Name: an optimized enrichment technique for the isolation of arthrobacter bacteriophage species from soil sample isolates
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
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이 프로토콜의 개발을위한 자금 조달은 고등 교육의 남동부 펜실베니아 컨소시엄 Cabrini 대학 과학 학부에 의해 제공되었다. 추가 자금 지원은 아카디아 대학과 Immaculata 대학에서왔다. 우리는 특히 친절하게 우리의 고립 된 파지의 전자 현미경 이미지 촬영을 위해 세인트 조셉 대학에서 박사 카렌 Snetselaar 감사합니다. 추가 지원은 유전체학과 진화 과학 (SEA-파지) 프로그램을 진행하는 하워드 휴즈 의학 연구소 과학 교육 얼라이언스 파지 사냥꾼에 의해 제공되었다.

파지 격리를위한 Arthobacter 세포의 1. 준비 <ul><li> 문화 박터 특검팀. KY3901 식민지 2 ~ 3 일 동안 30 ° C에서 배양 루리아 Bertaini (LB) 한천 플레이트 상에 스트리킹. 식민지를 선택하고 30 ° C에서 225 rpm으로 진탕 배양기에서 당황 문화 플라스크에 LB 배지 250 ml의에 추가하고 부화 멸균 루프를 사용합니다. </li><li> 성장의 약 24 시간이 파지 감염 실험 후반 초반 / 지수 정지상 세포를 얻을 수 있습니다. 늦은 성장 정지 상태로 들어가는 중간 세포 않도록 밀접 세균 성장​​의 상태를 모니터한다. 주 : 세포 생장 후술 파지 분리 및 정제 절차 / 단계 0.5 .0.7 사이 광학 밀도 OD (600)로 구성한다. </li></ul> 토양 샘플에서 파지 2. 컬렉션 <ol><li> 원하는 위치에서 토양의 200~400g를 수집합니다. 참고 : Arthroba 세균 이후CTER의 속을 감염 파지가에있는 토양의 대부분의 유형에 만연 될 수있다 그들과 일반적인 토양 박테리아에게 있습니다. </li><li> PB가의 있도록 최소 200 ml의 토양에 파지 버퍼 (PB) (68)의 NaCl, 10mM 황산, 10 mM 트리스 - CL (PH 7.5)] 적어도 400 ML을 추가하고 충분히 큰 플라스크에 혼합 상층 액과 추출 할 수있다. </li><li> 토양이 일시 중단 될 때까지 부드럽게 교반 또는 소용돌이에 의해 혼합 및 토양 침전물, 일반적으로 30 분을 해결 할 수 있습니다. </li><li> 토양 침전물 파편을 제거하기 위해 중력 여과 필터 종이를 통해 &quot;토양 추출물&quot;을 전달합니다. </li><li> LB 분말을 추가하고 2 % 용액 (200 ml의 토양 추출물 4g LB 분말)을 만들기 위해 혼합. </li><li> 멸균 여과 액을 얻기 위해 진공 여과에 의해 0.22 ㎛의 필터를 통해 용액을 통과. 가능하면, 즉시 2.7 단계로 진행합니다. 가능한 파지 입자의 저장 진행하기 전에 주까지 4 ° C에서 샘플을 필터링 할 필요가있는 경우, 그러나, 수감소 될 것이다. </li><li> 나누어지는 다수의 기법을 이용하여 무균 배플 배양 플라스크를 흔들면서 멸균 개별 250 ㎖ 중에 필터 멸균 LB / 토양 추출물 혼합물을 50 ml의 부분. 다른 박터 파지 다른 CaCl2를 조건 하에서 최적의 성장 때문에 원하는 최종 농도 (0-50 mM)을 멸균 2.0 M CaCl2를 솔루션을 추가합니다. 참고 : 우리는 우리가 확인 된 박터 파지의 대부분이 1 MM-2.5 mM의 염화칼슘 2의 범위 내에있는 것을 찾을 수 있습니다. 그러나, 고립 된 파지 중 일부는 매우 높은 염화칼슘이 농도에서 0 mM의 CaCl2를 불러야에서 독점적으로 우리가 성장했다. 3.1 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> 3. 파지 격리 <ol><li> 플라스크에 각각 후반 초반 / 지수 정지상 박테리아 문화의 1-2.5 ML을 추가합니다. 0.5-0.7 OD (600)의 경우, 세포를 1 ㎖를 사용합니다. 0.7의 OD보다 높은 OD (600)의 2.5 mL의 사용세포. 참고 : 지수 상 성장 세포는 일반적으로 더 파지과 정지상 성장 세포보다 더 높은 역가를 얻을 수 있습니다. </li><li> 진탕 배양기에서 약 24 시간 동안 30 ° C에서 250 rpm에서 플라스크를 흔들어. </li><li> 24 시간의 잠복기 후 흔들림이 인큐베이터에서 농축 플라스크를 제거하고 농축 샘플을 파지 버퍼에 10 배 희석. </li><li> 후반 초반 / 지수 정지상 박테리아 문화의 0.5 ml의 문화 튜브를 설정하고 다양한 농축 문화의 양 문화 튜브에 (PB의 10 -1 희석 500 μL 5 μL)를 추가합니다. 주 : 각 토양 시료를 농축 한 후에 다른 파지 역가를 생성 이후 농도의 넓은 범위를 테스트하는 것이 바람직하다. </li><li> 원래 농축 플라스크의 농도 현재까지 최종 농도가 동일하게 문화 튜브에 염화칼슘 (2)를 추가합니다. w 많은 파지를 위해 선택하는 다른 염화칼슘 2 농도의 범위를 사용하여i 번째 염화칼슘 2 종속성을 변화. 주 : 대부분의 파지는 1-2.5 mm의 염화칼슘이 범위 내에서 고립되지만 0-50 mM의 염화칼슘이 농도 어디서나 가장 최적의 고립 파지가 있습니다. 이로 인해 그것의 독특한 절연 박터 파지의 수를 최대화하기 위해 CaCl2를 농도의 범위를 확인하는 것이 최상이다. </li><li> 문화 튜브에 LB 위로 한천의 4.5 ml의 혼합 및 LB 한천 접시에 부어 준다. 균일하게 접시에 걸쳐 배포하고 약 15 분 동안 응고 최고 한천 수 있도록 부드럽게 소용돌이. 주 : 한천 큰 일괄 (250 mL) 및 추가 상부 한천 제조 할 수 인기 RT에 저장된 적어도 2 주 동안 후속 실험을 위해 재사용 될 수있다. 상단 한천을 만드는 데 사용 다른 공식이 있지만, 우리는 (LB)와 혼합 한천 7g / L을 사용하여 한천 상단을 60 ° C의 물 중탕에 넣어 상부 한천 실험 과정에서 액체 상태를 유지한다. </li><li> 반전 t그는 판과 원하는 온도 48 시간에 (온도 30 ° C) O / N 품어. 현재 파지를 최적화하려면 다음 조건이 다릅니다. 가장 고립 된 파지는 24 시간의 잠복기 후 1-2.5 mM의 염화칼슘이 농도에서 30 ° C에서 배양 접시에서 왔습니다. </li></ol> 4. 살균 정화 <ol><li> 접시에 플라크 형성을위한 24 시간 배양 검사 후. 더 플라크가 분명하지 않는 경우 최대 72 시간 동안 배양을 계속하거나 추가 플라크가 나타납니다 있는지 확인합니다. 일주일에 최대 4 ° C에서 계속 진행하기 전에에 대한 추정 플라크와 저장 판을 필요로합니다. 참고 : 한 접시에 다른 플라크 형태학의 다양한를 찾는 것은 어려운 일이 아니다. 배양 3 일 후 플라크를 찾는 것은 가능하지만 드문 경우입니다. </li><li> 줄무늬 플라크 방법을 사용하여 명확하게 고립 된 플라크에서 원하는 파지를 정화. 멸균 나무 막대기로 감사패를 터치합니다. 행진, 불꽃을 통해 나무 막대기를 실행 allowin에 의한 플라크g 스틱 간략하게 냉각하고, 그림 1과 같이 다음 부드러운 모션 한천 접시에 스틱을 바르고. 각 패스에 대한 깨끗한 스틱을 사용하여이 작업을 반복합니다. </li><li> 또한, 개별 파지 플라크를 분리하기 위해 기존의 플라크 역가 분석을 사용합니다. 플라크 역가 분석은 파지 플라크 격리를위한 페트리 접시 등의 LB 한천과 LB 위로 한천 및 재료 등 이상의 시약의 사용을 필요로한다. 우리는 행진 플라크 방법을 사용하여 매우 성공적이었다하지만 플라크 역가 분석을 사용하여 개별 플라크를 분리하는 것이 기술적으로 쉽다. </li><li> LB 한천 플레이트를 3 회 이상 스트리킹되면, 추정 된 파지 입자의 낮은 농도를 갖는 영역을 표시하고 부드럽게 상위 판으로서 염화 칼슘의 동일한 농도를 함유하는 (박터 0.5ml의 용융 LB 탑 아가의 4.5 ml의 적용 )과는 접시에 걸쳐 균등하게 할 수 있습니다. </li><li> 반전 및 / N을 판 O를 품어. 줄무늬 플라크를 반복순수한 파지 종을 보장하기 위해 적어도 세 번 반복에 대한 기술은 격리됩니다. 파지 생존 능력의 상당한 손실없이 줄무늬 사이에 필요한 주까지로 4 ° C에서 보관 판. </li><li> 일단 원하는 플라크가 최종 줄무늬 접시에 성장 고립 된, 마이크로 피펫 팁 하나 잘 격리 된 플라크를 터치하고 100 μL의 PB에 다시 일시 중지합니다. 직렬 신선한 PB 180 μL로 샘플의 20 μl를 전달하여 10-8 희석이 10 0 솔루션을 희석. </li><li> 파지를 분리하는데 사용 염화칼슘 (2)의 동일한 농도를 함유 용융 LB 상부 한천 4.5 ml로 감염된 세균을 혼합하여 실온에서 10 분 플레이트 5 배양 관에서 성장 박터 0.5ml를 각 희석액 10 μl를 추가 원래의 토양 샘플에서. 다음 날까지 4 ° C에서 만든 모든 희석을 저장합니다. </li><li> 전통적인 플라크 역가 등을 사용하여 웹 패턴을 확인하는 데 필요한 시리얼 희석 된 파지를 결정말한다. 플라크 역가 분석의 목적은 웹 형판을 얻기 위해 필요한 파지 역가를 결정하는 것이다. 등 대부분의 세균없는 아직 파지에 의해 용해되지 않은 세균의 잔해를 포함하는 웹 패턴 플레이트를 확인합니다. 멸균 50 ㎖ 문화 플라스크에 후반 초반 / 지수 고정 박터 문화의 5 ML을 추가합니다. <ol><li> 문화 플라스크에 희석 (즉 박터 문화에 웹 패턴을 준)의 100 μl를 추가하고 파지는 실온에서 5 ~ 10 분 동안 박테리아 세포를 감염 할 수 있습니다. 처음 파지를 식별하고 10 신선한 LB 플레이트 상에 그 혼합물을 5 mL를 플레이트에 사용 된 염화칼슘 (2)의 동일한 농도를 함유 용융 LB 한천 위쪽으로 섞는다. 응고 및 30 ° C에서 거꾸로 판을 배양 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 다음 날, 4 ° C에서 PB 및 저장 O / N 5 ㎖ 또는 실온에서 4 시간으로 웹 패턴 판을 홍수. </li><li> 0.22 μm의 주사기 필터로 파지 해물 필터4 ℃에서 저장한다. 이러한 파아지 입자의 전자 현미경 화상, 표준 절차를 이용하여 DNA를 제한 효소 분석 및 게놈 시퀀싱 파지 게놈 DNA 분리와 같은 추가적인 실험의 마지막 파지 스톡을 사용. 파지 주식의 장기 저장을 위해, -80 ° C에서 재고 보관을위한 작은 튜브에 멸균 글리세롤로 파지 해물의 동일한 금액을 추가합니다. 참고 :이 파지 기술과 경험하지 않은 사람들을 위해, 훌륭한 자원은 온라인으로 액세스 할 수 www.phagesdb.org 웹 사이트입니다. </li></ol>

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	<li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Catabolic+Pathways:+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism.">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li><li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil.">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. 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저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

많은 이전의 시도는 호스트 박터 감염시킬 파아지를 분리에도 불구하고, 우리는 표준 농축 과정을 사용하여 약간의 성공을 거두었 다. 개발 환경 시료로부터 파지를 풍부하게하고 반 Twest Kropinski (10)에 의해 구성된 박테리아의 농축 방법은 일반화 농축 과정의 대부분 기초 남아있다. 이전의 연구에서 증거가 직접 도금의 방법은 분리 (5)의 매우 낮은 성공률에도 불구하고 <em...

토양 환경에서 박터 종의 편재는 호스트 박테리아의이 종으로부터 격리 될 수있는 파지의 광대 한 수와 다양성을 제공합니다. Acintobacteriaceae 가족의 세균 회원 아트라진 및 기타 다양한 살충제와 제초제 1,2,3 등의 난 분해성 화합물을 분해 자신의 이화 작용 경로에 가장 주목할 만하다. 대부분의 연구가 박터의 환경 균주를 사용하여 수행 하였지만,이 속에의 임상 분리는 혈액, 소변, 눈, 모든 계통 발생 학적 이질성 (4)를 표시하는 많은 다른 사람의 소스에서 발견된다. 박터 세균에 대한 연구의 다소 광범위한 몸이 있지만, 단지 소수의 연구는 이러한 다양한 속의 구성원을 감염시킬 파아지에보고한다. 흥미롭게도하지만, 박터에 이전 할 작품은 &lt;토양의 입력으로 몇 가지 주요 별개의 주제에 대한 접촉을 파지EM&gt; 박터 종 활성 오니 처리 설비 (6)에 해로운 거품 감소 및 작업 부위 특이 적 재조합 인테그라 7 유전자를 강조 할 목적으로 5 공업용. 다양한 농축 기술 프로토콜 순수한 파지 박터 종에서 분리 생성하는데 이용되어왔다. 초기 절차는 감염 A. 할 수있는 파지 8 일년 이상주는 상승의 기간 동안 니코틴 염과 같은 추가 독성 제와 토양의 배양을 포함 globiformis. 불안정한 유기물 플라크 분석 기술을 통해 검출 된 파지를 생산하기 위해 등장과 함께 흙을 사용하여 수행 할 연구는 긴 잠복기 (8)을 생략하고, 여과 된. 흥미롭게도하지만, 직접 도금을 닮은 기술은 낮은 성공률과 과거의 연구를 인용, 여전히 연구자 (5)에 의해 현저하게 낮은 성공률을하면서 여러 파지에 이르게 된 과거에 사용되었다 <s&gt; 8입니다. 전반적으로, 과거에 사용 된 분리 기술은 가장 일반적인 호기성 토양을 나타내는 박터 속에도 불구하고 실제로는 약간의 효과를 갖는 떠들썩했었다 자연 4,9에서 분리, 물과 토양에서 파지를 분리하는 반 Twest 및 Kropinski 10 현재 농축 방법 환경 박테리아 균주 만이 우라늄 농축 기술을 풍부하게하는 데 사용 이전 기술에서 적응은 박터 파지를 분리 비효율적 증명했다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 이른 농축 방법은 일관되고 효과적으로 박테리아 속에서 파지를 단리와 연관된 이전의 기술적 과제를 극복 박터 파아지를 분리하도록 채택 될 수 있음 &quot;개념 증명&quot;보여주기위한 것이다.

<table><tbody><tr><td>LB Broth powder</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>It&#039;s best to order these in bulk.</td></tr><tr><td>Granulated Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>It&#039;s best to order these in bulk.</td></tr><tr><td>0.22 um syringe filters</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um buchner filters</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>5 ml pipets individual</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipets individual</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipets individual</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Whatman qualitative filter paper</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized enrichment technique for the isolation of arthrobacter bacteriophage species from soil sample isolates

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of phages infecting Arthrobacter hosts has been limited, perhaps due to the low success rate of many previous isolation techniques, resulting in an underrepresented group of Arthrobacter phages available for study. The enrichment technique described here, unlike many others, uses a filtered extract free of contaminating bacteria as the base for indicator bacteria growth, Arthrobactersp. KY3901, specifically. By first removing soil bacteria the target phages are not hindered by competition with native soil bacteria present in initial soil samples. This enrichment method has resulted in dozens of unique phages from several different soil types and even produced different types of phages from the same enriched soil sample isolate. The use of this procedure can be expanded to most nutrient rich aerobic media for the isolation of phages in a vast diversity of interesting host bacteria.

박터 파지에 대한 개선 농축 기술의 재현성을 입증하기 위해, 30 개 토양 샘플은 고유 박터 파지이 우라늄 농축을 사용하여 수집 한 토양 샘플의 22에서 얻었다이 30 토양 샘플의 2014 년 봄과 여름 동안 서로 다른 시간과 장소에서 사용되었다 절차. 표준 농축 과정은 동일한 토양 시료로부터 3 고유 파지를 수득 하였다. 농축 샘플 플라크 또는 플라크의 성공적인 검출 용 풍부 박터의<...

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An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

We present an enrichment protocol for the isolation of bacteriophages infecting bacteria in the Arthrobacter genus. This enrichment protocol produces fast and reproducible results for the isolation and amplification of Arthrobacter phages from soil isolates.

의 분리를위한 최적화 된 농축 기법<em&gt; 박터</em&gt; 박테리오파지 생물 종 토양 샘플에서 격리 된 것

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

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An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

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Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

연구

면역학 및 감염병학

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of Massachusetts (USA). Since then MTB have been discovered in stratified water- and sediment-columns from all over the world2. One feature common to all MTB is that they contain magnetosomes, which are intracellular, membrane-bound magnetic nanocrystals of magnetite (Fe3O4) and/or greigite (Fe3S4) or both3, 4. In the Northern hemisphere, MTB are typically attracted to the south end of a bar magnet, while in the Southern hemisphere they are usually attracted to the north end of a magnet3,5. This property can be exploited when trying to isolate MTB from environmental samples.
One of the most common ways to enrich MTB is to use a clear plastic container to collect sediment and water from a natural source, such as a freshwater pond. In the Northern hemisphere, the south end of a bar magnet is placed against the outside of the container just above the sediment at the sediment-water interface. After some time, the bacteria can be removed from the inside of the container near the magnet with a pipette and then enriched further by using a capillary racetrack6 and a magnet. Once enriched, the bacteria can be placed on a microscope slide using a hanging drop method and observed in a light microscope or deposited onto a copper grid and observed using transmission electron microscopy (TEM).
Using this method, isolated MTB may be studied microscopically to determine characteristics such as swimming behavior, type and number of flagella, cell morphology of the cells, shape of the magnetic crystals, number of magnetosomes, number of magnetosome chains in each cell, composition of the nanomineral crystals, and presence of intracellular vacuoles.

We demonstrate a method to collect magnetotactic bacteria (MTB) that can be applied to natural waters. MTB can be isolated and enriched from sediment samples using a relatively simple setup that takes advantage of the bacteria's natural magnetism. Isolated MTB can then be examined in detail using both light and electron microscopy.

당연히 환경에서 Magnetotactic 박테리아를 발생의 수집, 절연 및 강화

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

생물학

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This process has notably lower efficiencies in the Lyme disease spirochete relative to other, better-characterized Gram-negative bacteria. The rate of success of transformation is highly dependent upon having concentrated amounts of high-quality DNA from specific backgrounds and is subject to significant strain-to-strain variability. Alternative means for introducing foreign DNA (i.e., shuttle vectors, fluorescent reporters, and antibiotic-resistance markers) into B. burgdorferi could be an important addition to the armamentarium of useful tools for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. Bacteriophage have been well-recognized as natural mechanisms for the movement of DNA among bacteria in a process called transduction. In this study, a method has been developed for using the ubiquitous borrelial phage &#966;BB-1 to transduce DNA between B. burgdorferi cells of both the same and different genetic backgrounds. The transduced DNA includes both borrelial DNA and heterologous DNA in the form of small shuttle vectors. This demonstration suggests a potential use of phage-mediated transduction as a complement to electroporation for the genetic manipulation of the Lyme disease spirochete. This report describes methods for the induction and purification of phage &#966;BB-1 from B. burgdorferi, the use of this phage in transduction assays, and the selection and screening of potential transductants.

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

The ability of bacteriophage to move DNA between bacterial cells makes them effective tools for the genetic manipulation of their bacterial hosts. Presented here is a methodology for inducing, recovering, and using &#966;BB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi, to transduce heterologous DNA between different strains of the Lyme disease spirochete.

라임병 스피로체테 보렐리아 부르그도르페리의 파지 매개 유전자 조작

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular fungi such as molds and unicellular fungi, broadly defined as yeasts, fulfill essential roles in soil ecosystems as decomposers of organic material and as food sources for other soil dwellers. Fungal species diversity in soil is dependent on a multitude of climatic factors such as rainfall and temperature, as well as soil properties including organic matter, pH, and moisture. Lack of adequate environmental sampling, especially in regions of Asia, Africa, South America, and Central America, hinders the characterization of soil fungal communities and the discovery of novel species. 
We characterized soil fungal communities in nine countries across six continents using ~4,000 soil samples and a protocol developed in the laboratory for the isolation of yeasts and molds. This protocol begins with separate selective enrichment for yeasts and the medically relevant mold Aspergillus fumigatus, in liquid media while inhibiting bacterial growth. Resulting colonies are then transferred to solid media and further processed to obtain pure cultures, followed by downstream genetic characterization. Yeast species identity is established via sequencing of their internal transcribed spacer (ITS) region of the nuclear ribosomal RNA gene cluster, while global population structure of A. fumigatus is explored via microsatellite marker analysis. 
The protocol was successfully applied to isolate and characterize soil yeast and A. fumigatus populations in Cameroon, Canada, China, Costa Rica, Iceland, Peru, New Zealand, and Saudi Arabia. These findings revealed much-needed insights on global patterns in soil yeast diversity, as well as global population structure and antifungal resistance profiles of A. fumigatus. This paper presents the method of isolating both yeasts and A. fumigatus from international soil samples.

This protocol is an effective, speedy method of culturing yeasts and the mold Aspergillus fumigatus from large sets of soil samples in as little as 7 days. The methods can be easily modified to accommodate a range of incubation media and temperatures as needed for experiments.

곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

low-MW DNA를 농축하여 환경 AMR을 평가하기 위한 효율적인 기법

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has emerged as the source of choice to sample pathogen burdens in the environment. Wastewater from open drains and community water treatment plants is a reservoir of both pathogens and antimicrobial resistance (AMR) genes, and frequently comes in contact with humans. While there are many methods of tracking AMR from water,&#160;isolating good-quality DNA at high yields from heterogeneous samples remains a challenge. To compensate, sample volumes often need to be high, creating practical constraints. Additionally, environmental DNA is frequently fragmented, and the sources of AMR (plasmids, phages, linear DNA) consist of low-molecular-weight DNA. Yet, few extraction processes have focused on methods for high-yield extraction of linear and low-molecular-weight DNA. Here, a simple method for high-yield linear DNA extraction from small volumes of wastewater using the precipitation properties of polyethylene glycol (PEG) is reported. This study makes a case for increasing overall DNA yields from water samples collected for metagenomic analyses by enriching the proportion of linear DNA. In addition, enhancing low-molecular-weight DNA overcomes the current problem of under-sampling environmental AMR due to a focus on high-molecular-weight and intracellular DNA. This method is expected to be particularly useful when extracellular DNA exists but at low concentrations, such as with effluents from treatment plants. It should also enhance the environmental sampling of AMR gene fragments that spread through horizontal gene transfer.

저자 스포트라이트: 배양 기반 기법과 유전체학을 결합하여 환경적 항생제 내성의 이해 및 검출

Here, we present a simple technique to assess environmental antimicrobial resistance (AMR) by enhancing the proportion of low-molecular-weight extracellular DNA. Prior treatment with 20%-30% PEG and 1.2 M NaCl allows detection of both genomic and horizontally transferred AMR genes. The protocol lends itself to a kit-free process with additional optimization.

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화 

Environmental surveillance is recognized as an important tool for assessing public health in the post-pandemic era. Water, in particular wastewater, has ...

의 분리를위한 최적화 된 농축 기법

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파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

소프트 한천 오버레이 기법의 사용은 세균 생산 억제 화합물에 대한 화면으로

당연히 환경에서 Magnetotactic 박테리아를 발생의 수집, 절연 및 강화

라임병 스피로체테 보렐리아 부르그도르페리의 파지 매개 유전자 조작

위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜

곰팡이 개체군 구조를 조사하기 위해 토양에서 배양 가능한 효모와 곰팡이를 분리합니다.

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화