מחקרים אלו מומנו, בין שאר, על ידי מענקים מהאלטרנטיביים למחקר ופיתוח (107,588), המכון הלאומי לבריאות (1U54CA136465-04S1), ותכנית לחקר סרטן שד קליפורניה (201B-0141). אנו מודים בני הזוג. אנדרו וילבר ור &#39;סקוט McIvor לתרומתם הנדיבה שלהם <pkt2 lubig=""> פלסמידים transposase transponson וPK / hUbiC-SB11. הכרת תודה אנו מודים ג&#39;ון Tamaresis, Ph.D. לקבלת ייעוץ על שיטות סטטיסטיות, טימותי בראון לביצוע cytometry זרימה, ג&#39;ורג&#39;ט היינריך לקבלת ייעוץ על מבחני הגירה, וננסי Bellagamba להקלה על האוסף של דגימות THR. </pkt2>

ראש עצם הירך נאסף מחולים שעברו ניתוח THR בחירה במחלקה לכירורגיה אורטופדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. כל הרקמות נאספו כדגימות זוהתה de בהתאם לתקנות של משרד Compliance מחקר באוניברסיטת סטנפורד. 1. בחירת שורת תאי סרטן השד (ים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג או transfect הקו הרצוי תאי סרטן השד (ים) עם מבנה כתב בלוציפראז-GFP. הניסויים הבאים בוצעו באמצעות מד&quot;א MB-231 וקווי MCF-7 בסרטן שד תא מהונדס עבור הביטוי היציב של לוציפראז גחלילית (fLuc) וחלבון משופר ירוק ניאון (EGFP) על ידי transfection עם הפלסמיד transposon היפיפה הנרדם pKT2 / LuBiG וPK פלסמיד transposase / hUbiC-SB11 45,46. הערה: שורות תאי transfected מכונות מד&quot;א MB-231-fLuc-EGFP, וMCF-7-fLuc-EGFP. </li></ol> 2. רקמות בידוד Fragments מראשי הירך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניתוח THR, לאסוף את ראש עצם הירך שהושלך במכל סטרילי המלא בתמיסת מלח פיסיולוגי. העבר את הדגימה למעבדה ולעבד אותו בתוך 1-3 שעות של ניתוח. הערה: אם יש עיכוב בעיבוד, הנח את הדגימה על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אזור עבודה על ידי הצבת את הפריטים הבאים על מחצלת סופגת בברדס בתרבית רקמת זרימה למינרית: כפפות סטריליות, rongeur כירורגית, מלקחיים, כוס עם isopropanol 70% כדי לשטוף כלים, וכלי תרבית הרקמה כמפורט להלן עבור כל סוג של ניסוי . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לובש כפפה כירורגית סטרילית להחזיק את הראש עצם הירך העגולה ביד אחת, להשתמש בrongeur ביד השנייה כדי לחלץ עצמות trabecular של גודל רצוי (~ 2-5 מ&quot;מ) מהפיר העליון החשוף של עצם הירך. העבר את שברי עצם לתוך כלי התרבות (למשל, 6, 12, או 24 גם צלחת תרבית רקמה או תא הגירה), בהתאם לסוג של הפצה, colניסוי onization או הגירה, כפי שתואר בשלבי 3, 4 או 5. הערה: שברי רקמת עצם צריך להיות שנקטפו כמתואר לעיל לאחר השלמת השלבים הראשוניים של כל assay שגשוג, קולוניזציה או הגירה ספציפית. שברים ינועו בגודל כפי שמוצג באיור 2. אפשר לשקול שברים לפני או אחרי ניסויים לצורך התקינה. </li></ol> 3. תאי סרטן שד culturing-Co בסמוך לברי עצמות כדי למדוד התפשטות תאי שד באמצעות BLI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הניסוי, להכין השעיה המכילה 2 x 10 5 תאי סרטן השד / 50 μl, ולהכין את התקעים של שעוות עצם ללשתק שברי עצמות בתרבות. לחתוך קצה micropipette P200 ל -3 חלקים ולהשתמש בקצה הצר של החתיכה בגודלה באופן &quot;עוגייה מחתך&quot; לחתוך חתיכות קטנות (~ מ&quot;ג 35) של שעוות עצם. השתמש בקצה הרחב של החתיכה הקטנה ביותר כדי להוציא את תקעי שעוות עצם לתוך צלחת פטרילאחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת שעוות עצם בכיוון השעה 12 כל טוב ולחץ בעדינות כלפי מטה עם אצבע עטויה בכפפה סטרילית-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של השעיה תא המכילה 1 x 10 5 תאי סרטן השד בDMEM-10 FBS% + פן-דלקת במרכז היטב בכל צלחת 6-היטב. (לחלופין, תאי זרע בדפוס פיזר אם תרצה בכך.) מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם מצורף תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בר עצם 1 על 1 חתיכה של שעוות עצם לכל גם ניסיוני ולהפעיל לחץ עדין עם rongeur כדי לאבטח אותו. לבצע ניסויים בשלושה עותקים כך ש3 שברי עצמות מדגימת THR נתון מונחים לשלוש בארות העליונים, בעוד שלוש הבארות התחתונה מכילות שעוות עצם רק כפקדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 5 מיליליטר, בעדינות ובאיטיות לספק 5 מיליליטר של DMEM-10% FBS לצד השני של כל היטב כדי למנוע פירוק תאי שד או שברי עצמות. מניחים את הצלחת ב-3776; תרבית רקמת חממת C עבור 20-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע הדמיה פליטת אור (BLI) להסיר את הצלחת מן החממה ולהוסיף מצע luciferin (כדי להשיג ריכוז של 300 מיקרוגרם / מיליליטר) היטב כל אחד. תמונת הצלחת מייד על IVIS הדמיה פלטפורמה באמצעות הפרמטרים הבאים: f-stop של 1, binning הקטנה, זמן חשיפה של 1 שניות, רמת ד מדוד את עוצמת האות של כל כן זוהר ממוצע (פוטונים / שני / סנטימטר מרובע / סטרדיאן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת הדמיה להגדיר אזורים של העניין (ROI) לכמת את זוהר הממוצע לכל בארות הניסיוניות ושליטה. ערכי זוהר ממוצע יצוא לגיליון Excel כדי לבצע סטטיסטיקה וליצור גרפים. </li></ol> 4. תאי סרטן שד culturing-Co זרע ישירות על גבי שברי עצמות לחקר התיישבות ומספר נייד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים למקום שברי עצמות ישירות לתוך הבארות הריקות של צלחת תרבית רקמת 24 גם (בר 1 / טובים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פְּעִיםette אגל השעיה תא 50 μl של DMEM-10% FBS המכיל 1 X 03-6 אוקטובר תאי סרטן השד באופן ישיר על גבי כל בר עצם. מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם מצורף תא. בעדינות להוסיף 1-2 מיליליטר DMEM-10% FBS לצד השני של כל גם כזה שהבר הוא שקוע כולו במדיום. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממת 37 ° C 20-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להשתמש במלקחיים כדי להעביר כל קטע רקמת עצם לצלחת 24 גם טרי המכילה 1 מיליליטר DMEM-10% FBS בכל טוב. כדי לבצע BLI, בצע את השלבים 3.6-3.7 לעיל. בנוסף, ניתן לראות שברים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או סמוק להשיג את אוכלוסיית מח לניתוחים של מספרי תאי סרטן השד ומאפיינים כמתואר בשלב 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את שברים שלמים להערכה איכותית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הבא BLI, פיפטה 5 μl של פתרון תיוג בביספוספונטים ניאון (מראשpared על פי הוראות היצרן) לכל אחד גם לתייג spicules mineralized של שברי העצמות. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת החממה לשעת 24 נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות 24 שעות של התרבות בפתרון תיוג בביספוספונטים ניאון, להשתמש במלקחיים כדי להעביר את שברי צלחות תרבית רקמה המכילות בינוני פנול אדום-חופשית ונוף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגדר GFP תמונה (485 ננומטר) ותווית בביספוספונטים (680 ננומטר). </li></ol> 5. מדידת הגירה של תאי סרטן השד לברי רקמת עצם והעצם בתרבית שבר Supernatants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירה לכיוון supernatant תרבית רקמת עצם. הערה: בצע ניסויים בשלושה עותקים כך ש3 ברים מדגימת THR נתון משמשות ליצירת 3 supernatants. עבור כל ניסוי, הגירה היא בהשוואה על פני שלוש בארות המכילות supernatants עצם לעומת שלוש בארות המכילות מדיום שליטה בלבד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור tis עצםלתבוע supernatants על ידי הנחת שברי עצמות לתוך הבארות של צלחת 12-היטב המכילה 2.2 מיליליטר DMEM-10% FBS בכל טוב. תרבות בתרבית רקמת חממת 37 ° C למשך 24 שעות. לסגת הבינוני ב 24 שעות ולהחליף עם 2.2 מיליליטר טרי FBS% DMEM-10. בארות שליטת פינוק המכילות DMEM-10% FBS באותה הדרך. הערה: הבינוני משתנה ב 24 שעות כדי להסיר גורמים מופרשים בתגובה לטראומה לרקמות כתוצאה מניתוח. בגלל supernatants רקמת עצם נוצרת בFBS המכיל בינוניות, בארות המכילות מדיום FBS המכיל רק כלולים לשלוט על תרומתם של FBS לנדידת תאי סרטן שד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 48 שעות, לאסוף 0.9 מיליליטר של כל supernatant / בינוני שליטה ופיפטה לתוך הבארות של צלחת מקלט. מוסיף מאוחר יותר להציב לתוך בארות אלה. דגירה את צלחת המקלט בתרבית רקמת החממה תוך זריעה מוסיף. הערה: supernatant הנותר (~ 1 מיליליטר לאחר אידוי) ניתן לאסוף עבור ניתוח של secretome פקטוrs אם תרצה בכך 44. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע מוסיף Transwell, להכניס אותם לתוך סטנדרטי, צלחת תרבית רקמת 24 גם ריקה. ההשעיה פיפטה 350 μl תא המכילה 1 x 10 5 תאי סרטן השד בDMEM-10% FBS על פני השטח העליונים, פנימי קרום של להכניס כל אחד כפי שמוצג באיור 1 א. מניחים את צלחת 24 גם מכילה מוסיף זרע לתרבית רקמת חממת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם קובץ מצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים מחוברים למוסיף, להשתמש במלקחיים כדי להעביר מוסיף לצלחת המקלט בהתאם להוראות היצרן. זווית להכניס כל אחד בעת ביצוע אותה למקלט גם כדי למנוע היווצרות בועה בין הקרום להוסיף והמקלט גם supernatant. דגירה את צלחת המקלט עם מוסיף במשך 20 שעות בתרבית רקמת חממת 37 ° C. הערה: בדוק את הצד התחתון של צלחת המקלט לבועות בין הקרום להוסיף והמקלט גם supernatant. אם בועות גלויות, להסיר את מוסיף הספציפי ומניח אותם שוב לתוך השפופרת היטב עד שאין בועות נמצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 20 מלקחיים שימוש hr להסיר מוסיף מצלחת המקלט. שימוש בהליכים בצעדים 3.6-3.7 לבצע BLI לתמונת התאים שהגרו ולמחוברים לחלק התחתון של בארות צלחת מקלט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגירה לברי רקמת עצם. הערה: בצע ניסויים בשלושה עותקים כך ש3 ברים מדגימת THR ניתנה ממוקמות לתוך 3 מוסיף נפרד, ו- 3 חרוזי זכוכית ממוקמים לתוך 3 מוסיף נפרדים כפקדים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את צלחת המקלט על ידי pipetting 0.9 מיליליטר FBS% DMEM-10 לכל אחד. הנח אותו לתרבית רקמת החממה בעת הכנה מוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרע מוסיף, להפוך אותם על פני השטח של תיבת צינור microfuge פלסטיק שיש לו מכסה. פיפטה טיפת השעיה תא 50 μl של FBS% DMEM-10 המכיל 1 x 10 5 תאי סרטן שד דirectly על פני השטח החיצוניים, תחתית כל קרום כנס (שהוא פונה כלפי מעלה במוסיף ההפוך). לכסות את תיבת צינור microfuge עם המכסה הסדוק פתוחה ולהעביר אותו לחממת רקמת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם מצורף תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תיבת צינור microfuge למכסה מנוע תרבית רקמה, ולהשתמש במלקחיים כדי להפוך את מוסיף זרע צד ימין למעלה ולהעביר אותם לתוך הבארות של צלחת המקלט. FBS 0.450 מיליליטר DMEM-10% פיפטה לכל כוס להוסיף. בעזרת מלקחיים, להעביר בר רקמת עצם אחד (~ 3 מ&quot;מ) לכל כוס להכניס מוכנה. לחלופין, להשתמש בחרוזי זכוכית בקרות שליליות כמו בבארות נוספות. מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממה במשך 20 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד הגירה, להכין צלחת תרבית רקמה סטנדרטית 24 גם המכילה 1 מיליליטר DMEM-10% FBS בכל טוב. הסר את צלחת המקלט מהחממה ולהשתמש במלקחיים כדי להעביר את שברי עצמות וחרוזים מכל להכניס לתוך בארות נפרדות של הצלחת סטנדרטית. להוסיף luciferinמצע (כדי להשיג ריכוז סופי של 300 מיקרוגרם / מיליליטר) היטב כל אחד ולבצע BLI תוך שימוש בנהלים בצעדים 3.6-3.7. </li></ol></li></ol> 6. ניתוח לפני ואחרי ניסוי נוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של מח סמוק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את בר עצם לתוך מסננת תא 70 מיקרומטר ממוקמת בחלק העליון של צינור חרוטי 50 מיליליטר. השתמש במזרק 10 מיליליטר עם מחט 25 G כדי לשטוף נמרצות הבר עם 10 מיליליטר של PBS לקבל השעיה של תאים במח בצינור חרוטי. צנטריפוגה ההשעיה התא 3 דקות ב 300 XG ו -21 מעלות צלזיוס, לשאוב supernatant ו resuspend תאי pelleted בPBS או הפתרון רצוי אחר לזרימה cytometry. הערה: כרכי Resuspension ישתנו בהתאם לגודל של התא גלולה לאחר צנטריפוגה, ויישום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מבחני כדאיות ~ 75-300 כרכי μl של PBS מתאימים, וניתן לנתח השעיות אלה באמצעות fluorescenc זמין מסחרימבחני כדאיות מבוססות דואר על פי הוראות היצרן, pipetted לתוך hemocytometer קונבנציונלי, וספרו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח cytometric זרימה או מיון המבוסס על זיהוי של תאי סרטן שד GFP חיובי, resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר PBS המכיל 2% FBS, 2 המ&quot;מ EDTA, ו -10 מ&quot;מ HEPES כך שהריכוז הוא 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H &amp; E מכתים ואימונוהיסטוכימיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבד את שברים לhematoxylin &amp; eosin (H &amp; E) מכתים ו / או אימונוהיסטוכימיה, למקם את הברים בקלטות פלסטיק שכותרתו עם עיפרון מספר 2, ולצלול במכל המלא עם 10% שנאגרו פורמלין למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות תהליך להטבעת פרפין, חתך ומכתים תוך שימוש בפרוטוקולים שיגרתי הכוללים צעד decalcification כדי להסביר את spicules mineralized בתוך כל בר. </li></ol></li></ol>

No disclosures to report.

Mehra et al. תיאר בעבר את אוסף הנתיחה שלאחר המוות וניתוח של דגימות עצם של חולי סרטן ערמונית גרורתי שנקטפו בעת הנתיחה שלאחר המוות, חושף רקמות באיכות גבוהות ואימות של השימוש בדגימות עצמות אדם ללמוד את התהליך גרורתי 47. כאן יש לנו תארנו פרוטוקולים לאיסוף, עיבוד ושימ...

מייקרו-הסביבה של הגידול להכרה רחבה כקובע קריטי של תאים סרטניים התנהגות במהלך התקדמות סרטן השד גרורתי והתפשטה 1-3. המטרה של השיטה שהוצגה כאן היא להקל על המחקר של תאי סרטן השד במייקרו-הסביבה של רקמת עצם אנושי, האתר השכיח ביותר לגרורות סרטן השד 4-6. עצם מורכב מתאי mineralized ומח 7-9, אשר שניהם נמל תאים וגורמים מופרשים מעורבים בהתקדמות גרורתי 10,11. למרות שימוש נרחב במודלים של עכברי vivo להקל על מחקרים מערכתיים של התהליך גרורתי 12-15, אינטראקציות תא בתוך השלד אינן נגישים לתצפית והפרעות ישירות. מערכות מודל ללימוד וculturing רקמות עצם עכבר ותאי מח העכבר לספק גישה טובה יותר והניבו תובנות רבות לגבי crosstalk ומנגנונים מ &#39;תאי סרטן שדetastasis של השלד העכברי 16-22. עם זאת, המחקרים הראו כי ייתכן שיש מינים ספציפיים דפוסי osteotropism לרקמת עצם 23,24. דפוסים אלה יכולים לשקף מינים ספציפיים הגלומים הבדלים במאפייני רקמת עצם, הבדלים הנובעים מאוכלוסיות מח העצם שינו בעכברי חיסון לקוי 11, ו / או גיל צעיר יחסית של עכברים המשמש בניסויים, שכולן עשויים גורמים של העצם מייקרו-סביבה. במבחנה גישות ללימוד תאי סרטן השד בשיתוף תרבויות עצם אנושיות התמקד בדרך כלל על סוגי תאי עצם ספציפיים כגון osteoblasts-נגזר מח עצם או תאי סטרומה מתורבתים כמו monolayers או בתוך מערכות מודל 3 ממדים מהונדסים 25-35. למרות שמודלי תרבית תאים 2 ממדים יצרו עמוד התווך של במבחנה גישות לחקר סרטן, זה כבר זמן רב הכיר בכך שהתנהגות התא משתנה מן היסוד במ &#39;onolayer מערכות תרבות 18,36,37. זה הוביל לפיתוח של מייקרו-סביבות מהונדסות המחקות את המורכבות של רקמות חיות 3 ממדים, כולל מטריצה ​​ומודלים מבוססי פיגום המורכב מחומרים טבעיים כמו קולגן, או פולימרים סינטטיים שנזרעו עם סוגי תאים מסוימים ליצירת מייקרו-סביבות כמו רקמה- 36-41. גם גישות מהונדסות כללו שימוש בפלטפורמות bioreactor לשלוט וללמוד את הסביבה ההורמונלית של מייקרו-הסביבה 18,19,41-43. למרות שמודלים וbioreactors biomimetic לספק אלמנטים רבים של מייקרו-סביבת רקמה מורכבת בסביבה מבוקרת, ויושמו בהצלחה על מנת לקדם את המחקר של גרורות סרטן השד לעצם 18,19,35,42,43, מערכות מודל מהונדסות בדרך כלל אינן לשלב הספקטרום המלא של סוגי תאים ורכיבי מטריצה ​​תאיים הנוכחיים בסביבת עצם הילידים. עד לאחרונה, סרטן השדתאים לא נחקרו במייקרו-הסביבה המקומית, שלם, 3 ממדים של רקמות עצם אנושיות. לאחרונה דיווחו על ההתפתחות של מודל שיתוף תרבות באמצעות שברי רקמה אנושיים עצם מבודד מסך החלפת מפרק ירך ניתוח (THR) דגימות 44. דגימות אלה נמל שני תאי mineralized ומח הצורך ללמוד מנגנוני מיקרו-גרורות בתרבות טווח קצרה. בעבודה קודמת הקמנו הוכחה של עיקרון לשימוש בהדמית פליטת אור (BLI) כדי לפקח על ההתפשטות של תאים (מד&quot;א MB-231-fLuc) שיתוף תרבותי עם שברי עצמות 44 להביע לוציפראז סרטן השד. כאן אנו מציגים מפורטים פרוטוקולי ניסוי ללימוד התפשטות תאי סרטן שד, קולוניזציה, והגירה בהקשר של מייקרו-הסביבה המקומית באמצעות explants רקמת עצם אנושי. ראשית אנו מציגים פרוטוקול לתאי סרטן שד שיתוף culturing סמוכים לברי עצמות למדוד שדהתפשטות תאים באמצעות BLI. בסעיף זה, השעיות תא שד הם זורעים ככתמי תא 6 צלחות גם בסמוך לברי עצמות, שהם משותקים על ידי חתיכות של שעוות עצם. בארות בקרה מכילות שעוות עצם, אך לא שבר עצם. ברגע שכתמי תא לצרף, בינוני הוא הוסיף את הצלחת היא בתרבית למשך 24 שעות, לאחר שעוצמת אות bioluminescent (הקשורים במספר תא) נמדדת עם BLI. בשלב הבא אנו מציגים שיטות לתאי סרטן שד culturing-שיתוף זרע ישירות על גבי שברי עצמות ללמוד קולוניזציה ושגשוג. כאן השעיות תא השד pipetted ישירות על גבי שברי רקמת העצם, שנמצאים תחת פיקוח בתרבות על ידי BLI ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לאורך זמן כדי לעקוב אחר קולוניזציה ומספר תא. בשיטה זו, תא מוח יכול להיות סמוק מברי עצמות בכל נקודה לניתוח של תאי סרטן השד יישבו על ידי זרימת זמן cytometry, או מבחני כדאיות מח. בנוסף, אנו מבטליםסופר שתי גישות שונות למדידת נדידת תאי סרטן השד. בשיטה הראשונה צעדים מפורטים למדידת הגירה כלפי supernatants תרבית רקמת עצם. בפרוטוקול זה תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים הפנימיים, העליונים של Transwell להכניס קרומים עם גודל נקבובית 8 מיקרומטר (כפי שמוצגים באיור 1 א). לאחר מכן מוסיף ממוקמים לתוך צלחת מקלט עם בארות המכילות supernatant רקמת עצם או בינוני שליטה. במהלך תקופת דגירה 20 שעות, מספר קטן של תאי סרטן השד להעביר דרך הממברנות להכניס לתוך בארות תרבית הרקמה הנמוכות שבו הם מייחסים לגילוי על ידי BLI. בשיטה השנייה הגירת תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים התחתונים, החיצוניים של קרומים להוסיף Transwell. שברי רקמת עצם ממוקמים לתוך הכוסות להוסיף ותאי סרטן השד להעביר דרך ממברנות ליישב את שברי עצמות (כפי שמוצגים באיור 1), שלאחר מכן צילם באמצעות BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

עצם הוא האתר הנפוץ ביותר של גרורות סרטן השד. למרות שזה מקובל שסרטן השפעות מייקרו-סביבת התנהגות התא, מעט מאוד ידוע על מאפייני סרטן שד תא והתנהגויות בתוך מייקרו-הסביבה המקומית של רקמת עצם אנושית. פיתחנו גישות כדי לעקוב אחר, לכמת ולווסת את תאי סרטן השד אנושיים במייקרו-הסביבה של שברים בתרבית רקמת עצם אנושיים מבודדים מראשי הירך הושלכו הבאים כולל ניתוחי החלפת מפרק ירך. שימוש בתאי סרטן השד מהונדס ללוציפראז ומשופר חלבון פלואורסצנטי ביטוי ירוק (EGFP), אנו יכולים לכמת reproducibly דפוסי הגירה והתפשטות שימוש בהדמית פליטת אור (BLI), אינטראקציות תא מסלול בתוך שברי העצמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולהעריך את תאי שד לאחר קולוניזציה עם cytometry זרימה. היתרונות העיקריים של מודל זה כוללים: 1) microe ילידים, ארכיטקטוני שלם רקמהnvironment הכולל סוגי תאים אנושיים רלוונטיים, ו- 2) גישה ישירה למייקרו-הסביבה, המאפשר כמותית מהירה וניטור איכותי והפרעות של נכסי שד ותאי עצם, התנהגויות ואינטראקציות. מגבלה העיקרית, כיום, היא הכדאיות סופית של שברי הרקמות, אשר מגביל את החלון של מחקר לתרבות לטווח קצר. יישומים של מערכת המודל כוללים מחקר על הביולוגיה הבסיסית של סרטן השד וגידולים ממאירים המבקש עצם אחרים בתוך הנישה גרורתי, ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות למקד ביעילות תאי סרטן השד ברקמות עצם.

בידוד ברי רקמה מראשי הירך ראש עצם הירך נאסף ממספר שווה של גברים ונשים חולים (44-90 שנים) שעבר ניתוח להחלפת מפרק ירך בחירה במחלקה לכירורגיה אורטופדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. כל ראש עצם הירך הושלך מכיל חלק קטן של עצם ה...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K Views.  Stanford University School of Medicine.  פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית. 

Video: Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

השימוש במערכי חלבון שלב הפוכים (RPPA) לחקור וריאצית ביטוי חלבון בתוך הסרטן של תאי כליה בודד

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...