يمكن أن يزود هذا البروتوكول الباحثين الآخرين بمناهج تجريبية مباشرة وفعالة وخطوات تفصيلية لتقييم كفاءة الاستجابة الخلوية لمواد اللقاح المساعدة الجديدة. لا يمكن أن يزود الباحثين فقط بطرق تقييم خلوية محددة للمواد المساعدة ، ولكن يمكنه أيضا تحطيم طرق الاستخراج مثل مرض BM. لا تظهر هذه البروتوكولات عدم وجود سمية وتوصيل خلوي عالي فحسب ، بل توفر أيضا إجراءات مفصلة لمجال التقييم المساعد.
للبدء ، قم بتشغيل حمام مائي واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. ثم بعد جمع أنبوب من خلايا L929 المجمدة من النيتروجين السائل ، قم بإذابة الثلج بسرعة في حمام مائي. بعد سحب الخلايا في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 ملليلتر ، أضف ملليلتر من DMEM واخلطه جيدا.
أجهزة الطرد المركزي العينات في 129 × ز لمدة خمس دقائق. وبعد التخلص من المادة الطافية ، أضف ملليلتر من DMEM لإعادة تعليق الخلايا. أجهزة الطرد المركزي العينات مرة أخرى.
وبعد التخلص من المادة الطافية ، أضف ستة ملليلتر من وسيط DMEM الكامل للتعليق ، وانقله إلى دورق استزراع T25 سم مربع في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للاستزراع لمدة 48 ساعة. في اليوم 24 بعد التحصين الأولي ، أخرج الفئران من غرفة الحيوانات ، وضعها في طبق زجاجي ونقع في 75٪ كحول لمدة خمس دقائق. ضع أنابيب الطرد المركزي على رف أنبوب الطرد المركزي ، وقم بترقيم أطباق بتري التي تستخدم لمرة واحدة ، وأضف خمسة ملليلتر من PBS إلى كل طبق بتري باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر.
قم بعمل شق من ستة إلى ثمانية سنتيمترات باستخدام مقص في منتصف الجانب البطني الأيسر من الماوس. افتح الجلد المسيل للدموع لكشف جدار البطن وتحديد موقع الشريط الأحمر الطويل للطحال. بعد ذلك ، ارفع الصفاق على الجانب السفلي من الطحال بالملقط.
اقطعه واقلبه لأعلى لكشف الطحال. رفع الطحال مع ملقط. افصل النسيج الضام أسفل الطحال بمقص العيون وقم بإزالة الطحال.
ضع الطحال في طبق بتري يحتوي على خمسة ملليلتر من PBS وطاحونة مع غربال ومكبس حقنة. بعد الطحن ، انقل السائل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر مع ماصة وفقا للترقيم. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للسائل عند 453 × جم لمدة خمس دقائق.
وبعد التخلص من المادة الطافية، أضف ثلاثة ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء إلى كل أنبوب. أعد تعليق الخلايا وتحلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم أضف 10 إلى 12 ملليلتر من PBS إلى كل أنبوب.
وبعد الخلط والطرد المركزي عند 453 × جم لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأضف 10 ملليلتر من PBS إلى كل أنبوب طرد مركزي وأعد تعليق الخلايا. خذ 20 ميكرولترا من كل عينة في بئر من لوحة عد الخلايا وسجل عدد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلايا الآلي. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 453 × جم لمدة خمس دقائق.
وبعد التخلص من المادة الطافية ، قم بتخفيفها إلى 2.5 × 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر باستخدام وسيط RF10 وأضفها إلى صفيحة 96 بئرا بمعدل 100 ميكرولتر لكل بئر. قطع شق من ستة إلى ثمانية سنتيمترات أسفل بطن الفأر بالمقص وتثبيت طرفي الفتحة لفصلها في اتجاهات مختلفة وكشف أرجل الماوس. افصل عظم الفخذ عن جسم الفأر والساق عن المفصل.
والحفاظ على العظام سليمة من كلا الطرفين. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة المتبقية والغضاريف من المفاصل المفصلية على طرفي عظم الفخذ بالمقص والملقط. نقع عظم الفخذ في 75 ٪ الكحول لمدة خمس دقائق ثم نقع في محلول PBS معقم لغسل الكحول السطحي.
ثم قطع نهايات عظم الفخذ بالمقص وشطف نخاع العظم في طبق بتري معقم بمحلول PBS معقم ، يليه الطموح باستخدام حقنة ملليلتر. كرر الغسيل ثلاث إلى خمس مرات. بعد ذلك ، قم بالتصفية بواسطة غربال خلوي واجمع الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر.
بعد الطرد المركزي للعينات عند 290 × جم لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأضف أربعة ملليلتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء ، وأعد تعليقها وتحللها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من محلول PBS المعقم لتحييد المحللة ، وبعد الطرد المركزي عند 290 × جم لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من DMEM يحتوي على محلول 1٪ بنسلين-ستربتومايسين و 10٪ مصل بقري جنيني وعدده.
ثم أضف عامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحببة بالإضافة إلى إنترلوكين -4 إلى الوسط. اضبط تركيز الخلية على 5 × 10 إلى الخامس لكل ملليلتر وقم بتلقيح الخلايا على زلات الغطاء. بعد إضافة معلق الخلية إلى لوحة من ستة آبار بمعدل مليلتر لكل بئر ، ضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
قم بتغيير الوسيط تماما بعد يومين وقم بتغيير نصف الوسيط بعد أربعة أيام. اغمر الفئران في 75٪ كحول بعد القتل الرحيم وضعها في طبق بتري زجاجي بترتيب مرقم. مرر الفئران عبر نافذة النقل إلى غرفة العمليات المعقمة وضعها على طاولة العمليات لمدة خمس دقائق.
باستخدام المحقنة ، نضح 10 ملليلتر من المياه المالحة. قم بإمالة الفئران لأسفل عند حوالي 45 درجة وحقنها في منتصف تجويف البطن. ارسم حوالي خمسة ملليلتر من معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر لكل 10 ملليلتر وكرر الحقن ثلاث مرات.
الطرد المركزي تعليق الخلية في 129 × ز لمدة خمس دقائق للحصول على الضامة الأولية البريتوني الفأر. الخلايا الليفية L929 هي نموذج فحص مفيد لاختبار السمية في المختبر ل NOD. يمكن أن يساعد القياس الكمي لمستويات السيتوكين الالتهابية في الطحال الباحثين على فهم الاستجابة المناعية بشكل أفضل.
تعد مراقبة الخلايا الليمفاوية التائية السامة ذات البقعة المناعية المرتبطة بالإنزيم هي المعيار الذهبي لتقييم مناعة الخلايا التائية الخاصة بالمستضد في التجارب السريرية ولفحص اللقاحات المرشحة. يمكن أن تؤدي زيادة امتصاص الخلايا المتغصنة لمولد الضد إلى تعزيز الاستجابات المناعية التكيفية. تلعب البلاعم دورا مهما في تقديم مولدات الضد إلى الخلايا التائية ، بالإضافة إلى حث الخلايا الأخرى التي تقدم مولد الضد على التعبير عن جزيئات التحفيز المشترك ، وبالتالي بدء الاستجابات المناعية التكيفية.
عزل الخلايا تحت نسبة الدواء إلى عمل الخلية له أهمية قصوى.
