تم توفير التمويل لتطوير هذا البروتوكول من قبل اتحاد جنوب شرق ولاية بنسلفانيا للتعليم العالي ووزارة العلوم كابريني كلية. وجاء التمويل ودعم إضافي من جامعة أركاديا وجامعة الطاهرة. نشكر خصوصا الدكتورة كارين Snetselaar في جامعة القديس يوسف لتتكرم أخذ الصور الإلكترون المجهري من فاجات معزولة لدينا. وقدم دعم إضافي من قبل الصيادين معهد هوارد هيوز الطبي التحالف تعليم العلوم فج النهوض علم الجينوم والتطوري العلوم برنامج (SEA-فاجات).

1. إعداد الخلايا Arthobacter لفج عزل <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الفصلاء س. يشوبه KY3901 المستعمرات على لوريا Bertaini (LB) لوحة أجار المحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. اختيار مستعمرة واستخدام حلقة عقيمة لإضافته إلى 250 مل من مرق LB في قارورة الثقافة حيرة واحتضان في حاضنة تهتز في 225 دورة في الدقيقة في 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح حوالي 24 ساعة من النمو للحصول على خلايا مرحلة متأخرة الأسي / في وقت مبكر ثابتة للتجارب العدوى فج. رصد حالة نمو البكتيريا بشكل وثيق لمنع الخلايا من دخول الوسط إلى أواخر الدولة نمو ثابتة. يجب أن تتكون نمو الخلايا من OD الكثافة البصرية 600 بين 0.5 .0.7 لإجراءات العزل فج وتنقية / الخطوات الموضحة أدناه: ملاحظة. </li></ul> 2. جمع فج من عينات التربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 200-400 غرام من التربة من الموقع المطلوب. ملاحظة: بما أن البكتيريا الموجودة في Arthrobaجنس cter هي بكتريا التربة المشتركة التي وفاجات التي تصيب منهم يمكن العثور عليها في وهم منتشر في معظم أنواع التربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 مل على الأقل من فج العازلة (PB) [68 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgSO 4، و 10 ملي تريس-CL (7.5 درجة الحموضة)] إلى التربة وخلط في قارورة كبيرة بما فيه الكفاية بحيث لا يقل عن 200 مل من PB هو في طاف وقادرة على استخراجها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من قبل اثارة أو تحريكها بلطف حتى يتم وقف التنفيذ التربة والسماح للترسبات التربة ليستقر، وعادة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير &quot;استخراج التربة&quot; من خلال ورق الترشيح عن طريق الترشيح خطورة لإزالة التربة الحطام الرواسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مسحوق LB وخلط لتقديم حل 2٪ (4 ز LB مسحوق في 200 مل استخراج التربة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون عن طريق الترشيح فراغ للحصول على الترشيح العقيمة. إذا كان ذلك ممكنا، انتقل إلى الخطوة 2.7 على الفور. إذا لزم الأمر، وتخزين تصفية العينات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل المتابعة، ومع ذلك، فإن عدد الجزيئات فج قابلة للحياةسيتم تخفيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة متعددة 50 مل أجزاء من فلتر تعقيم LB / التربة استخراج الخليط الفردية 250 مل تعقيمها تهتز قوارير ثقافة حيرة باستخدام تقنيات العقيم. إضافة معقم 2.0 M CaCl 2 حل للتركيزات النهائية المرجوة (0-50 ملم) منذ فاجات الفصلاء مختلفة تنمو على النحو الأمثل في إطار مختلف الظروف CaCl 2. ملاحظة: نحن نجد أن الغالبية العظمى من فاجات الفصلاء التي حددها لنا هي ضمن مجموعة من 1 ملم، 2.5 ملم CaCl 2. ومع ذلك، نمت العديد من فاجات معزولة من قبلنا حصريا في 0 ملي CaCl 2. أو في عالية جدا CaCl 2 التركيزات. الشروع فورا إلى الخطوة 3.1. </li></ol> 3. فج عزل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-2،5 مل من أواخر الأسية / في وقت مبكر ثابتة ثقافة البكتيريا المرحلة إلى كل من قوارير. لOD 600 0،5-0،7، استخدم 1 مل من الخلايا. لOD 600 أعلى من مجرد OD من 0.7 استخدام 2.5 مل منالخلايا. ملاحظة: خلايا في النمو الأسي المرحلة عادة ما تسفر عن المزيد من فاجات والتتر أعلى من الخلايا في النمو مرحلة ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز قوارير في 250 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 24 ساعة في حاضنة تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة 24 ساعة إزالة قوارير التخصيب من الحاضنة تهتز وتمييع عينات تخصيب عشرة أضعاف في المخزن فج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء أنابيب الثقافة مع 0.5 مل من أواخر الأسية / في وقت مبكر ثابتة ثقافة البكتيريا المرحلة وإضافة كميات متنوعة من الثقافة تخصيب (5 ميكرولتر إلى 500 ميكرولتر من 10 -1 التخفيف في PB) إلى أنابيب الثقافة. ملاحظة: ومن المستحسن لاختبار مجموعة واسعة من تركيزات لأن كل عينة التربة يولد التتر فج مختلفة بعد التخصيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة CaCl 2 إلى أنابيب الثقافة لجعل تركيز النهائي يساوي الحاضر التركيز في قارورة تخصيب الأصلية. استخدام مجموعة من تركيزات مختلفة CaCl 2 لتحديد لكثير من فاجات ثإيث متفاوتة CaCl 2 التبعيات. ملاحظة: سيتم عزل معظم فاجات ضمن نطاق CaCl 2 من 1-2.5 ملي ولكن هناك فاجات معزولة أكثر على النحو الأمثل في أي مكان 0-50 ملي CaCl 2 التركيزات. وبسبب هذا فمن الأفضل أن تحقق مجموعة من CaCl 2 تركيزات إلى زيادة عدد فريدة فاجات الفصلاء معزولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 4.5 مل من LB أعلى أجار في أنبوب الثقافة ويصب الخليط على لوحة أجار LB. دوامة بلطف لتوزيع عبر لوحة بالتساوي والسماح لأعلى أجار لترسيخ لحوالي 15 دقيقة. ملاحظة: أعلى أجار يمكن تحضير دفعات أكبر (250 مل) والاضافي أعلى أجار يمكن تخزينها في RT وإعادة استخدامها لتجارب لاحقة لمدة أسبوعين على الأقل. على الرغم من أن هناك صيغ مختلفة تستخدم في صنع كبار أجار، ونحن جعل أعلى أجار باستخدام 7G / L من أجار مختلطة مع LB. مكان أعلى أجار في 60 ° C حمام الماء للاحتفاظ الحالة السائلة أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس رانه لوحة واحتضان عند درجة الحرارة المطلوبة (درجة الحرارة إلى 30 ° C) O / N إلى 48 ساعة. وتختلف هذه الظروف لتحسين لفاجات الحالية. فاجات الأكثر عزلة تأتي من لوحات المحتضنة في 30 درجة مئوية في 1-2.5 ملي CaCl 2 التركيز بعد فترة حضانة 24 ساعة. </li></ol> 4. فج تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة الاختيار الحضانة لتشكيل لوحة على لوحات. تستمر الحضانة لمدة تصل إلى 72 ساعة إذا لم ويحات واضحة أو لتحديد ما إذا كان سوف تظهر لويحات إضافية. إذا لزم الأمر، لوحات متجر مع لويحات المفترضة لمدة تصل إلى أسبوع في 4 درجات مئوية قبل المتابعة. ملاحظة: ليس من المألوف أن تجد مجموعة متنوعة من الأشكال التضاريسية لوحة مختلفة على لوحة واحدة. العثور على لويحات بعد 3 أيام من الحضانة هو ممكن ولكن نادرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية فاجات المرجوة من لويحات معزولة بشكل واضح استخدام طريقة متتالية البلاك. لمس لوحة بعصا خشبية العقيمة. خط اللوحة عن طريق تشغيل عصا خشبية من خلال لهب، allowinز العصا لتبريد لفترة وجيزة، ثم فرك العصا على لوحة أجار في اقتراح لطيف كما هو مبين في الشكل رقم 1. كرر ذلك باستخدام عصا نظيفة لكل بالمرور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، استخدم التقليدي الفحص عيار البلاك لعزل ويحات فج الفردية. الفحص عيار وحة لا تتطلب استخدام المزيد من الكواشف مثل LB أجار وLB أعلى أجار والمواد مثل لوحات بتري لعزل فج البلاك. لقد كنا ناجحة للغاية باستخدام طريقة خط وحة لكنه أسهل من الناحية الفنية لعزل ويحات الفردية باستخدام الفحص عيار البلاك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد مجزع لوحة أجار LB ثلاث مرات على الأقل، بمناسبة منطقة بأقل تركيز الجزيئات فج المفترضة وتطبيق بلطف 0.5 مل من الفصلاء و 4.5 مل من المنصهر LB أعلى أجار (التي تحتوي على نفس التركيز من كلوريد الكالسيوم مثل لوحة الأم ) وتسمح له بالانتشار بالتساوي على طبق من ذهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس واحتضان لوحة O / N. كرر وحة متتاليةمعزول تقنية لا يقل عن ثلاث مرات التكرار لضمان وجود الأنواع فج نقية. متجر لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع حسب الحاجة بين الشرائط دون خسائر كبيرة في جدوى فج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد نمت لويحات مرة واحدة المطلوب وعزل على لوحة خط النهائية، لمسة واحدة لوحة معزولة جيدا مع طرف ممص مكروى واعادة تعليق في 100 ميكرولتر PB. تمييع متسلسل هذا 10 0 الحل إلى التخفيف 10 -8 عن طريق تمرير 20 ميكرولتر من العينة إلى 180 ميكرولتر من PB الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من كل تخفيف إلى 0.5 مل من يزرع الفصلاء في أنبوب الثقافة لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT ولوحة عن طريق خلط البكتيريا المصابة مع 4.5 مل من المنصهر LB أعلى أجار التي تحتوي على نفس التركيز من CaCl 2 تستخدم لعزل فج من عينة التربة الأصلية. حفظ جميع التخفيفات التي قدمت في 4 ° C حتى اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد التخفيف المتسلسل فج اللازمة لجعل نمط الويب باستخدام عيار وحة التقليدي كماأقول. الغرض من فحص عيار البلاك هو تحديد عيار فج اللازمة للحصول على لوحة نمط الويب. تحديد نمط لوحة الويب كما تخلو في معظمها من البكتيريا ولكن تحتوي على بقايا من البكتيريا التي لم يتم حتى الآن هي lysed من قبل فاجات. إضافة 5 مل من أواخر الأسية / في وقت مبكر الثقافة الفصلاء ثابتة إلى معقمة 50 مل قارورة الثقافة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من التخفيف (التي أعطت نموذجا على شبكة الإنترنت لثقافة الفصلاء) في قارورة الثقافة والسماح للفاجات لتصيب خلايا البكتيريا لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT. خلط مع المنصهر LB أعلى أجار التي تحتوي على نفس التركيز من CaCl 2 كما تستخدم لتحديد البداية وفج لوحة 5 مل من هذا الخليط على 10 لوحات LB جديدة. السماح لترسيخ واحتضان لوحات مقلوبة في 30 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، إغراق لوحات نمط الويب مع 5 مل من PB وتخزين O / N عند 4 درجات مئوية أو 4 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية المحللة فج من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرونوتخزينها في 4 درجات مئوية. استخدام هذا المخزون فج النهائي للتجارب إضافية مثل الصور المجهر الإلكتروني من جسيمات فج، فج عزل الحمض النووي الجينومية لتحليل انزيم التقييد DNA وتسلسل الجيني باستخدام إجراءات القياسية. للتخزين على المدى الطويل من الأسهم فج، إضافة كمية متساوية من المحللة فج لالجلسرين معقم في قوارير صغيرة لحفظ الأوراق المالية في -80 ° C. ملاحظة: بالنسبة لأولئك لم تشهد مع هذه التقنيات فج، مورد العظيم هو موقع على الانترنت www.phagesdb.org الوصول إليها. </li></ol>

<ol>
	<li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Catabolic+Pathways:+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism.">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li><li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil.">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li><li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine.">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li><li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identities+of+Arthrobacter+spp.+And+Arthrobacter-Like+Bacteria+Encountered+in+Human+Clinical+Specimens.">Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).</li><li>Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Arthrobacter+Bacteriophages+and+Their+Application+to+Phage+Typing+of+Soil+Arthrobacters.">Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters.</a> Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).</li><li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Gordonia+and+Nocardia+Stabilized+Foam+Formation+by+Using+Bacteriophage+GTE7.">Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).</li><li>Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+Site-specific+Integration+Functions+of+phi+AAU2+infecting+&#8220;Arthrobacter+aureus&#8221;+C70.">Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting &#8220;Arthrobacter aureus&#8221; C70.</a> J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).</li><li>Casida, L. E., Liu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthrobacter+globiformis+and+Its+Bacteriophage+in+Soil.">Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil.</a> J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).</li><li>Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+a+Bacteriophage+of+Arthrobacter+globiformis.">Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis.</a> J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).</li><li>Twest, R., Kropinski, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water.">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li><li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG:+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria.">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li><li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells.">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li><li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age.">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

وعلى الرغم من العديد من المحاولات السابقة لعزل فاجات القادرة على إصابة المضيفين الفصلاء، كان لدينا نجاح يذكر باستخدام إجراءات تخصيب القياسية. طريقة المعمم تخصيب البكتيرية المتقدمة وتكييفها من قبل فان Twest وKropinski 10 إلى إثراء فاجات من العينات البيئية يبقى ا?...

في كل مكان من الأنواع الفصلاء في بيئات التربة يقدم عدد كبير وتنوع فاجات قابلة للعزل من هذه الأنواع من البكتيريا المضيف. أعضاء البكتيري للأسرة Acintobacteriaceae هم أبرز لمسارات تقويضي بهم من تدهور مركبات المتمردة مثل الأترازين ومختلف المبيدات الحشرية ومبيدات الأعشاب الأخرى 1،2،3. على الرغم وقد تم ذلك معظم الأبحاث باستخدام سلالات البيئية للالفصلاء، العزلات السريرية لهذا جنس وجدت في الدم والبول، والعيون، والعديد من المصادر البشرية الأخرى عن عرض التجانس النشوء والتطور 4. في حين أن هناك مجموعة واسعة بدلا من البحث عن البكتيريا الفصلاء، فقط تقرير عدد قليل من الدراسات على فاجات القادرة على إصابة أفراد هذا الجنس المتنوع. على الرغم من المثير للاهتمام، العمل المنجز سابقا على الفصلاء فاجات اللمسات على عدة مواضيع رئيسية متميزة مثل الكتابة التربة &lt;م&gt; الأنواع الفصلاء 5، والاستخدامات الصناعية بهدف الحد من رغوة الضارة في محطات معالجة الحمأة المنشطة 6، والعمل تسليط الضوء على إعادة التركيب محدد الموقع والجينات إنزيم مدمج 7. وقد استخدمت مختلف البروتوكولات تقنية تخصيب اليورانيوم لتوليد نقية فج يعزل في الأنواع الفصلاء. وتشمل الإجراءات المبكرة حضانات من التربة مع المواد السامة المضافة مثل الأملاح النيكوتين لفترات تزيد على سنة واحدة 8 مما أدى إلى فاجات القادرة على إصابة فقط A. globiformis. يسيل دراسات أجريت باستخدام التربة مع ظهرت العضوية عطوب لإنتاج فاجات اكتشافها عن طريق تقنيات فحص اللوحة، وحذف فترات حضانة طويلة 8. على الرغم من المثير للاهتمام، تم استخدام تقنية تشبه الطلاء المباشر في الماضي مما أدى إلى عدة فاجات في حين لا تزال تواجه نسبة نجاح منخفضة وخاصة من قبل المحققين 5، نقلا عن الدراسات السابقة مع معدلات النجاح منخفضة <sتصل&gt; 8. وعموما، كانت تقنيات عزل استخدمت في الماضي بارزة لديها فعالية كبيرة في الممارسة على الرغم من جنس الفصلاء تمثل التربة الهوائية الأكثر شيوعا عزل في الطبيعة 4،9،، فان Twest وKropinski 10 طرق لتخصيب الحالية لعزل فاجات من المياه والتربة مقتبس من التقنيات السابقة المستخدمة في تخصيب العزلات البكتيرية البيئية ولكن تقنيات تخصيب هذه أثبتت عدم كفاءة في عزل فاجات الفصلاء. والغرض من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو إظهار &quot;دليل على مفهوم&quot; أن أساليب التخصيب في وقت مبكر يمكن تكييفها لباستمرار وبشكل فعال عزل فاجات الفصلاء، والتغلب على التحديات التقنية السابقة المرتبطة عزل فاجات من هذا جنس البكتيريا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB Broth powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9722-2</td>
			<td>It&#39;s best to order these in bulk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td>It&#39;s best to order these in bulk.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-719A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.22 um buchner filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">430320</td>
			<td>More than 50 mL of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipets individual</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-11D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">76002844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td align="right">76002845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL pipets individual</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL pipets individual</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman qualitative filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1001-824</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized enrichment technique for the isolation of arthrobacter bacteriophage species from soil sample isolates

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

لإثبات استنساخ لتحسين تقنية تخصيب للفاجات الفصلاء، استخدمت 30 عينات من التربة مختلفة في أوقات مختلفة وأماكن خلال فصلي الربيع والصيف من عام 2014. ومن بين هذه العينات 30 التربة تم الحصول فاجات الفصلاء فريدة من 22 من عينات التربة التي تم جمعها باستخدام هذا التخصيب ...

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates at JoVE.com

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

تقنية التخصيب الأمثل للعزل<em&gt; الفصلاء</em&gt; أنواع الجراثيم من عزلات عينة التربة

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

an-optimized-enrichment-technique-for-isolation-arthrobacter

Research

JoVE Journal

Environment

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

19.3K Views.  University of the Sciences. We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

Video: An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

تصميم وتشغيل المستمر<sup&gt; 13</sup&gt; C و<sup&gt; 15</sup&gt; N غرفة صفها الموحدة لأو التفاضلية، الأيض والإنشائية، مصنع النظائر وصفها

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use due to increased demand for landscape irrigation. Improper irrigation practices and large rainfall events can result in runoff from urban landscapes which has potential to carry nutrients and sediments into local streams and lakes where they may contribute to eutrophication. A 1,000 m2 facility was constructed which consists of 24 individual 33.6 m2 field plots, each equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated urban landscapes. Runoff volumes from the first and second trials had coefficient of variability (CV) values of 38.2 and 28.7%, respectively. CV values for runoff pH, EC, and Na concentration for both trials were all under 10%. Concentrations of DOC, TDN, DON, PO4-P, K+, Mg2+, and Ca2+ had CV values less than 50% in both trials. Overall, the results of testing performed after sod installation at the facility indicated good uniformity between plots for runoff volumes and chemical constituents. The large plot size is sufficient to include much of the natural variability and therefore provides better simulation of urban landscape ecosystems.

This paper describes the design, construction, and function of a 1,000 m2 facility containing 24 individual 33.6 m2 field plots equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated home lawns.

تصميم وبناء منشأة أبحاث الجريان السطحي في المناطق الحضرية

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

أخذ العينات التربة والنيماتودا الممرضة للحشرات عزل (Steinernematidae، Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most experiments examine only two or a few levels of CA concentration and a single soil type, but if CA can be varied as a gradient from subambient to superambient concentrations on multiple soils, we can discern whether past ecosystem responses may continue linearly in the future and whether responses may vary across the landscape. The Lysimeter Carbon Dioxide Gradient Facility applies a 250 to 500 &#181;l L-1 CA gradient to Blackland prairie plant communities established on lysimeters containing clay, silty clay, and sandy soils. The gradient is created as photosynthesis by vegetation enclosed in in temperature-controlled chambers progressively depletes carbon dioxide from air flowing directionally through the chambers. Maintaining proper air flow rate, adequate photosynthetic capacity, and temperature control are critical to overcome the main limitations of the system, which are declining photosynthetic rates and increased water stress during summer. The facility is an economical alternative to other techniques of CA enrichment, successfully discerns the shape of ecosystem responses to subambient to superambient CA enrichment, and can be adapted to test for interactions of carbon dioxide with other greenhouse gases such as methane or ozone.

A CO2 Concentration Gradient Facility for Testing CO2 Enrichment and Soil Effects on Grassland Ecosystem Function

The Lysimeter Carbon Dioxide Gradient Facility creates a 250 to 500 &#181;l L-1 linear carbon dioxide gradient in temperature-controlled chambers housing grassland plant communities on clay, silty clay, and sandy soil monoliths. The facility is used to determine how past and future carbon dioxide levels affect grassland carbon cycling.

A CO<sub&gt; 2</sub&gt; مرفق تركيز متدرجة لاختبار CO<sub&gt; 2</sub&gt; الإثراء والتربة تأثيرات على وظيفة الأراضي العشبية النظام الإيكولوجي

Continuing increases in atmospheric carbon dioxide concentrations (CA) mandate techniques for examining impacts on terrestrial ecosystems. Most ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

عزل وتحليل المجتمعات الميكروبية في التربة، رهيزوسفيري، وجذور في تجارب الأعشاب المعمرة

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive harvest or expensive equipment. We present a customizable and affordable rhizobox method that allows the non-destructive visualization of root growth over time and is particularly well-suited to studying root plasticity in response to localized resource patches. The method was validated by assessing maize genotypic variation in plasticity responses to patches containing 15N-labeled legume residue. Methods are described to obtain representative developmental measurements over time, measure root length density in resource-containing and control patches, calculate root growth rates, and determine 15N recovery by plant roots and shoots. Advantages, caveats, and potential future applications of the method are also discussed. Although care must be taken to ensure that experimental conditions do not bias root growth data, the rhizobox protocol presented here yields reliable results if carried out with sufficient attention to detail.

Visualizing and measuring root growth in situ is extremely challenging. We present a customizable rhizobox method to track root development and proliferation over time in response to nutrient enrichment. This method is used to analyze maize genotypic differences in root plasticity in response to an organic nitrogen source.

وضع بروتوكول رهيزوبوكس الأمثل لتصور النمو الجذري والقدرة على الاستجابة للعناصر المغذية مترجمة

Roots are notoriously difficult to study. Soil is both a visual and mechanical barrier, making it difficult to track roots in situ without destructive ...

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

استخدام الكنورهابدية إليجانس لدراسة الآثار عبر الأجيال ومتعددة من المواد السامة

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

تصميم Microplot وإعداد عينات النباتات والتربة لتحليل النيتروجين 15

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

طريقة كهربائية لإزالة الجسيمات العضوية من التربة

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a significant role in plant growth and development by providing strength, rigidity, rate and direction of cell growth, cell shape maintenance, and protection from biotic and abiotic stressors. The cell wall is primarily composed of cellulose, lignin, hemicellulose and pectin. Recently plant cell walls have been targeted for the second-generation biofuel and bioenergy production. Specifically, the cellulose component of the plant cell wall is used for the production of cellulosic ethanol. Estimation of cellulose content of biomass is critical for fundamental and applied cell wall research. The Updegraff method is simple, robust, and the most widely used method for the estimation of crystalline cellulose content of plant biomass. The alcohol insoluble crude cell wall fraction upon treatment with Updegraff reagent eliminates the hemicellulose and lignin fractions. Later, the Updegraff reagent resistant cellulose fraction is subjected to sulfuric acid treatment to hydrolyze the cellulose homopolymer into monomeric glucose units. A regression line is developed using various concentrations of glucose and used to estimate the amount of the glucose released upon cellulose hydrolysis in the experimental samples. Finally, the cellulose content is estimated based on the amount of glucose monomers by colorimetric anthrone assay.

The Updegraff method is the most widely used method for the cellulose estimation. The main purpose of this demonstration is to provide a detailed Updegraff protocol for estimation of cellulose content in plant biomass samples.

تقدير محتوى السليلوز البلوري للكتلة الحيوية النباتية باستخدام طريقة Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...