten, um für die Beiträge der FBS, um Brustkrebs-Zellmigration steuern. </li><li> Nach 48 Stunden, sammeln 0,9 ml jedes Überstands / Steuermedium und Pipette in die Vertiefungen einer Aufnahmeplatte. Die Einsätze werden später in diese Vertiefungen gelegt werden. Inkubieren Sie die Aufnahmeplatte in der Gewebekultur-Inkubator während der Aussaat der Einsätze. Hinweis: Der verbleibende Überstand (~ 1 ml nach dem Eindampfen) können für die Analyse von Sekretom facto gesammeltrs auf Wunsch 44. </li><li> Um die Transwell-Einsätze Saatgut, legen Sie sie in ein Standard, leere 24-Well-Gewebekulturplatte. Pipette 350 ul Zellsuspension, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS auf das obere, innere Membranoberfläche jedes Einsatzes, wie in 1A gezeigt. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die die gesetzten Einsätze in den 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Befestigung zu fördern. </li><li> Sobald die Zellen an den Einsätzen befestigt sind, verwenden Zange, um die Einsätze an der Aufnahmeplatte nach den Anweisungen des Herstellers übertragen. Angle jeder Einsatz, wenn Sie diese in den Receiver auch um eine Blasenbildung zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch Überstand zu verhindern. Inkubieren des Empfängerplatte mit Einlagen für 20 h in einem 37 ° C Brutschrank. HINWEIS: Blasen zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch supernatan Überprüfen Sie die Unterseite der Aufnahmeplattet. Sind Blasen sichtbar, entfernen Sie die spezifische Einsätze und legen Sie sie wieder in den Empfänger gut, bis keine Luftblasen vorhanden sind. </li><li> Nach 20 h Verwendung einer Pinzette, um die Einsätze von der Aufnahmeplatte zu entfernen. Unter Verwendung der Verfahren in Schritten von 3,6 bis 3,7 durchgeführt BLI für Bild in die Zellen, die in migriert und auf den Boden der Aufnahmeplatte Brunnen angeschlossen haben. </li></ol></li><li> Migration in Richtung Knochengewebefragmenten. HINWEIS: Führen Sie Versuche in dreifacher Ausfertigung, dass 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe werden in 3 verschiedene Inserts platziert und 3 Glasperlen werden in 3 verschiedene Einsätze als Kontrollen gelegt. <ol><li> Bereiten Sie die Aufnahmeplatte durch Pipettieren von 0,9 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung. Legen Sie sie in den Brutschrank, während der Vorbereitung der Einsätze. </li><li> Um die Einsätze Saatgut, kehren sie auf der Oberfläche eines Kunststoffmikrozentrifugenröhrchen Box, die einen Deckel hat. Pipettieren Sie 50 ul Zellsuspension Tropfen DMEM-10% FBS, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen direkt auf die äußere, untere Fläche jedes Einsatzes Membran (zugewandte auf der invertierten Einsätze). Bedecken Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Box mit dem Deckel aufgeschlagen und übertragen sie an die 37 ° C-Inkubator Gewebe für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. </li><li> Übertragen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Feld, um die Gewebekultur Kapuze, und verwenden Sie Pinzette, um die gesetzten Einsätze rechten Seite nach oben drehen und sie in die Vertiefungen der Aufnahmeplatte. Pipette 0,450 ml DMEM-10% FBS in jede Einsatzschale. Mit einer Pinzette, übertragen Sie einen Knochengewebe Fragment (ca. 3 mm) in jede vorbereitete Einsatzschale. Optional können Sie mit Glasperlen als negative Kontrollen in weitere Bohrungen. Die Platte wird in einem Gewebekultur-Inkubator für 20 Stunden. </li><li> Um die Migration zu messen, bereiten Sie einen Standard-24-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml DMEM-10% FBS pro Vertiefung. Entfernen Sie die Aufnahmeplatte aus dem Inkubator und verwenden Pinzette, um die Knochenfragmente und Perlen aus jeweils in separate Vertiefungen der Standardplatte übertragen einfügen. Luciferin hinzufügenSubstrat in jede Vertiefung (um eine Endkonzentration von 300 ug / ml zu erreichen) und führen BLI unter Verwendung der Verfahren in den Schritten 3,6-3,7. </li></ol></li></ol> 6. Zusätzliche Pre- und Post-experimentellen Analysen <ol><li> Analyse gespült Mark. <ol><li> Übertragen einer Knochenfragment in eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb an der Spitze einer konischen 50 ml-Röhrchen gegeben. Verwenden einer 10 ml-Spritze mit einer 25 G Nadel, um kräftig zu spülen das Fragment mit 10 ml PBS, um eine Suspension von Knochenmarkzellen in der konischen Röhre zu erhalten. Zentrifuge wurde die Zellsuspension 3 Minuten bei 300 × g und 21 ° C, saugt den Überstand und Resuspendieren der pelletierten Zellen in PBS oder andere gewünschte Lösung für die Durchflusszytometrie. HINWEIS: Resuspension Volumen wird in Abhängigkeit von der Größe der Zellpellet nach der Zentrifugation und der Anwendung variieren. </li><li> Für Lebensfähigkeitstests ~ 75-300 ul-Volumina von PBS angemessen sind, und diese Suspensionen können analysiert werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen fluorescence basierend Lebensfähigkeitstests nach den Anweisungen des Herstellers, pipettiert in einen herkömmlichen Hämozytometer und mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop gezählt. </li><li> Für die Durchflusszytometrie oder Sortierung basierend auf der Erfassung GFP-positiven Brustkrebszellen, Zellpellet in 1 ml PBS, enthaltend 2% FBS, 2 mM EDTA und 10 mM HEPES, so dass die Konzentration 1 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E-Färbung und Immunhistochemie. <ol><li> Um die Fragmente für Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung und / oder Immunhistochemie Dabei legen die Fragmente in Plastikkassetten mit einer Nummer 2 Bleistift markiert, und tauchen in einen Behälter mit 10% gepuffertem Formalin für 24 Stunden aufgefüllt. </li><li> Prozess-Gewebe für Paraffineinbettung, Schneiden und Färben Verwendung von Routineprotokollen, die eine Entkalkung Schritt für die mineralisierten Nadeln in jedem Fragment Konto gehören. </li></ol></li></ol>

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Mehra et al. Wurden bereits beschrieben die Obduktion Sammlung und Analyse von Knochenproben von metastasierendem Prostatakrebs-Patienten zum Zeitpunkt der Autopsie entnommen und enthüllt hochwertigen Gewebe und Validierung der Verwendung von menschlichen Knochenproben, um die metastatischen Prozess 47 zu studieren. Hier haben wir Protokolle zur Erhebung, Verarbeitung und Nutzung von menschlichen verworfen Femurköpfe folgenden THR Operation in einer kurzfristigen Co-Kultursystem, um Brustzellmigrat...

Die Tumor-Mikroumgebung wird weithin als ein kritischer Faktor für die Krebszelle Verhalten bei Brustkrebs Progression und Metastasen erkannt verteilt 1-3. Das Ziel der hier vorgestellten Verfahren ist die Untersuchung von Brustkrebs-Zellen in der Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe, die häufigste Stelle der Brustkrebsmetastase 4-6 erleichtern. Knochen von mineralisierten und Mark Fächer 7-9, die beide beherbergen Zellen sezerniert Faktoren bei metastasierendem Progression 10,11 verwickelt zusammen. Obwohl weit verbreitet in vivo Mausmodellen zu erleichtern systemische Studien des metastatischen Prozesses 12-15, Zell-Wechselwirkungen innerhalb des Skeletts sind nicht für die Beobachtung und direkten Störung leicht zugänglich. Modellsysteme für die Untersuchung und Kultivierung von Maus-Knochengewebe und Knochenmarkzellen der Maus einen besseren Zugang und haben viele Erkenntnisse über Sprechen und Mechanismen, die Brustkrebs-Zell m ergabetastasis der murinen Gerüst 16-22. Studien haben jedoch ergeben, dass es artspezifische Muster osteotropism für Knochengewebe 23,24 sein. Diese Muster inhärent speziesspezifische Unterschiede in der Knochengewebeeigenschaften, von Differenzen aus veränderten Knochenmarkspopulationen in immundefizienten Mäusen 11 und / oder der relativ jungen Alter der Mäuse in Experimenten verwendet, von denen alle voraussichtlich Determinanten des Knochens beziehen könnte Mikroumgebung. In vitro-Ansätzen zur Untersuchung Brustkrebszellen in menschlichen Knochen Kokulturen wurden typischerweise auf bestimmten Knochenzelltypen wie Mark abgeleiteten Osteoblasten oder Stromazellen als Monolayer kultiviert oder in konstruierte 3-dimensionale Modellsysteme 25-35 konzentriert. Obwohl 2-dimensionalen Zellkulturmodellen haben die Hauptstütze der in vitro gebildeten Ansätze für die Krebsforschung ist seit langem bekannt, dass das Zellverhalten ist grundsätzlich in m verändertonolayer Kultursystemen 18,36,37. Dies hat zur Entwicklung von technisch Mikroumgebungen, die die Komplexität von 3-dimensionalen lebenden Geweben, einschließlich Matrix- und Gerüst basierende Modelle von natürlichen Materialien wie Collagen nachahmen geführt, oder synthetische Polymere geimpft mit spezifischen Zelltypen, die gewebeartige Mikroumgebungen zu schaffen 36-41. Engineered Ansätze haben auch die Verwendung von Bioreaktor Plattformen zu kontrollieren und zu untersuchen das hormonelle Milieu der Mikro 18,19,41-43. Obwohl biomimetische Modelle und Bioreaktoren bieten viele Elemente eines komplexen Gewebemikroumgebung, in einer kontrollierten Umgebung und wurden erfolgreich angewendet, um die Studie von Brustkrebs Metastasen in Knochen 18,19,35,42,43 voranzubringen, müssen entwickelt Modellsysteme in der Regel nicht übernehmen das gesamte Spektrum von Zelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten innerhalb der nativen Knochen Umwelt vorhanden. Bis vor kurzem BrustkrebsZellen wurden nicht innerhalb der nativen intakten, 3-dimensional-Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe untersucht worden. Vor kurzem berichteten wir die Entwicklung eines Co-Kultur-Modell mit menschlichen Knochengewebefragmenten aus Hüft isoliert (THR) Chirurgie Proben 44. Diese Proben bergen sowohl die Mineralisierung und Knochenmark Fächer notwendig, Mechanismen Mikrometastasen in Kurzzeitkultur zugrunde zu studieren. In früheren Arbeiten haben wir Proof-of-Prinzip für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), die Proliferation von Luciferase-exprimierenden Brustkrebszellen (MDA-MB-231-Fluc) co-kultiviert mit Knochenfragmente 44 zu überwachen. Hier haben wir für das Studium der Brust Zellkrebs Proliferation, Kolonisierung und Migration im Rahmen der nativen Mikroumgebung mit menschlichen Knochen Gewebeexplantaten Gehende bestehende experimentelle Protokolle. Zuerst ein Protokoll für Co-Kultivierung Brustkrebszellen neben Knochenfragmenten an Brust messen präsentieren wirZellproliferation mit BLI. In diesem Abschnitt werden die Brustzellsuspensionen Zellflecken in 6-well Platten angrenzend an Knochenfragmente, die durch Stücke von Knochenwachs immobilisiert werden ausgesät. Kontrollvertiefungen enthalten Knochenwachs, aber keine Knochenfragment. Sobald Zellflecken zu befestigen, ist Medium gegeben und die Platte wird für 24 Stunden, nach der Biolumineszenz-Signalintensität (mit Zellzahl assoziiert) mit BLI gemessen kultiviert. Im nächsten Schritt stellen wir Verfahren zur Co-Kultivierung Brustkrebszellen direkt auf Knochenfragmente beimpft, um Ansiedlung und Vermehrung zu studieren. Hier werden die Brustzellsuspensionen werden direkt auf die Knochengewebefragmenten, die in Kultur durch BLI und Fluoreszenzmikroskopie über die Zeit überwacht werden, um Kolonisation und Zellzahl verfolgen pipettiert. In diesem Verfahren wird der Markraum kann von den Knochenfragmenten zu jedem Zeitpunkt für die Analyse von kolonisierten Brustkrebszellen durch Durchflusszytometrie gespült werden oder Mark-Lebensfähigkeitstests. Darüber hinaus haben wir deSchreiber zwei verschiedene Ansätze zur Messung von Brustkrebszellmigration. Im ersten Verfahren wird zur Messung der Migration in Richtung Knochengewebekulturüberständen Schritten beschrieben. In diesem Protokoll die Brustkrebszellen ausgesät werden, auf die inneren, oberen Flächen der Transwell einfügen Membranen mit einer 8 um Porengröße (wie in 1A gezeigt). Die Einsätze werden dann in einer Aufnahmeplatte mit Vertiefungen, die Knochengewebe Überstand oder Kontrollmedium platziert. Im Laufe von 20 Stunden Inkubationszeit eine kleine Anzahl von Brustkrebszellen wandern durch den Einsatz Membranen in die unteren Gewebekulturvertiefungen, wo sie für den Nachweis durch BLI befestigen. In der zweiten Migrations-Verfahren die Brustkrebszellen werden auf die untere Außenflächen Transwell-Einsatz Membranen ausgesät. Knochengewebefragmente werden in die Einsatzschalen gelegt und die Brustkrebszellen wandern nach oben durch die Membranen an den Knochenfragmenten zu kolonisieren (wie in 1B dargestellt), diewerden dann aufgenommen mit BLI.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy&#039;s 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Supplement all McCoy&#039;s&amp;nbsp; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillen Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&amp;nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Supplement media used for transfected cell lines.</td></tr><tr><td>Falcon&amp;reg; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &amp;mu;m pore size)</td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&amp;reg; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 70 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Bone wax</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Imaging Platform</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software Program&amp;nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>Version 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 breast cancer cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

Bone ist die häufigste Stelle der Metastasierung von Brustkrebs. Obwohl es allgemein, dass der Mikro Einflüsse Krebszellverhalten akzeptiert wird, wird wenig über Brustkrebszell Eigenschaften und Verhaltensweisen in der nativen Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe bekannt. Wir haben Ansätze zu verfolgen, zu quantifizieren und zu modulieren menschlichen Brustkrebszellen in der Mikroumgebung des entwickelten kultivierten menschlichen Knochengewebefragmenten aus gebrauchten Femurköpfe nach Hüft-TEP Operationen isoliert. Verwendung Brustkrebszellen für Luciferase konstruiert und verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) Expression sind wir in der Lage, reproduzierbar zu quantifizieren Migration und Proliferation Muster mit Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), Spur Zell-Wechselwirkungen innerhalb der Knochenfragmente mittels Fluoreszenzmikroskopie und auszuwerten Brustzellen nach Besiedlung mit Durchflusszytometrie. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind: 1) eine native, architektonisch intaktem Gewebe MicroEnvironment relevanten Zelltypen des Menschen beinhaltet, und 2) direkten Zugriff auf die Mikroumgebung, die eine schnelle quantitative und qualitative Überwachung und Störung der Brust und Knochenzelleigenschaften, Verhaltensweisen und Interaktionen ermöglicht. Eine Haupteinschränkung, derzeit ist die finite Lebensfähigkeit der Gewebefragmente, die das Fenster der Studie, um Kurzzeitkultur beschränkt. Anwendungen des Modellsystems umfassen die Untersuchung der Grundlagen der Biologie von Brustkrebs und anderen Knochensuchmalignomen in der metastatischen Nische, und die Entwicklung therapeutischer Strategien zur zielgerichteter Brustkrebszellen in Knochengewebe.

Isolieren von Gewebefragmenten aus Hüftköpfe Kugelköpfe wurden aus einer gleichen Anzahl von männlichen und weiblichen Patienten (44-90 Jahre) nach elektiven Hüft-Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Jedes verworfen Hüftkopf enthält einen kleinen Teil des oberen Oberschenkel, die trabekuläre Knochengewebe des mineralisierten Nadeln und Mark zusammen birgt. Dieses Gewebe ist durch die chirurgisch freiQuerSchn...

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Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben.

Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

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Research

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Medicine

12.4K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine.  Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben. 

Serie: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Forschung

Krebsforschung

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Medizin

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Herstellung und Analyse von<em&gt; In Vitro</em&gt; Three Dimensional Mammakarzinoms Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Biotechnik

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully recapitulate aspects of cancer progression such as proliferation and invasion. Although patient-derived organoids and patient-derived xenograft organoids are pathophysiologically relevant, they are costly to propagate, difficult to manipulate, and comprised primarily of the most proliferative cell types within the tumor microenvironment (TME). These limitations prevent their use for elucidating cellular mechanisms of disease progression that depend upon tumor-associated stromal cells which are found within the TME and known to contribute to metastasis and therapy resistance. 
Here, we report on methods for cultivating epithelial-stromal multicellular 3D cultures. The advantages of these methods include a cost-effective system for rapidly generating organoid-like 3D cultures within scaffold-free environments that can be used to track invasion at single-cell resolution within hydrogel scaffolds. Specifically, we demonstrate how to generate these heteromulticellular 3D cultures using BT-474 breast cancer cells in combination with fibroblasts (BJ-5ta), monocyte-like cells (THP-1), and/or endothelial cells (EA.hy926). Additionally, differential fluorescent labeling of cell populations enables time-lapse microscopy to define 3D culture assembly and invasion dynamics. 
Notably, the addition of any two stromal cell combinations to 3D cultures of BT-474 cells significantly reduces circularity of the 3D cultures, consistent with the presence of organoid-like or secondary spheroid structures. In tracker dye experiments, fibroblasts and endothelial cells co-localize in the peripheral organoid-like protrusions and are spatially segregated from the primary BT-474 spheroid. Finally, heteromulticellular 3D cultures of BT-474 cells have increased hydrogel invasion capacity. Since we observed these protrusive structures in heteromulticellular 3D cultures of both non-tumorigenic and tumorigenic breast epithelial cells, this work provides an efficient and reproducible method for generating organoid-like 3D cultures in a scaffold-free environment for subsequent analyses of phenotypes associated with solid tumor progression.

There is a critical need for 3D cancer models that capture heterocellular crosstalk to study cancer metastasis. Our study presents the generation of heteromulticellular stromal-epithelial in a scaffold and scaffold-free environment that can be used to study invasion and cellular spatial distributions.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

Langfristige Culture of Human Breast Cancer Proben und deren Analyse mit Hilfe von optischen Projektion Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Biologie

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without breaching the collagenous basement membrane. While DCIS is a non-obligate precursor to invasive breast cancers, the molecular mechanisms and cell populations that permit progression to invasive cancer are not fully known. To determine if progenitor cells capable of invasion existed within the DCIS cell population, we developed a methodology for collecting and culturing sterile human breast tissue at the time of surgery, without enzymatic disruption of tissue.
Sterile breast tissue containing ductal segments is harvested from surgically excised breast tissue following routine pathological examination. Tissue containing DCIS is placed in nutrient rich, antibiotic-containing, serum free medium, and transported to the tissue culture laboratory. The breast tissue is further dissected to isolate the calcified areas. Multiple breast tissue pieces (organoids) are placed in a minimal volume of serum free medium in a flask with a removable lid and cultured in a humidified CO2 incubator. Epithelial and fibroblast cell populations emerge from the organoid after 10 - 14 days. Mammospheres spontaneously form on and around the epithelial cell monolayer. Specific cell populations can be harvested directly from the flask without disrupting neighboring cells. Our non-enzymatic tissue culture system reliably reveals cytogenetically abnormal, invasive progenitor cells from fresh human DCIS lesions.

Primary cell culture using intact tissue organoids provides a model system that mimics the multi-cellular in vivo microenvironment. We developed a serum-free primary breast epithelium tissue culture model that perpetuates mixed cell culture lineages and exhibits differentiated morphology, without enzymatic tissue disruption. Breast organoids remain viable for &#62;6 months.

Nicht-enzymatische, Serumfreie Zellkultur von Pre-invasive Brustläsionen für Spontane Erzeugung Mammospheres

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...