ويدعم هذا العمل من قبل BRC الامبراطوري، والمعهد الوطني للبحوث الصحية، والعمل لمكافحة السرطان مع إشارة خاصة إلى هيلاري كرافت والسير دوغلاس مايرز.

الإجراءات أدناه وقد تمت الموافقة على أخلاقيا من قبل كلية امبريال في لندن. 1. توليد Mammospheres الابتدائية من الثدي البشري خطوط الخلية السرطانية ملاحظة: نفذ الخطوات التالية تحت غطاء الثقافة العقيمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Mammosphere وسائل الإعلام التي تحتوي على DMEM / F12 تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، و 100 U / الستربتومايسين مل. إعداد وسائل الإعلام كاملة فورا قبل الاستخدام عن طريق إضافة 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة المؤتلف الإنسان (EGF، سيغما)، و 10 نانوغرام / مل عامل أساسي من حقوق الإنسان المؤتلف نمو الخلايا الليفية (bFGF، أنظمة R &amp; D) و1X B27 الملحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام نضح من قارورة تحتوي على MCF-7 أو MDA-MB-231 الخلايا الملتصقة (أو خط خلايا سرطان الثدي من اختيارك، 70-80٪ التقاء)، ويغسل مرتين في برنامج تلفزيوني 1X، ويعرض للتريبسين الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الطرد المركزي في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. الخلايا طاف و resuspend صب في 1-5 مل من وسائل الإعلام mammosphere. ماصةصعودا وهبوطا وإذا كان استخدام الضروري 40 ميكرون الغطاء مصفاة الخلية مرشح للحصول على تعليق وحيد الخلية. استخدام عدادة الكريات لضمان وشكلت تعليق خلية واحدة (إذا لم يكن كذلك، استخدام 25 G الإبرة إلى حقنة تعليق خلية تصل إلى 3 مرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر عزل CD44 + CD24- فرعية الخلوية عبر FACS باستخدام مكافحة CD24-فيكوإيريترين (PE) وثيوسيانات (FITC) الاجسام المضادة 9 مكافحة CD44-فلوريسئين. بدلا من ذلك، عزل هؤلاء السكان الذين يستخدمون خلية المغناطيسي تنشيط الفرز (MACS) مع نظام مكافحة CD44 وميكروبيدات مكافحة CD24-البيوتين مجتمعة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أداء اختيار الإيجابية باستخدام أعمدة LS، واختيار السلبية باستخدام أعمدة LD وتأكيد الظواهر من جميع الخلايا المعزولة بسبب التدفق الخلوي 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احسب عدد خلايا قابلة للحياة لكل مل باستخدام التريبان الأزرق. يتم احتساب بقاء الخلية حيث بلغ عدد خلايا قابلة للحياة مقسوما على العدد الكلي للخلايا داخل شبكات على hemocy: ملاحظةtometer. وتعتبر الخلايا التي تناول الأزرق التريبان غير قابلة للحياة. يتم استخدام الإجراء التالي لتحديد بدقة نسبة خلايا قابلة للحياة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل 0.4٪ من اللون الأزرق التريبان في برنامج تلفزيوني. إضافة 0.1 مل من محلول المخزون التريبان الأزرق إلى 1 مل من الخلايا. تحميل عدادة الكريات وفحص على الفور تحت المجهر في التكبير المنخفض. حساب عدد من مجموع الخلايا وعدد الخلايا تلطيخ الزرقاء. خلايا قابلة للحياة = [1.00 - (عدد الخلايا الزرقاء ÷ عدد مجموع الخلايا)] × 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب عدد من خلايا قابلة للحياة في مل من الثقافة، استخدم الصيغة أدناه. تذكر أن تصحيح لعامل التخفيف. عدد خلايا قابلة للحياة × 10 4 × 1.1 = خلية / مل الثقافة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> و resuspend كمية محدد مسبقا من الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام mammosphere كاملة في كل بئر من 6 جيدا منخفضة للغاية لوحة ملتصقة. كثافة البذر هي عادة 500-4،000 خلية / سم 2 خلية لكل بئر. استخدام اختياريا لومرفق ث 24 لوحات بشكل جيد في حين البذر الخلايا في نفس كثافة في 0.5 مل من وسائل الإعلام. ملاحظة: نوصي تعظيم الاستفادة من كثافة البذر والوقت للثقافة لكل خطوط الخلايا من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان-مرفق منخفض جدا 6 لوحات جيدا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 5-10 أيام (اعتمادا على خط الخلية وحجم mammospheres) من دون إزعاج لوحات، ولا سيما خلال مرحلة النمو من 5 أيام الأولى . </li></ol> 2. جيل من Mammospheres الابتدائية من سرطان الثدي البشري العينات السريرية ملاحظة: أنسجة سرطان الثدي البشرية يمكن الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة لإزالة أورام الثدي. متجر الأنسجة على الجليد لمدة تصل إلى 24 ساعة في 50 مل أنابيب معقمة في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على 100 U / البنسلين مل و 100 U / مل الستربتومايسين. نفذ الخطوات التالية تحت غطاء الثقافة العقيمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينة إلى 100 ملم الأنسجة طبق بتري مع كمية صغيرة من وسائل الاعلام. ازالتهاالبريد الأنسجة الدهنية باستخدام مقص معقم، scapel وملاقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2-3 مل من DMEM / F12 واللحم المفروم العينة إلى 1 ملم 3 قطع مع scapel معقم أو شفرة حلاقة حتى لا تظل القطع الكبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وقطع الأنسجة في مرحلة ما قبل درجة حرارة 10 مل DMEM التي تحتوي على الانزيمات المحللة للبروتين (3،000 U / كولاجيناز مل و 1،000 U / هيالورونيداز مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في شاكر دوارة حتى يتم هضمها جميع أجزاء الأنسجة. عادة الهضم الكامل يأخذ الفترة من 1-3 ساعة. ضبط الوقت الهضم وفقا لأحرف المرضية للأورام. (على سبيل المثال غدية الثدي عادة ما يكون أصعب للهضم مقارنة سرطان موسينية التي هي أكثر هشاشة ويحتاج وقت أقصر الهضم). تقييم درجة الهضم كل ساعة ونصف من خلال مراقبة 20 ميكرولتر تعليق تحت عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للشظايا من رسوبيات لمدة 5 دقائق، ثم نقل طاف في 15 مل مخروطي أنبوب البولي بروبلين وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في غرفة تيمperature. صب بعناية من الخلايا وطاف resuspend في 1-5 مل من وسائل الإعلام mammosphere. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 1،1-1،4 المذكورة أعلاه للخطوط الخلايا للحصول على لوحة وحيدة الخلية تعليق. تمر الخلايا من خلال 25 G المحاقن بحد أقصى 2 مرات إذا لزم الأمر للحد من الخلايا الضارة. </li></ol> 3. Mammosphere تشكيل الكفاءة (٪) حساب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة والثقافة، والاعتماد على mammospheres (أكبر من 40 ميكرومتر) قطر تحت المجهر في 40X التكبير. رقميا صورة 5 حقول عشوائية باستخدام كاميرا رقمية على مجهر الضوء وتحديد حجم mammospheres باستخدام برنامج الاستحواذ. استخدام أي صورة برامج التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب Mammosphere تشكيل الكفاءة (MFE٪) باستخدام المعادلة التالية: MFE (٪) = (# من mammospheres لكل بئر) / (# الخلايا المصنف لكل بئر) × 100 </li></ol> 4. الركض المسلسل من Mammospheres للتقييم الذاتي-تجديد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; ماصة وسائل الإعلام التي تحتوي على mammospheres من كل بئر في أنبوب 15 مل. غسل الآبار مع PBS وإضافة إلى وسائل الإعلام التي تم جمعها. أجهزة الطرد المركزي في 115 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من قبل تحسنت بنسبة 0.5٪ التربسين / EDTA 0.2٪. احتضان لمدة 2-3 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من FCS لتحييد التربسين. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام mammospheres، pipetting صعودا وهبوطا إلى تفصيل المجالات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا مع عدادة الكريات وتحديد ما إذا الخلايا في تعليق خلية واحدة. إذا لم تمر عبر 25 G المحاقن تصل إلى 3 مرات للحصول على خلايا واحدة. البذور الخلايا في فائقة مرفق منخفض وحة 6 جيدا جديدة في نفس الكثافة المستخدمة في الجيل الأول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 5-10 أيام، عد المجالات&gt; 40 ميكرون وحساب الكفاءة تشكيل المجال باستخدام الصيغة ذكرت من قبل. </li></ol>

<ol>
	<li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epigenetic+switch+involving+NF-kappaB,+Lin28,+Let-7+MicroRNA,+and+IL6.">An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6.</a> Cell. 139 (4), 693-706 (2009).</li><li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+formation+of+breast+cancer+stem+cells+and+their+dynamic+equilibrium+with+non-stem+cancer+cells+via+IL6+secretion.">Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).</li><li>Visvader, J. E., Lindeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+current+status+and+evolving+complexities.">Cancer stem cells: current status and evolving complexities.</a> Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).</li><li>Rosen, J. M., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+increasing+complexity+of+the+cancer+stem+cell+paradigm.">The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm.</a> Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).</li><li>Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL6-mediated+suppression+of+miR-200c+directs+constitutive+activation+of+inflammatory+signaling+circuit+driving+transformation+and+tumorigenesis.">IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis.</a> Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).</li><li>Chen, J., Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy.">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li><li>Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+mode+of+tumour+growth+by+clonal+analysis.">Defining the mode of tumour growth by clonal analysis.</a> Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).</li><li>Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+Lgr5++stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas.">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li><li>Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+/CD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties:+an+early+step+necessary+for+metastasis.">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).</li><li>Ginestier, C., Hur, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome.">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li><li>Liu, S., Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts.">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li><li>Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem+/+progenitor+cells.">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells.</a> Genes Dev. , 1253-1270 (2003).</li><li>Ponti, D., Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem/progenitor+cell+properties.">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).</li><li>Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52 (2008).</li><li>Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+breast+cancer+stem+cells+by+knockdown+of+CD44:+promising+differentiation+therapy.">Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy.</a> J Transl Med. 9 (1), 209 (2011).</li><li>Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammosphere+formation+in+breast+carcinoma+cell+lines+depends+upon+expression+of+E-cadherin.">Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin.</a> PloS one. 8 (10), e77281 (2013).</li><li>Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Don&#8217;t+look:+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies.">Don&#8217;t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+mammary+gland+stem+cells.">Detection and analysis of mammary gland stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).</li><li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model.">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li><li>Al-Hajj, M., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+solid+tumor+stem+cells.">Self-renewal and solid tumor stem cells.</a> Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).</li><li>Yu, F., Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=let-7+regulates+self+renewal+and+tumorigenicity+of+breast+cancer+cells.">let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.</a> Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).</li></ol>

The authors declare that there is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of this article.

يعتمد تقييم نجاح mammospheres الابتدائي والثانوي على الخلايا التي مطلي بكثافات منخفضة بما فيه الكفاية أن mammospheres شكل من الحيوانات المستنسخة واحدة، مع الحد الأدنى من المجال التجميع. لكن بكثافات التي هي منخفضة جدا، قليل جدا mammospheres قد شكل لتمييز تأثيرات المعالجات الإحصائية. ...

وجود الأنساب الخلية السرطانية برئاسة الخلايا الجذعية السرطانية الشبيهة الجذعية قد أضاف إلى حد كبير في فهمنا للورم عدم التجانس. في حين أن بعض التنوع المظهري في الأورام لا تنشأ من ثمرة نسيلي من الحيوانات المستنسخة متميزة وراثيا، يظهر عنصر جوهري أن تنجم عن الاختلافات جينية: يمكن أن الخلايا السرطانية الانتقالية (في بعض الأحيان عكسية) بين الجذعية، والسلف، والدول المتباينة عبر تفعيل أو قمع جين معين برامج التعبير 1 - 3. قد تعكس هذه الخلية العوامل الجوهرية أو خارجي، مما يعكس برنامج التعبير الجيني يجري أعرب حاليا في زنزانة مع إشارات لها autocrine الناتجة بالتزامن مع إشارات نظير الصماوي من مرض السرطان، اللحمية أو الخلايا المناعية المجاورة تقديم عوامل تغييري، والظروف microenviromental مثل درجة نقص الأكسجة 2،4،5. على الرغم من أن النسب تتبع النهج المبتكرة<html> تتقدم قدرتنا على دراسة الخلايا الجذعية السرطانية في الجسم الحي المفترضة في من مكانة 6-8، تبقى المقايسات تشكيل المجال نهج شعبية ومريحة لتقدير إمكانات خلايا سرطان الثدي &quot;تتصرف مثل الخلايا الجذعية، على الأقل وفقا للشروط الفحص المستخدمة. وكثيرا ما يستخدم جنبا إلى جنب مع أساليب بأثر رجعي للخلايا الجذعية السرطانية تنقية، من خلال التعبير عنها من علامات غشاء CD44 CD24 و9، ومستويات نشاط الإنزيم ALDH (ألدهيد نازعة) 10، علامات التي تم اقتراحها لتتوافق مع أكثر mesenchymal- والظهارية الخلايا الجذعية السرطانية موازية على التوالي 11. وقد تم تطوير هذا النهج تشكيل المجال لأول مرة كما مقايسة neurosphere، مما يتيح نمو الخلايا الجذعية المفترضة من الحيوانات المستنسخة واحدة في غير ملتصقة، ظروف خالية المصل مع إضافة عامل النمو الظهاري (EGF) 12، في وقت لاحق يجري تطبيقها بشكل مفيد إلى وضعها الطبيعي وسرطانية أنسجة الثدي. ق ق = &quot;jove_content&quot;&gt; هوية الخلية مؤسس تشكيل المجال، وأنواع الخلايا المختلطة المكونة لكتلة المجال، هي ذات الصلة لالاستدلالات التي يمكن أن تكون مصنوعة من mammo-، أو غيرها من مجال تشكيل المقايسات. الخلايا على المدى الطويل العظام هادئة الحسنة الجذعية، يعتقد للراحة في مرحلة G0، سوف لا تواجه مزيج دقيق من العوامل التي من شأنها أن صالح التنشيط في الجسم الحي. الفحص mammosphere بدلا تمكن من نمو الخلايا إما معلقا لتقسيم الإنقسامية أو تقسيم بالفعل 13. هذه الأسلاف، وإن لم يكن خلية هادئة حقا، قد يكون مرحلة الخلية التي يتكاثر مع mitogens EGF وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) المستخدمة في الفحص. ومع ذلك، أنها تحتوي على مجموعة من الجذعية تنشيط الخلايا المرتبطة مسارات الإشارات 14. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معدل تكونها يتصل tumorigenicity من الأنسجة التي أخذت من، عندما تقاس قوتها في المقايسات تخفيف محدود في xenografts الماوس 2،15،16 &lt;/ سوب&gt;. هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لعزل الخلايا واحد وتوليد mammospheres الأساسي من كل من خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية والعينات السريرية للأورام الثدي. وصفنا أيضا كيفية تنفيذ الممرات المسلسل mammospheres الأولية لتقييم التجديد الذاتي، وكيفية حساب المجال تشكيل الكفاءة التي تسمح المقارنة بين الكثافة البذر مختلفة (انظر المخطط في الشكل 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1049">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:625px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:625px;">2mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:625px;">100U/ml Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:625px;">20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:625px;">20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:625px;">1x B27 supplement&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphate buffered saline (PBS);</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td>12399902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;0.5% trypsin-0.2%EDTA;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:139px;">First Link UK</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Trypan Blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Low attachment 6 well plates</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td>CLS3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase type 1A</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile razor blades</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12443170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:625px;">Sterile scalpel</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11758353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:625px;">Sterile micro-dissecting scissors</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3146</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines

وعلى غرار الأنسجة السليمة، وكثير من الدم والأورام الخبيثة الصلبة ويعتقد الآن أن يتم تنظيم هرمي، مع مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية الشبيهة الجذعية التي تجدد الذاتي بينما مما أدى إلى سلالة أكثر متباينة. فهم واستهداف هذه الخلايا الجذعية السرطانية في سرطان الثدي، والتي قد تكون في حوزتها تعزيز chemo- والمقاومة الراديو مقارنة مع غير الجذعية للورم بكميات كبيرة، وأصبحت مساحة البحثية الهامة. علامات بما في ذلك CD44، CD24، والنشاط ALDH يمكن تقييم باستخدام مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) لعزل خلايا مستقبلي يتم عرضها تعزيز tumorigenicity عندما زرعها في الفئران المناعة: أصبح الفحص mammosphere أيضا تستخدم على نطاق واسع لقدرته على تحديد بأثر رجعي sphere- تشكيل الخلايا التي وضع من جذع واحد تشبه الخلايا المستنسخة. نحن هنا تحديد النهج لزراعة المناسبة من mammospheres من خطوط الخلايا أو عينات المرضى الأولية، والركض بها وحسابات لتقدير المجال وكفاءة orming (SFE). أولا نحن مناقشة الاعتبارات والعثرات الرئيسية في تخطيط وتفسير التجارب mammosphere المناسب.

عينات مختلفة أو تلك التي تتعرض للعلاجات مختلفة قد تختلف في عدد mammospheres&gt; 40 ميكرون التي تشكل بعد تطبيع للخلايا الأولية المصنف. حساب mammosphere تشكيل الكفاءة (MFE) لكل معاملة تزرع في ثلاث نسخ. وهذا يتيح التجارب مع كثافة البذر مختلفة ليتم مقارنتها. هو أفضل عرض البيانات على الرس?...

Watch this Scientific Journal Video about Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines at JoVE.com

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Mammosphere تشكيل الفحص من الثدي البشري سرطان الأنسجة وخطوط الخلايا

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

mammosphere-formation-assay-from-human-breast-cancer-tissues-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

33.0K Views.  Imperial College London. Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Video: Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

الإنسان الخلية السرطانية الهرموني العصبي خطوط بمثابة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الإنسان علاج ورم الغدد الصم العصبية

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

تجهيز رأب الثدي لحد من استئصال الثدي والأنسجة البشرية للثقافة الخليوي

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا الثديية سابق للورم ظهاري الأولية المستمدة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا لسرطان الثدي

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

استخدام البروتين عكس صالحة المرحلة (RPPA) لاستكشاف البروتين في التعبير التغير فردية سرطان الخلايا الكلوية

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

تشكيل الظهارة البروستاتا الذي يصيب الانسان عن طريق إعادة التركيب الأنسجة من القوارض البولي التناسلي اللحمة المتوسطة الجيوب الأنفية والخلايا الجذعية البشرية

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

التنميط من MicroRNAs الاستروجين التنظيم في خلايا سرطان الثدي

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

الكمي لسرطان الثدي الغزو خلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) نموذج

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

لتخصيب Chemoresistant سرطان المبيض الخلايا الجذعية من خطوط الخلايا البشرية

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لدراسة هرمون العمل في الثدي البشري

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little is known about breast cancer cell properties and behaviors within the native microenvironment of human bone tissue.We have developed approaches to track, quantify and modulate human breast cancer cells within the microenvironment of cultured human bone tissue fragments isolated from discarded femoral heads following total hip replacement surgeries. Using breast cancer cells engineered for luciferase and enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression, we are able to reproducibly quantitate migration and proliferation patterns using bioluminescence imaging (BLI), track cell interactions within the bone fragments using fluorescence microscopy, and evaluate breast cells after colonization with flow cytometry. The key advantages of this model include: 1) a native, architecturally intact tissue microenvironment that includes relevant human cell types, and 2) direct access to the microenvironment, which facilitates rapid quantitative and qualitative monitoring and perturbation of breast and bone cell properties, behaviors and interactions. A primary limitation, at present, is the finite viability of the tissue fragments, which confines the window of study to short-term culture. Applications of the model system include studying the basic biology of&#160;breast cancer and other bone-seeking malignancies within the metastatic niche, and developing therapeutic strategies to effectively target breast cancer cells in bone tissues.

Protocols are described for studying breast cancer cell migration, proliferation and colonization in a human bone tissue explant model system.

طرق التثقيف عظم الفخذ الإنسان إإكسبلنتس الأنسجة لدراسة سرطان الثدي الاستعمار خلية للالمتخصصة الإنتقالية

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...